《對具有促生抑病功能的真菌快速篩選方法的初步研究【4200字】》

對具有促生抑病功能的真菌快速篩選方法的初步研究目錄TOC\o"1-2"\h\u18730對具有促生抑病功能的真菌快速篩選方法的初步研究 174681引言 160042對不同促生抑病功能真菌的快速篩選研究 120842.1拮抗病原菌的篩選 141442.2芽孢桿菌的篩選 2162922.3地衣真菌的篩選 263152.4西瓜枯萎病生防細(xì)菌YZU-S8的篩選 2237742.5草莓拮抗真菌的篩選 3210203總結(jié) 424012參考文獻(xiàn) 4摘要：農(nóng)作物出現(xiàn)病變會在很大程度上引起產(chǎn)量降低問題，現(xiàn)階段的農(nóng)業(yè)種植過程中農(nóng)民仍然對莊稼施加農(nóng)藥化肥來實現(xiàn)控制病變的目的，提高農(nóng)作物產(chǎn)量。然而，農(nóng)藥會給植株和環(huán)境帶來污染問題，使植株產(chǎn)生抗藥性，甚至影響其他作物生長。因此，本文將以防病增產(chǎn)多功能微生物產(chǎn)品為最終目標(biāo)，本著對具有促生抑病功能的真菌快速篩選方法的初步研究加以分析研究，通過搜集學(xué)術(shù)期刊的相關(guān)參考文獻(xiàn)對其加以論述分析，旨在一套較為快捷的篩選方法，更好的改善植物病害的生物防治措施，從而對生物工程的相關(guān)研究進展提供一定的參考與借鑒。關(guān)鍵詞：促生抑病，真菌，快速篩選，研究現(xiàn)狀1引言植物賴以生長的土地環(huán)境和植株自身都能提取加工得到抑制病變的細(xì)菌，這些細(xì)菌能夠有效的防治農(nóng)作物等植物繼續(xù)受到病變蠶食?？紤]到植物根系細(xì)菌群落的組成和多樣性受多種因素的影響，如根系密度、分泌物等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，類似芽孢桿菌這樣的細(xì)菌在防病的穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性等方面，都表現(xiàn)出非芽孢細(xì)菌所沒有的優(yōu)勢。因此，生物防治細(xì)菌的篩選對農(nóng)業(yè)生物防治極其重要。而前文提及的如根系密度、分泌物等因素，又受到植物根內(nèi)生細(xì)菌群落的組成和多樣性受的影響。因此相關(guān)學(xué)者在研究結(jié)果中表明不同作物根內(nèi)生細(xì)菌群落組成不同，從正常植株根內(nèi)分離的大部分細(xì)菌具有根內(nèi)生長和根際生長的兩個特征。在綜合疾病管理框架內(nèi)，使用具有生物控制活性的根內(nèi)生菌對土壤傳播的植物病害具有環(huán)境友好和生態(tài)高效的作用。此外，考慮到部分細(xì)菌由于具有促生和生防功能，并可增強寄主植物抗逆境等生物學(xué)特性，所以植物內(nèi)生細(xì)菌的研究具有一定的價值。據(jù)此，本文將對植物的真菌快速篩選方法進行初步的研究。2對不同促生抑病功能真菌的快速篩選研究2.1拮抗病原菌的篩選有文獻(xiàn)從168株植物體內(nèi)分離篩選的對黃瓜枯萎或番茄青桔病菌有抑制能力的細(xì)菌中得到能夠有效滅活辣椒疫病菌的菌體19株，用三明治法對其加以研究發(fā)現(xiàn)，這19株菌體能夠?qū)崿F(xiàn)38%-95%的病變抑制，效果最明顯的是一種叫做TB2的菌種，抑菌率95%，其他菌體的抑菌效果遠(yuǎn)不如TB2。研究人員同時利用這19種菌體對黃瓜枯萎病菌展開實驗，發(fā)現(xiàn)其拮抗作用也非常明顯，約45%-86%。將這兩組實驗數(shù)據(jù)進行對比分析發(fā)現(xiàn)，能夠抑制黃瓜枯萎病菌的生防菌大多能夠很好的控制辣椒疫病菌。除上述發(fā)現(xiàn)以外，實驗還從另一方面表明，生防菌的普遍拮抗作用說明植物體內(nèi)自身存在的菌種對防治植物病變存在顯著作用。該篩選方法獲得的內(nèi)生拮抗菌，從試驗結(jié)果看其防病效果與內(nèi)生性具有一定的相關(guān)，其中防病效果最佳的菌株，在植物體內(nèi)的內(nèi)生定殖能力也最強，但是，這種在植物體內(nèi)生存的細(xì)菌能否穩(wěn)定存在于外界環(huán)境，以及生防菌是通過何種作用原理實現(xiàn)病變抑制等問題，依舊是目前學(xué)術(shù)上研究的重要課題。2.2芽孢桿菌的篩選對于植物病害生防芽孢桿菌的的實驗研究已經(jīng)相對成熟，并在植物生長過程中得到了一定程度的應(yīng)用，但也存在一定的局限性。比如說，能夠?qū)崿F(xiàn)抑制作用的菌體品種少，抑制作用不甚穩(wěn)定等。國際上主要致力于PGPR類制劑的研究，一般適用于生物防治。而且，研究人員的研究方向并沒有針對芽孢桿菌深入展開，而是偏向于單一功能生物因子或同一功能的不同生物因子的功能菌群J。特別需要注意的是，基本沒有對多功能芽孢菌株篩選或功能芽孢菌株的復(fù)配組合的實驗探究。綜合考慮上述原因，有研究以芽孢桿菌的抑病、促生、活化養(yǎng)分及改善微生物區(qū)系四個角度為入手點，通過皿內(nèi)拮抗試驗、盆栽促生試驗及土壤養(yǎng)分和微生物類群的測定，發(fā)現(xiàn)7株具有多重功效的復(fù)合芽孢桿菌，并得到功能組合B04-B06-B07和B01-B04-B07，使微生物菌群在組成和功能上逐漸由單一走向多元化成為可能，為復(fù)合生物肥料的研發(fā)和生產(chǎn)提供了理論指導(dǎo)，對生物農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展具有重大意義。2.3地衣真菌的篩選首先，是降解纖維素、溶解無機磷真菌的初篩以點接的方式將120株地衣真菌菌株分別接種到剛果紅培養(yǎng)基和PKO培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4d，觀察結(jié)果。根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）大小初步確定該菌株降解纖維素能力和溶磷能力的強弱，篩選出比值較大的菌株作為后期復(fù)篩的菌株。其次，是降解纖維素、溶解無機磷真菌的復(fù)篩繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，以DNS法測定還原糖含量。以吸光度值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用已配置好的磷標(biāo)準(zhǔn)液，測定吸光值繪制磷標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，具體操作參見文獻(xiàn)。功能活性的測定：菌株液體培養(yǎng)發(fā)酵得到粗酶液。采用濾紙酶活測定法，測定降解纖維素真菌的濾紙酶活力；采用鉬銻抗比色法測定溶磷真菌的酶活力；用紫外可見分光光度計測定吸光值，由吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)的葡萄糖和磷含量，根據(jù)公式計算出酶活力。然后，是進行抗病原菌真菌的篩選采用平板對峙法測定抑菌活性。將前期初篩獲得的溶解無機磷、降解纖維素的地衣真菌發(fā)酵液采用打孔法接在PDA平板中央，四周接上少量供試病原菌尖孢鐮刀菌、花生莖點霉、蘋果輪紋菌。設(shè)置空白對照，每個真菌做3個重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)3-4d，觀察病原菌生長狀況。最后，是確定最佳組合挑選高效降解纖維素菌株、溶磷菌株、抑菌菌株，結(jié)合菌株生長曲線確定菌種比例，進行濾紙崩解實驗，篩選最佳降解纖維素組合，采用鉬銻抗比色法篩選最佳溶磷組合。2.4西瓜枯萎病生防細(xì)菌YZU-S8的篩選首先，是采用平板對峙法對西瓜枯萎病拮抗菌株進行初篩，然后再對西瓜枯萎病拮抗菌株進行復(fù)篩，具體步驟是將初篩的菌株分別接種于NB中，于28℃，130r/min的搖床上培養(yǎng)48h。在PDA平板中央接種培養(yǎng)72h的西瓜枯萎病菌菌餅(直徑6mm)，用無菌的打孔器在距離中央2cm處三點對稱打孔，每孔中分別注人100μL待測菌株的菌液，以接種等體積的NB為對照，每個處理3次重復(fù)，平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照平板中西瓜枯萎病菌菌絲即將長滿全皿時，測量各處理組的抑菌帶大小。最后，對菌株YZU-S8抑菌譜進行測定，該方法是通過制備YZU-S8的無菌濾液，將無菌濾液混人冷卻至55℃左右的PDA中，使其終濃度分別為5%，10%和20%，倒成平板。以混人相同體積的NB為對照。在PDA平板中央接入待測病原菌菌餅，28℃倒置培養(yǎng)。每處理4次重復(fù)。待對照組菌絲幾乎長滿培養(yǎng)皿時，測量各組的菌落直徑，計算相對抑制率。整體而言，該方法是從油菜根和根際分離篩選出一株對西瓜枯萎病菌具有顯著抑制活性的內(nèi)生菌株YZU-S8，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽抱桿菌。YZU-S8的無菌濾液對病原真菌表現(xiàn)出了廣譜的抑制作用，表明其可產(chǎn)生具有抑菌效果的活性代謝產(chǎn)物。然而，該菌株能合成的抑菌物質(zhì)的成分尚不明確，需要進一步研究。2.5草莓拮抗真菌的篩選將溫室草暮苗挖出，用小鏟抖去根系周圍的附著土壤，裝入無菌自封袋內(nèi)帶回實驗室。在自封袋外用手輕揉根系使其表而附著較緊密的土壤落入袋內(nèi)作為根區(qū)待測土壤，稱取此土樣10.00g加入裝有玻璃珠的90mL無菌水二角瓶內(nèi)，常溫卜160r/min震蕩20min混勻，制得根區(qū)土壤懸液；再將自封袋內(nèi)根系取出，稱重后放入裝有玻璃珠的100mL無菌水瓶中，常溫卜160r/min震蕩20min，將根系表而土壤洗入無菌水中，制得根表土壤懸液；最后將根取出，用吸水紙吸干根系表而游離水分，稱取0.50g須根樣品，在70%酒精溶液中浸泡20s，再放入1g/L升汞處理30s殺死須根表而微生物，用無菌水沖洗5次去除殘余升汞，用無菌濾紙吸干表而水分置于無菌研缽內(nèi)，加5mL無菌水研磨勻漿，即為根系待測樣品。用稀釋平IIII一涂抹分離法對供試樣品中的真菌進行分離，分離培養(yǎng)基為PDA。通過形態(tài)特征對分離菌初步鑒定并計數(shù)，計算不同種類真菌占分離真菌總數(shù)的比例。通過草莓根腐病株與健株的真菌區(qū)系比較，找出健株特有且在數(shù)量上占優(yōu)勢，而病株根區(qū)、根表土壤中不存在或數(shù)量很少的真菌。在同一生態(tài)條件下，草莓根腐病是否發(fā)生與草莓根區(qū)、根表土壤中的真菌區(qū)系及優(yōu)勢真菌有密切關(guān)系，故健株根區(qū)土壤中特有真菌在理論上具有抗病性。整體而言，該方法是通過對草莓田間生態(tài)現(xiàn)象進行的詳細(xì)觀察，通過草莓健株、病株根域土壤微生物區(qū)系比較分析，尋找到健株根區(qū)特有而病株根區(qū)不存在或數(shù)量很少，能保持健株不發(fā)病的優(yōu)勢真菌，并通過進一步研究證明了健株根區(qū)、根表土壤的2株優(yōu)勢真菌的抗病及促生活性。故而，該思路是基于土壤微生態(tài)基本原理，通過病健株微生物區(qū)系的比較分析，鎖定健株中不同于病株的幾種優(yōu)勢真菌，與傳統(tǒng)的以病田健株根域的大量微生物為篩選對象的“海選”策略相比，工作量大幅度減少，篩選效率大幅提高。其次，用此篩選程序獲得的生防菌來自健株根域土壤，該菌株的實際防效已獲得了田間生態(tài)條件適宜性檢驗，在生產(chǎn)上的生防效果會優(yōu)于其它方法篩選所得菌株，克服了其它方法獲得的入選菌株室內(nèi)效果好，而田間防效較差的問題，減少了用其它篩選策略獲得的菌株進行大田適應(yīng)性研究耗費的時間，是一條效率相對較高的篩選途徑。通過本次綜述可知，該研究為草莓根腐病拮抗真菌的快速分離篩選及分離源采集提供了理性化的新思路，也為生防細(xì)菌及放線菌的篩選思路設(shè)計提供了重要參考。3總結(jié)一般而言，微生物間共同聯(lián)系產(chǎn)生的效果得源于其具備產(chǎn)生抗體的能力。為了可以提升對具有促生抑病功能的真菌進行快速的篩選，一直都是當(dāng)下不少研究人員論述與探討的重要話題之一。而本次在基于相關(guān)參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對部分具有促生抑病功能的真菌進行了快速篩選的方法論述，以期可以為我國農(nóng)業(yè)在今后的發(fā)展過程中，起到效率高，操作簡單，結(jié)果可靠的目的，從而促進微生物篩選抗真菌資源的工作效率，并為當(dāng)下致力于簡化已有相關(guān)測定技術(shù)提供一定的參考與借鑒。參考文獻(xiàn)[1]韓如月,李睿瑞,楊帆,等.一株水稻根內(nèi)生拮抗細(xì)菌SM13的分離及鑒定[J].微生物學(xué)通報,2019,46(005):1030-1040.[2]鄭通文、蔡民政、劉璐、孫正祥、周燚.西瓜枯萎病生防細(xì)菌YZU-S8的篩選及其防病促生作用的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2020,v.42;No.224(06):36-43.[3]徐萌.野大豆內(nèi)生真菌YD-25的篩選鑒定及促生,抗重金屬活性研究[D].沈陽師范大學(xué),2019.[4]韓如月.水稻根內(nèi)促生拮抗細(xì)菌的篩選及其性能評價[D].2019.[5]張翠綿,賈楠,馬佳,等.番茄根際多功能益生芽孢桿菌的篩