細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)

細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)

第一節(jié)細(xì)胞因子檢測(cè)概述一、細(xì)胞因子的類型與作用特點(diǎn)二、細(xì)胞因子檢測(cè)的特點(diǎn)與方法由非神經(jīng)—內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的一大類與免疫應(yīng)答活動(dòng)密切相關(guān)的低分子蛋白與多肽。細(xì)胞因子細(xì)胞因子的類型與作用特點(diǎn)1、細(xì)胞因子的分類2、細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)以生物學(xué)作用進(jìn)行劃分的分類白細(xì)胞介素（Interleukin）——IL-1、IL-2、……IL-18干擾素（Interferon）——IFN-、IFN-、IFN-腫瘤壞死因子（Tumornecrosisfactor）——TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulatingfactor）——M-CSF、G-CSF轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforminggrowthfactor）——TGF-趨化因子（Chemokine）——IL-8、GROs、MCP-1生長(zhǎng)因子（Growthfactor）——EGF、FGF、IGF、PDGFTNFsILsIFNsTGFsChemokinesCSFs各類細(xì)胞因子間關(guān)系1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性2、多源與同源性3、高效性4、多效性（pleiotropy）5、豐余性（redundancy）6、協(xié)同性7、拮抗性8、網(wǎng)絡(luò)性細(xì)胞因子細(xì)胞因子細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子的自分泌與旁分泌性

IL-2IFN-TNF-細(xì)胞因子的同源性與多源性IFN-T細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞IL-4Th細(xì)胞肥大細(xì)胞Th細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的多效性Th細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的豐余性IL-2IL-4IL-5Th細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的協(xié)同性IL-4IL-5Th2細(xì)胞B細(xì)胞細(xì)胞因子的拮抗性Th1細(xì)胞IL-4IFN-細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)性IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSFTNFTGFIL-1IFNIL-1IFNTNFIL-1TGFIFNIL2IL-4IFNIL2IL-4IL-5IL-6TNFIFNIL-1TGFTNFIL-1IFNIL-5GM-CSFG-CSFM-GSFTNFTNFIL-1TGFIL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIL-1IL-6IL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIFN內(nèi)皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞TB細(xì)胞因子檢測(cè)的特點(diǎn)與方法1、檢測(cè)的特點(diǎn)2、檢測(cè)的方法

細(xì)胞因子檢測(cè)的特點(diǎn)免疫原性較弱樣品含量低樣品具有時(shí)效性生物效應(yīng)特異性差細(xì)胞因子檢測(cè)的方法免疫學(xué)檢測(cè)方法——抗原性檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)方法——生物活性檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)方法——基因表達(dá)檢測(cè)

第二節(jié)細(xì)胞因子檢測(cè)的方法與原理一、細(xì)胞因子的細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)二、細(xì)胞因子的免疫學(xué)檢測(cè)三、細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測(cè)細(xì)胞因子的細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)1、檢測(cè)方法與原理2、檢測(cè)中的操作注意要點(diǎn)

檢測(cè)方法與原理細(xì)胞增殖或增殖抑制試驗(yàn)細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞趨化試驗(yàn)濾膜：計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化試驗(yàn)原理示意檢測(cè)中的操作注意要點(diǎn)靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)檢測(cè)標(biāo)本的制備顯示檢測(cè)結(jié)果靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)1、對(duì)所測(cè)的細(xì)胞因子有特異的敏感性2、易培養(yǎng)、保存、生物學(xué)特性穩(wěn)定3、有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)4、種屬適配各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)干擾因素IL-1D10（M）增殖法IL-2、IL-4EL-4（M）增殖法IL-4A352（H）增殖抑制法IL-2CTLL（M）增殖法IL-4IL-3KG-1（H）增殖法

TF-1（H）增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL（M）增殖法IL-2IL-5BCL-1（M）增殖法IL-4各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)干擾因素IL-6B9（M）增殖法IL-4、IL-11BM60（H）增殖法IL-7Clone-IXN/2b（M）增殖法IL-8中性粒細(xì)胞（M、H）趨化法GM-CSFTF-1（H）增殖法IL-3、IL-5IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）細(xì)胞毒法IFNwish（H）病變保護(hù)法IFN-、IFN-L929（M）病變保護(hù)法IFN-、IFN-

檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)備1、分離特定的產(chǎn)生細(xì)胞2、對(duì)產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、激活3、選擇適當(dāng)?shù)氖占瘯r(shí)間顯示檢測(cè)結(jié)果1、細(xì)胞增殖狀態(tài)的顯示：放射性核素?fù)饺敕?、胞?nèi)酶活性顯示法活細(xì)胞染色法細(xì)胞熒光測(cè)定法2、細(xì)胞毒或細(xì)胞病變狀態(tài)的顯示活細(xì)胞染色法胞內(nèi)酶活性顯示法

DNA斷片測(cè)定法直接計(jì)數(shù)法

簡(jiǎn)便、直觀,但費(fèi)時(shí)、主觀因素影響大、難以標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化細(xì)胞代謝活性測(cè)定方法

3H-TdR、125I-UdR摻入法或MTT等比色法細(xì)胞代謝產(chǎn)物測(cè)定法代謝產(chǎn)物熒光強(qiáng)度測(cè)定法和指示細(xì)胞表面標(biāo)記或可溶性分子測(cè)定法細(xì)胞增殖檢測(cè)方法分類

通過檢測(cè)細(xì)胞DNA合成的增加或減少來(lái)判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的增殖過程中，DNA合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核苷或堿基的需求增多，若將核苷標(biāo)記上可以示蹤的同位素（3H/125I），通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。結(jié)果客觀易于自動(dòng)化；適用于大標(biāo)本量的測(cè)定

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法的特異性受依賴細(xì)胞株影響；放射性污染(1)放射性核素?fù)饺敕ㄌ攸c(diǎn)：不使用放射性核素，以細(xì)胞代謝變化為增殖指征指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān)測(cè)定步驟類似相同點(diǎn)不同點(diǎn)與同位素?fù)饺敕ㄏ啾葥饺胛铮篗TT而非3H-TdR；反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度、培養(yǎng)時(shí)間不同(2)MTT比色法敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)細(xì)胞因子的免疫學(xué)檢測(cè)分泌型細(xì)胞因子的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。ELISA特異、簡(jiǎn)便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT或ElisaSpot)在包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，經(jīng)在有或無(wú)刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA，即在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān)基本原理細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)激活膜抗原標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記流式細(xì)胞分析法流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)，通過特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)單、快速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)，精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。1．分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞2．細(xì)胞固定3．封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)4．染色與分析基本步驟使用流式細(xì)胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群：

Th1細(xì)胞IFN-γTh2細(xì)胞IL-4細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)直接或間接熒光抗體染色無(wú)需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)四、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：特異性高

操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系敏感性相對(duì)較低標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測(cè)此方法測(cè)定的并非細(xì)胞因子本身，而是細(xì)胞因子的基因。方法：1、Northern印跡雜交法2、Southern印跡雜交法3、PCR與逆轉(zhuǎn)錄PCR4、原位雜交，原位PCR和原位RT—PCR

第三節(jié)常用細(xì)胞因子的檢測(cè)方法一、IL-2的檢測(cè)二、IFN-γ的檢測(cè)三、TNF的檢測(cè)待檢樣品（細(xì)胞上清）指示細(xì)胞（CTLL-2）按不同稀釋度加入37oC，16-20小時(shí)加入3HTdR（1-5Ci）37oC，4-6小時(shí)收集細(xì)胞測(cè)定白細(xì)胞介素-2的測(cè)定示意圖待檢樣品（細(xì)胞上清）指示細(xì)胞（L929）按不同稀釋度加入37oC，4小時(shí)37oC，24-48小時(shí)棄取上清，加入VSV觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）干擾素的測(cè)定示意圖腫瘤壞死因子的測(cè)定示意圖待檢樣品（細(xì)胞上清）指示細(xì)胞（L929）按不同