分子克隆常用工具酶-課件

第二章分子克隆常用工具酶

Tel:87286939Office:園林樓620第二章分子克隆常用工具酶1

每一單鏈具有5’-3’極性兩條單鏈間以氫鍵連接兩條單鏈，極性相反，反向平行以中心為軸，向右盤旋StructureandfeaturesDNA的基本結(jié)構(gòu)2每一單鏈具有5’-3’極性Structureand33Replication4Replication4分子克隆操作過(guò)程：

克隆目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成重組DNA→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。5分子克隆操作過(guò)程：5工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。要把不同基因的DNA線形分子片段準(zhǔn)確地切出來(lái)，需要各種限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段連接起來(lái)，需要DNA連接酶（ligase）；要合成基因或其中的一個(gè)片段，需要DNA聚合酶（polymerase）等。因此，酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具。6工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶甲基化酶7核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DN限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶用于核酸操作的常用工具酶8限制性核酸內(nèi)切酶用于核酸操作的常用工具酶8大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)9大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)9常用的工具酶性質(zhì)及功能10常用的工具酶性質(zhì)及功能10第一節(jié)分子克隆最常用兩個(gè)工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸內(nèi)切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開(kāi)。如EcoRI,HpaI“分子膠”⒉DNA連接酶——促使具有互補(bǔ)粘性末端或平頭末端的載體和供體DNA片段連接，形成重組DNA分子。11第一節(jié)分子克隆最常用兩個(gè)工具酶“分子⒈限制性核酸限制性內(nèi)切酶

Restrictionenzymes“分子剪刀”

⒈限制性核酸內(nèi)切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開(kāi)。如EcoRI,HpaI12限制性內(nèi)切酶Restrictionenzymes“分限制性內(nèi)切酶是一種能識(shí)別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點(diǎn)上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內(nèi)切核酸酶。13限制性內(nèi)切酶是一種能識(shí)別DNA上特定堿基一、限制性核酸內(nèi)切酶的分類14一、限制性核酸內(nèi)切酶的分類14二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則

名屬種株序菌株來(lái)源稱名名名號(hào)EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliR

HindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaed

HindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaed

HpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzaea

HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分離到的第3個(gè)限制酶。15二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則名

一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適pH為6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用 對(duì)熱不穩(wěn)定，通常貯存于–20℃環(huán)境。為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時(shí)添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中甘油的濃度。三、限制性核酸內(nèi)切酶學(xué)特性16一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適pH為每一種酶都有各自特異識(shí)別位點(diǎn)它對(duì)底物要求有特異的序列，通常的識(shí)別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp。多數(shù)限制酶的識(shí)別序列為回文結(jié)構(gòu)，在識(shí)別序列內(nèi)或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵。17每一種酶都有各自特異識(shí)別位點(diǎn)它對(duì)底物要求有特異的18181919不同限制性內(nèi)切酶切割的三種結(jié)果20不同限制性內(nèi)切酶切割的三種結(jié)果20212122225`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ同尾酶235`---GGATCC---3`5`---G2424①溫度：一般37℃ ②鹽離子濃度：Na＋，Mg2＋ ③緩沖體系：具有穩(wěn)定pH環(huán)境的Tris-HCl緩沖體系DTT用于保持酶

穩(wěn)定性和活性 ④反應(yīng)體積和甘油濃度：商品化的限制性內(nèi)切核酸酶均加50％甘油作為保護(hù)劑，一般在-20℃保存。酶切反應(yīng)時(shí)，加酶的體積一般不超過(guò)總反應(yīng)的10％，否則甘油濃度過(guò)高，影響酶切反應(yīng)⑤反應(yīng)時(shí)間：通常為1h；進(jìn)行大量DNA酶切反應(yīng)時(shí)一般讓酶解過(guò)夜⑥D(zhuǎn)NA純度和結(jié)構(gòu)DNA樣品中所含的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑、RNA等雜質(zhì)會(huì)影響酶切反應(yīng)的速度和完全程度酶切的底物一般為雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會(huì)影響酶切反應(yīng)。四、影響酶切反應(yīng)的條件*25①溫度：一般37℃四、影響酶切反應(yīng)的條件*25II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)體系26II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)體系26“星”活性Staractivity

“星”活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端ppH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性所謂的現(xiàn)象。

在名稱右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示,如EcoRⅠ*：AATT；EcoRⅠ：GAATTC必須采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟,應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。 27“星”活性Staractivity“星”活性：位點(diǎn)偏愛(ài)（sitepreference）某些限制性內(nèi)切酶對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。28位點(diǎn)偏愛(ài)（sitepreference）28第二節(jié)DNA連接酶DNALigase29第二節(jié)DNA連接酶DNALigase29定義：催化DNA上裂口兩側(cè)(相鄰)核苷酸裸露的3＇羥基和5＇磷酸之間形成共價(jià)結(jié)合的磷酸二酯鍵，使斷開(kāi)的DNA裂口連接起來(lái)功能：具有修復(fù)單鏈或雙鏈的能力,在DNA重組、復(fù)制和損傷后的修復(fù)中都起關(guān)鍵作用。一、DNA連接酶性質(zhì)30定義：催化DNA上裂口兩側(cè)(相鄰)核苷酸裸露的3＇羥基和5＇3131兩種DNA連接酶比較二、常用連接酶32兩種DNA連接酶比較二、常用連接酶32連接反應(yīng)的溫度是影響轉(zhuǎn)化效率的最重要參數(shù)。多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持連接酶活性的最佳反應(yīng)溫度卻是37℃ 但在該溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷，所以連接反應(yīng)一般采用16℃過(guò)夜。三、DNA連接酶的反應(yīng)條件33連接反應(yīng)的溫度是影響轉(zhuǎn)化效率的最重要參數(shù)。多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍由于平末端的連接效率比粘性末端要低得多，故在平末端連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要求較高。防止環(huán)化：堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體時(shí)間：過(guò)夜最好34DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍341）粘性末端DNA片段的連接351）粘性末端DNA片段的連接35直接用T4DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。同聚物加尾連接平末端DNA片段：先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA連接酶進(jìn)行連接用銜接物連接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上構(gòu)建限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后產(chǎn)生特異的粘性末端，從而與具有互補(bǔ)末端的DNA連接2)平末端DNA片段的連接36直接用T4DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。2)平末端應(yīng)用互補(bǔ)同聚物加尾法連接DNA片段37應(yīng)用互補(bǔ)同聚物加尾法連接DNA片段37用銜接物分子連接平末端的DNA片段銜接物：指用化學(xué)方法合成的一段由若干個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段38用銜接物分子連接平末端的DNA片段銜接物：指用化學(xué)方法合成的四、重組DNA實(shí)驗(yàn)的一般程序選用一種對(duì)載體DNA只具唯一限制識(shí)別位點(diǎn)的限制酶（如EcoRI）作位點(diǎn)特異的切割，形成全長(zhǎng)的具粘性末端的線性DNA分子再將外源DNA片段也用同一種酶作相同的消化。混合，加入DNA連接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成雙鏈結(jié)合體。其中單鏈缺口經(jīng)DNA連接酶封閉之后，便產(chǎn)生穩(wěn)定的雜種DNA分子。39四、重組DNA實(shí)驗(yàn)的一般程序選用一種對(duì)載體DNA只具唯一限制第二節(jié)其他分子克隆工具酶40第二節(jié)其他分子克隆工具酶40一、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶41一、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I依賴于DNA的DN用途：DNA缺口平移中標(biāo)記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶I

以一條DNA為模板通過(guò)聚合作用把脫氧核苷酸加到雙鏈DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA.42用途：DNA缺口平移中標(biāo)記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶基本用途43基本用途43

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)

大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。44大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragm45454646有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3’-OH端外切

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)47有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性基本用途48基本用途484949TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶，最適溫度75℃-80℃需要Mg2+(10mmol／L)，在低濃度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一價(jià)陽(yáng)離子高至0.1moI／L對(duì)活性無(wú)影響，而最適濃度NaCl為40mmol/L，KCl為60mmol/L最適pH7.8(Tris-HCl)，與大腸桿菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高溫和無(wú)核酸酶活性TaqDNA聚合酶50TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaqua催化RNA體外合成反應(yīng)依賴DNA的RNA聚合酶不依賴DNA的RNA聚合酶

RNA聚合酶51催化RNA體外合成反應(yīng)RNA聚合酶51反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

反轉(zhuǎn)錄酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈,同時(shí)又具有3′

→5′和5′

→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。主要用途：轉(zhuǎn)錄mRNA成為cDNA制備基因片段52反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptas雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈53雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈53DNA和RNA的修飾酶核酸酶SI堿性磷酸酶磷酸激酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶甲基化酶54DNA和RNA的修飾酶核酸酶SI541）單鏈核酸酶SI功能：

降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。551）單鏈核酸酶SI功能：55應(yīng)用：分析DNA：RNA雜交體結(jié)構(gòu)（S1mapping）。確定內(nèi)含子部位。切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端.

切開(kāi)cDNA合成過(guò)程中形成的發(fā)夾環(huán)在限制酶位點(diǎn)上產(chǎn)生小缺失56應(yīng)用：565757Rnase

和

DNaseRNase-FreeDNase是一種DNaseI（核酸內(nèi)切酶），可以降解雙鏈或單鏈DNA。RNaseH：特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNaseA：廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶。對(duì)RNA有水解作用，但對(duì)DNA則不起作用。Rnase酶非常穩(wěn)定，常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。DEPC處理。58Rnase和DNaseRNase-FreeDNas堿性磷酸酶

功能：催化去除DNA、RNA上的5’端磷酸基團(tuán),從DNA片段上除去5’磷酸以防自身連接。用途：在DNA連接之前常用它處理克隆載體以防止載體自身連接。59堿性磷酸酶功能：催化去除DNA、RNA上的5’CalfIntestinalAlkalinePhosphatase(CIAP)60CalfIntestinalAlkalinePhosp磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶61磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶616262末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

功能：在一定條件下，催化將一個(gè)一個(gè)的脫氧核苷酸，沿著5’到3’加到DNA鏈的3’-OH末端。該過(guò)程不需要DNA模板，對(duì)雙鏈、單鏈DNA都適用。經(jīng)常用于人工粘性末端的構(gòu)建。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)63末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶功能：在一定條件下，催化將一個(gè)一個(gè)的脫甲基化酶

原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。受其影響的酶有BccllII、MbbooII等。Dcm甲基化酶識(shí)別CCmAGG或CCmTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受其影響的酶有EccooRIIII等64甲基化酶 原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用基因工程中常用的工具酶65基因工程中常用的工具酶65思考題：載體構(gòu)建的工具酶主要有那些類型？限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制與修飾。核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項(xiàng)及產(chǎn)生星活性的原因、影響其酶活性的因素。T4DNA連接酶的性質(zhì)及用途.Klenow酶的基本性質(zhì)及用途。其他工具酶的用途。66思考題：載體構(gòu)建的工具酶主要有那些類型？66練習(xí)題67練習(xí)題671.一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果：

EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kb

HindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kb

PstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb

將各限制酶位點(diǎn)繪制在DNA分子上。

2.

另一DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點(diǎn)標(biāo)在DNA分子上。

EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kb

HindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kb

PstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb

3.下圖中的一段DNA分子上有兩個(gè)限制酶PstI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，兩位點(diǎn)相距10bp，現(xiàn)有一研究生要分析EcoRI右側(cè)500bp區(qū)域內(nèi)的功能，他需要在這一區(qū)域內(nèi)獲得各種缺失突變體以確定某功能區(qū)，他應(yīng)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？假定EcoRI—PstI間的10bp除去后并不影響任何結(jié)果分析，但PstI位點(diǎn)左側(cè)的DNA不能除去

681.一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果：6810bp500bp

PstIEcoRI4.假如PstI位點(diǎn)為另一限制酶HindIII，實(shí)驗(yàn)又該如何設(shè)計(jì)？

5.現(xiàn)有一研究者打算將一EcoRIDNA片段克隆到一個(gè)DNA分子的BamHI位點(diǎn)以便DNA擴(kuò)增，但擴(kuò)增后的DNA分子又可用BamHI限制酶將插入的片段回收，如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)。

6.一研究生要將一質(zhì)粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一質(zhì)粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所獲重組質(zhì)粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII進(jìn)行回收，問(wèn)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？10bp500bp

HindIIIEcoRI6910bp500bpPstIEcoRI4.

HXbH5kbpI1kb6kbpII.5kb6kbpIII1kb

BBB7.現(xiàn)有一重組質(zhì)粒的限制酶譜和克隆到的基因轉(zhuǎn)錄方向入圖所示：已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因編碼區(qū)，現(xiàn)要將此3kb的BamHI片段克隆到另一表達(dá)載體pB的BamHI位點(diǎn)，如何才能使插入片段與表達(dá)載體中的基因處于相同的閱讀框架？如何證明插入基因的轉(zhuǎn)錄方向是相同的？

HindIIIPstIBamHIPstIBamHIBamHIHindIIIpA8kbpB0.52.570HXb8.為了檢測(cè)綠豆核酸酶對(duì)5’-端突起的單鏈DNA切割是否準(zhǔn)確有效，即該酶只除去單鏈而不損傷雙鏈區(qū)。有一研究者設(shè)計(jì)了一套非常精巧的實(shí)驗(yàn)，其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)是將一XbaI片段插入pBR322的Apr基因內(nèi)的ScaI位點(diǎn)使該基因失活，然后再經(jīng)一系列實(shí)驗(yàn)證明綠豆核酸酶的作用確實(shí)與預(yù)期的結(jié)果一致，你能否設(shè)計(jì)出這一套實(shí)驗(yàn)？(pBR322除含有Apr基因外，還含有Tcr基因)。9.某研究者計(jì)劃將具有限制酶BamHI粘性末端結(jié)構(gòu)的一段低聚核苷酸分子插入到一載體的克隆位點(diǎn)區(qū)?，F(xiàn)假設(shè)他已獲得具有低聚核苷酸插入的重組質(zhì)粒，他應(yīng)做什么實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查插入片段的方向ScaIXbaI片段Tcr（當(dāng)有外源DNA插入，該基因失活）

pBR322AprTcr718.為了檢測(cè)綠豆核酸酶對(duì)5’-端突起的單鏈DNA切割是否圖中字母代表的意義：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI；Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRIAprHSIBXbSKENSpSISfGATCCGGCCTAGpA10.一DNA分子中有一個(gè)SmaI識(shí)別位點(diǎn)(CCCGGG),現(xiàn)有一研究生想要將這識(shí)別位點(diǎn)順序完全除去,現(xiàn)已知該位點(diǎn)及兩側(cè)的序列為ACCCGGGT,他應(yīng)該如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?

11.一研究者想在下列三種限制酶位點(diǎn)的BamHI中插入另外一段低聚核苷酸,該段低聚核苷酸中的限制酶位點(diǎn)如下所示,要求獲得的重組DNA分子的各種限制酶位點(diǎn)按一種方式排列,他應(yīng)如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分離到所需的DNA分子?72圖中字母代表的意義：N-NotI；Sp-SpeI；SI-Sa

EcoRIBamHIHindIIIBamHISmaISacIEcoRIPstIBamHI

+

EBPESISmBH

12.如何使下列的限制酶識(shí)別位點(diǎn)由一種序列變?yōu)榈诙N,或由第一種變?yōu)榈谌N?

GATCGATATCGATCGATC；TCGATCGCGATCGCGCGCGA；

Sau3AIEcoRVClaITaqIREIIBssHI

AAGCTTAAGCGCTT

HindIIIThaI，HaeII

13.下圖的質(zhì)粒載體中的四環(huán)素抗性基因內(nèi)有一BamHI位點(diǎn),一研究者想用體外缺失或插入的辦法使BamHI位點(diǎn)消除,并獲得如圖所示的重組質(zhì)粒，他應(yīng)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)?假定密碼子的增減對(duì)基因的抗性無(wú)任何影響。

HindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI位點(diǎn)消除總長(zhǎng)為9kb0.5kbTcr73EcoRIBamHIHindIII第二章分子克隆常用工具酶

Tel:87286939Office:園林樓620第二章分子克隆常用工具酶74

每一單鏈具有5’-3’極性兩條單鏈間以氫鍵連接兩條單鏈，極性相反，反向平行以中心為軸，向右盤旋StructureandfeaturesDNA的基本結(jié)構(gòu)75每一單鏈具有5’-3’極性Structureand763Replication77Replication4分子克隆操作過(guò)程：

克隆目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成重組DNA→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。78分子克隆操作過(guò)程：5工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。要把不同基因的DNA線形分子片段準(zhǔn)確地切出來(lái)，需要各種限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段連接起來(lái)，需要DNA連接酶（ligase）；要合成基因或其中的一個(gè)片段，需要DNA聚合酶（polymerase）等。因此，酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具。79工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶甲基化酶80核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DN限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶用于核酸操作的常用工具酶81限制性核酸內(nèi)切酶用于核酸操作的常用工具酶8大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)82大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)9常用的工具酶性質(zhì)及功能83常用的工具酶性質(zhì)及功能10第一節(jié)分子克隆最常用兩個(gè)工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸內(nèi)切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開(kāi)。如EcoRI,HpaI“分子膠”⒉DNA連接酶——促使具有互補(bǔ)粘性末端或平頭末端的載體和供體DNA片段連接，形成重組DNA分子。84第一節(jié)分子克隆最常用兩個(gè)工具酶“分子⒈限制性核酸限制性內(nèi)切酶

Restrictionenzymes“分子剪刀”

⒈限制性核酸內(nèi)切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開(kāi)。如EcoRI,HpaI85限制性內(nèi)切酶Restrictionenzymes“分限制性內(nèi)切酶是一種能識(shí)別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點(diǎn)上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內(nèi)切核酸酶。86限制性內(nèi)切酶是一種能識(shí)別DNA上特定堿基一、限制性核酸內(nèi)切酶的分類87一、限制性核酸內(nèi)切酶的分類14二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則

名屬種株序菌株來(lái)源稱名名名號(hào)EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliR

HindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaed

HindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaed

HpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzaea

HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分離到的第3個(gè)限制酶。88二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則名

一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適pH為6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用 對(duì)熱不穩(wěn)定，通常貯存于–20℃環(huán)境。為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時(shí)添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中甘油的濃度。三、限制性核酸內(nèi)切酶學(xué)特性89一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適pH為每一種酶都有各自特異識(shí)別位點(diǎn)它對(duì)底物要求有特異的序列，通常的識(shí)別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp。多數(shù)限制酶的識(shí)別序列為回文結(jié)構(gòu)，在識(shí)別序列內(nèi)或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵。90每一種酶都有各自特異識(shí)別位點(diǎn)它對(duì)底物要求有特異的91189219不同限制性內(nèi)切酶切割的三種結(jié)果93不同限制性內(nèi)切酶切割的三種結(jié)果20942195225`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ同尾酶965`---GGATCC---3`5`---G9724①溫度：一般37℃ ②鹽離子濃度：Na＋，Mg2＋ ③緩沖體系：具有穩(wěn)定pH環(huán)境的Tris-HCl緩沖體系DTT用于保持酶

穩(wěn)定性和活性 ④反應(yīng)體積和甘油濃度：商品化的限制性內(nèi)切核酸酶均加50％甘油作為保護(hù)劑，一般在-20℃保存。酶切反應(yīng)時(shí)，加酶的體積一般不超過(guò)總反應(yīng)的10％，否則甘油濃度過(guò)高，影響酶切反應(yīng)⑤反應(yīng)時(shí)間：通常為1h；進(jìn)行大量DNA酶切反應(yīng)時(shí)一般讓酶解過(guò)夜⑥D(zhuǎn)NA純度和結(jié)構(gòu)DNA樣品中所含的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑、RNA等雜質(zhì)會(huì)影響酶切反應(yīng)的速度和完全程度酶切的底物一般為雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會(huì)影響酶切反應(yīng)。四、影響酶切反應(yīng)的條件*98①溫度：一般37℃四、影響酶切反應(yīng)的條件*25II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)體系99II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)體系26“星”活性Staractivity

“星”活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端ppH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性所謂的現(xiàn)象。

在名稱右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示,如EcoRⅠ*：AATT；EcoRⅠ：GAATTC必須采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟,應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。 100“星”活性Staractivity“星”活性：位點(diǎn)偏愛(ài)（sitepreference）某些限制性內(nèi)切酶對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。101位點(diǎn)偏愛(ài)（sitepreference）28第二節(jié)DNA連接酶DNALigase102第二節(jié)DNA連接酶DNALigase29定義：催化DNA上裂口兩側(cè)(相鄰)核苷酸裸露的3＇羥基和5＇磷酸之間形成共價(jià)結(jié)合的磷酸二酯鍵，使斷開(kāi)的DNA裂口連接起來(lái)功能：具有修復(fù)單鏈或雙鏈的能力,在DNA重組、復(fù)制和損傷后的修復(fù)中都起關(guān)鍵作用。一、DNA連接酶性質(zhì)103定義：催化DNA上裂口兩側(cè)(相鄰)核苷酸裸露的3＇羥基和5＇10431兩種DNA連接酶比較二、常用連接酶105兩種DNA連接酶比較二、常用連接酶32連接反應(yīng)的溫度是影響轉(zhuǎn)化效率的最重要參數(shù)。多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持連接酶活性的最佳反應(yīng)溫度卻是37℃ 但在該溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷，所以連接反應(yīng)一般采用16℃過(guò)夜。三、DNA連接酶的反應(yīng)條件106連接反應(yīng)的溫度是影響轉(zhuǎn)化效率的最重要參數(shù)。多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍由于平末端的連接效率比粘性末端要低得多，故在平末端連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要求較高。防止環(huán)化：堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體時(shí)間：過(guò)夜最好107DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍341）粘性末端DNA片段的連接1081）粘性末端DNA片段的連接35直接用T4DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。同聚物加尾連接平末端DNA片段：先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA連接酶進(jìn)行連接用銜接物連接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上構(gòu)建限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后產(chǎn)生特異的粘性末端，從而與具有互補(bǔ)末端的DNA連接2)平末端DNA片段的連接109直接用T4DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。2)平末端應(yīng)用互補(bǔ)同聚物加尾法連接DNA片段110應(yīng)用互補(bǔ)同聚物加尾法連接DNA片段37用銜接物分子連接平末端的DNA片段銜接物：指用化學(xué)方法合成的一段由若干個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段111用銜接物分子連接平末端的DNA片段銜接物：指用化學(xué)方法合成的四、重組DNA實(shí)驗(yàn)的一般程序選用一種對(duì)載體DNA只具唯一限制識(shí)別位點(diǎn)的限制酶（如EcoRI）作位點(diǎn)特異的切割，形成全長(zhǎng)的具粘性末端的線性DNA分子再將外源DNA片段也用同一種酶作相同的消化?；旌?，加入DNA連接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成雙鏈結(jié)合體。其中單鏈缺口經(jīng)DNA連接酶封閉之后，便產(chǎn)生穩(wěn)定的雜種DNA分子。112四、重組DNA實(shí)驗(yàn)的一般程序選用一種對(duì)載體DNA只具唯一限制第二節(jié)其他分子克隆工具酶113第二節(jié)其他分子克隆工具酶40一、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶114一、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I依賴于DNA的DN用途：DNA缺口平移中標(biāo)記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶I

以一條DNA為模板通過(guò)聚合作用把脫氧核苷酸加到雙鏈DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA.115用途：DNA缺口平移中標(biāo)記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶基本用途116基本用途43

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)

大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。117大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragm1184511946有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3’-OH端外切

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)120有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性基本用途121基本用途4812249TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶，最適溫度75℃-80℃需要Mg2+(10mmol／L)，在低濃度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一價(jià)陽(yáng)離子高至0.1moI／L對(duì)活性無(wú)影響，而最適濃度NaCl為40mmol/L，KCl為60mmol/L最適pH7.8(Tris-HCl)，與大腸桿菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高溫和無(wú)核酸酶活性TaqDNA聚合酶123TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaqua催化RNA體外合成反應(yīng)依賴DNA的RNA聚合酶不依賴DNA的RNA聚合酶

RNA聚合酶124催化RNA體外合成反應(yīng)RNA聚合酶51反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

反轉(zhuǎn)錄酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈,同時(shí)又具有3′

→5′和5′

→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。主要用途：轉(zhuǎn)錄mRNA成為cDNA制備基因片段125反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptas雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈126雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈53DNA和RNA的修飾酶核酸酶SI堿性磷酸酶磷酸激酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶甲基化酶127DNA和RNA的修飾酶核酸酶SI541）單鏈核酸酶SI功能：

降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。1281）單鏈核酸酶SI功能：55應(yīng)用：分析DNA：RNA雜交體結(jié)構(gòu)（S1mapping）。確定內(nèi)含子部位。切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端.

切開(kāi)cDNA合成過(guò)程中形成的發(fā)夾環(huán)在限制酶位點(diǎn)上產(chǎn)生小缺失129應(yīng)用：5613057Rnase

和

DNaseRNase-FreeDNase是一種DNaseI（核酸內(nèi)切酶），可以降解雙鏈或單鏈DNA。RNaseH：特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNaseA：廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶。對(duì)RNA有水解作用，但對(duì)DNA則不起作用。Rnase酶非常穩(wěn)定，常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。DEPC處理。131Rnase和DNaseRNase-FreeDNas堿性磷酸酶

功能：催化去除DNA、RNA上的5’端磷酸基團(tuán),從DNA片段上除去5’磷酸以防自身連接。用途：在DNA連接之前常用它處理克隆載體以防止載體自身連接。132堿性磷酸酶功能：催化去除DNA、RNA上的5’CalfIntestinalAlkalinePhosphatase(CIAP)133CalfIntestinalAlkalinePhosp磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶134磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶6113562末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

功能：在一定條件下，催化將一個(gè)一個(gè)的脫氧核苷酸，沿著5’到3’加到DNA鏈的3’-OH末端。該過(guò)程不需要DNA模板，對(duì)雙鏈、單鏈DNA都適用。經(jīng)常用于人工粘性末端的構(gòu)建。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)136末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶功能：在一定條件下，催化將一個(gè)一個(gè)的脫甲基化酶

原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。受其影響的酶有BccllII、MbbooII等。Dcm甲基化酶識(shí)別CCmAGG或CCmTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受其影響的酶有EccooRIIII等137甲基化酶 原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用基因工程中常用的工具酶138基因工程中常用的工具酶65思考題：載體構(gòu)建的工具酶主要有那些類型？限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制與修飾。核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項(xiàng)及產(chǎn)生星活性的原因、影響其酶活性的因素。T4DNA連接酶的性質(zhì)及用途.Klenow酶的基本性質(zhì)及用途。其他工具酶的用途。139思考題：載體構(gòu)建的工具酶主要有那些類型？66練習(xí)題140練習(xí)題671.一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果：

EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kb

HindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kb

PstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb

將各限制酶位點(diǎn)繪制在DNA分子上。

2.

另一DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點(diǎn)標(biāo)在DNA分子上。

EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kb

HindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kb

PstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb

3.下圖中的一段DNA分子上有兩個(gè)限制酶PstI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，兩位點(diǎn)相距10bp，現(xiàn)有一研究生要分析EcoRI右側(cè)500bp區(qū)域內(nèi)的功能，他需要在這一區(qū)域內(nèi)獲得各種缺失突變體以確定某功能區(qū)，他應(yīng)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？假定EcoRI—PstI間的10bp除去后并不影響任何結(jié)果分析，但PstI位點(diǎn)左側(cè)的DNA不能除去

1411.一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果：6810bp500bp

PstIEcoRI4.假如PstI位點(diǎn)為另一限制酶HindIII，實(shí)驗(yàn)又該如何設(shè)計(jì)？

5.現(xiàn)有一研究者打算將一EcoRIDNA片段克隆到一個(gè)DNA分子的BamHI位點(diǎn)以便DNA擴(kuò)增，但擴(kuò)增后的DNA分子又可用BamHI限制酶將插入的片段回收，如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)。

6.一研究生要將一質(zhì)粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一質(zhì)粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所獲重組質(zhì)粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII進(jìn)行回收，問(wèn)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？10bp500bp

HindIIIEcoRI14210bp500bpPstIEcoRI4.

HXbH5kbpI1kb6kbpII.5kb6