【大學(xué)課件】常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用第二十章第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridiz核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza復(fù)性RNADNA復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到N用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(Southern其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)其他：三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③放射自顯影照片放射自顯影照片DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理555555555Primer15Primer2Cycle2CycCycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。Cycle35555555555PCR技術(shù)原理示意圖PCR技術(shù)原理示意圖PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分模板DNAPCR體系基本組成成分利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionP原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探針法2.分子信標(biāo)探針法3.FRET探針法實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探圖20-3TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖圖20-3TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖第三節(jié)基因文庫GeneLibrary第三節(jié)基因文庫基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRN第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique第四節(jié)生物芯片技術(shù)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)?shù)谖骞?jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交常用蛋白質(zhì)相互作用的研究標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobi放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針10X凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprec染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用第二十章第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridiz核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza復(fù)性RNADNA復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到N用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(Southern其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)其他：三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③放射自顯影照片放射自顯影照片DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理555555555Primer15Primer2Cycle2CycCycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。Cycle35555555555PCR技術(shù)原理示意圖PCR技術(shù)原理示意圖PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分模板DNAPCR體系基本組成成分利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionP原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探針法2.分子信標(biāo)探針法3.FRET探針法實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探圖20-3TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖圖20-3TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖第三節(jié)基因文庫GeneLibrary第三節(jié)基因文庫基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRN第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique第四節(jié)生物芯片技術(shù)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)?shù)谖骞?jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、