念珠狀鏈桿菌 Taqman MGB 熒光定量 PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

念珠狀鏈桿菌TaqmanMGB熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用【摘要】ObjectiveToestablishareal-timequantitativePCR(qPCR)methodfordetectionofStreptobacillusmoniliformis,whichcanbeusedtorapidlydetectthispathogeninlaboratoryanimals.MethodAccordingtotheS.moniliformissequencespublishedinNCBI,wedesignedspecificprimersandMGBprobe.Thespecificity,sensitivityandstabilityofthismethodwereevaluatedusing24standardreferencestrains.Totalof823respiratoryspecimensofanimalsincludingmice,rats,guineapigs,hamsters,rabbits,Mongoliangerbilsandtreeshrews,weredetectedbythisestablishedTaqmanMGBqPCRmethod.ResultsWehadsuccessfullyestablishedtheS.moniliformisTaqmanMGBqPCRmethod.S.moniliformiswasnotdetectedinthesamplesofmice,rats,guineapigs,hamstersandrabbits.ThepositiverateofS.moniliformiswas1.5%(1/65)and61.7%(37/60)inconventionalMongolianGerbilsandtreeshrews,respectively.ConclusionsOurdevelopedqPCRmethodcanbeusedtoeffectivelydetectS.moniliformisinlaboratoryanimals.Moreover,itsaccuracyandsensitivityarebetterthanthenationalstandardmethod.ThisstudylaidthefoundationsforoptimizingthequalityinspectionsystemoflaboratoryanimalsPCRNCBI24性。運(yùn)用所建立的方法對(duì)小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、長(zhǎng)爪沙鼠和樹鼩的共823份呼吸道樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果用所建TaqmanMGB熒光定量PCR方法在小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔中未檢出念珠狀鏈桿菌；檢出普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠和樹鼩中念珠狀鏈桿菌的陽性率分別為1．5％（1／65）和61．7％（37／60）。結(jié)論本研究所建立的念珠狀鏈桿菌TaqmanMGB熒光定量PCR檢測(cè)方法，能夠?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物中念珠狀鏈桿菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，敏感性優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)體系的完善奠定了基礎(chǔ)。【期刊名稱】《中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志》【年(卷),期】2015(000)008【總頁數(shù)】6頁(P62-67)【關(guān)鍵詞】念珠狀鏈桿菌;熒光定量PCR;檢測(cè)方法;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物【作者】邢進(jìn);馮育芳;岳秉飛;賀爭(zhēng)鳴;戴方偉;薩曉嬰;代解杰【作者單位】中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京100050;中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京100050;中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京100050;中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京100050;浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州310013;浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州310013;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明650118【正文語種】中文R-33念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)是一種革蘭氏陰性桿菌，作為重要的人獸共患病原［1］，具有高度多形性，在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)，是人類鼠咬熱(rat-bitefever)和哈佛山熱(Haverhillfever)的病原［2，3］C57BL/6JKM、普通PCR方法［8，9］，免疫印跡(IB)［10］、質(zhì)譜分析法(ESI-MS)［11］和蛋白芯片法［12］等。這些方法多存在特異性、敏感性和操作復(fù)雜能問題。近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用在病原檢測(cè)的TaqmanMGB熒光定量PCR方法［13］以其極高的特異性、靈敏度和檢測(cè)效率，PCR檢測(cè)念珠狀鏈桿菌的報(bào)道。本研究應(yīng)用該技術(shù)，建立了一種對(duì)念珠狀鏈桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，并成功的在動(dòng)物樣本中進(jìn)行了初步應(yīng)用。材料標(biāo)準(zhǔn)菌株和質(zhì)粒(ATCC1464723(CMCC44711(CMCC31210、CMCC36001(CMCC32219(CMCC58401)、多殺巴斯德桿菌(ATCC43137)、嗜肺巴斯德桿菌(ATCC12555)、小鼠放線桿菌(ATCC49577)、肺炎支原體(ATCC15531)、肺支原體(ATCC19612)、鼠棒狀桿菌(CMCC65013(CMCC53501)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(CMCC52301(ATCC27853)、單核細(xì)胞增生性李斯特桿菌(CMCC54004)、宋內(nèi)氏志賀菌(CMCC51082)、金黃色葡萄球菌(CMCC25923)、嚙齒類枸櫞酸桿菌(ATCCBAA-352)、陰溝腸桿菌(CMCC13047)、乙型溶血性鏈球菌(CMCC32210)、白色念珠菌(CMCC10231)、肺炎克雷柏桿菌(CMCC46108)。JM109培養(yǎng)基和試劑Oxiod，Nuclease-FreeWaterQIAamp96DNAQIAcubeKitQiagen，TaqmanGeneExpressionMasterMixABI。動(dòng)物樣本823358901101306560份野生馴化樹鼩呼吸道樣本由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供。儀器設(shè)備德國(guó)QiagenQIAcube自動(dòng)核酸提取儀，美國(guó)ThermoFisherA2生物安全柜，美國(guó)ABI7500Fast熒光定量PCR儀，上海安亭WGP-600隔水恒溫培養(yǎng)箱。方法DNA37℃48h。菌落使用QiagenDNA23DNA，操作根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。引物和探針Fusobacteriaceae［14］，而經(jīng)過近兩年的最新研究，目前將念珠狀鏈桿菌與另三個(gè)屬的菌株Sebaldella，SneathiaLeptotrichia重新組成了Leptotrichiaceae菌科［15］。因此將念珠狀鏈桿菌在8LeptotrichiaceaeNCBIGenbank1116SrRNAVectorNTIadvance11PrimerExpress3.016SV3TaqmanMGBPCR1SmF24bp:5’-TTTTCGGATTGTAAAGTGCTTTCA-3’，下游引物SmR23bp:5’-TTTAGCCGTCGCTTCTTCTGTAG-3’，Sm-MGBprobe23bp:FAM5’-TAGGGAAGAAGAAGATGACGGTA-3’MGBNFQ，目的片段長(zhǎng)度72bp。引物和探針由美國(guó)ABI公司合成制備。TaqmanMGBPCR(qPCR)檢測(cè)方法的建立101×109～1/μL。通qPCR應(yīng)體系20μL，20×上、下游引物(各18μmol/L)和探針(5μmol/L)混合液0.5μL，2×TaqMan?GeneExpressionMasterMix10μL，模板DNA1μL，Nuclease-FreeWater8.5μL。擴(kuò)增條件:50℃2min，95℃10min各1個(gè)循環(huán);95℃15s，59℃1min40個(gè)循環(huán)。每個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)重復(fù)進(jìn)行3個(gè)反應(yīng)，并用無菌水為模板作為陰性對(duì)照。取適宜質(zhì)粒稀釋度的擴(kuò)增結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。23qPCR101109/μL、1108μL、1107/μL、1×106/μL、1×105/μL1×104拷貝/μL、1×103拷貝/μL、100拷貝/μL、10拷貝/μL和1拷貝/μL各1μL作為模板，按上述條件進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。1×108～1×104/μL3qPCR，3Ct的3次重復(fù)反應(yīng)結(jié)果用作組內(nèi)比對(duì)。通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分析該方法的重復(fù)性。吸道樣本進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果與經(jīng)典的分離培養(yǎng)法進(jìn)行比較。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線取適宜質(zhì)粒稀釋度1×108～1×104拷貝/uL的擴(kuò)增結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.34X+43.018，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為99.255%(圖2)。特異性23qPCR3)。念珠狀鏈桿菌1×107/μL生。1Leptotrichiaceae16SrRNAFig.1Analysisofthe16SrRNAofLeptotrichiaceaestrain圖2念珠狀鏈桿菌Real-timePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2StandardcurveoftheTaqManMGBproberealtimequantitativePCRforS.moniliformis敏感性用倍比稀釋的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板進(jìn)行qPCR(圖4)。所建qPCR的最低檢測(cè)限為10拷貝/μL。重復(fù)性1×109copies/μL～100copies/μL3qPCR，對(duì)1×108copies～1×104copies3qPCRCt0.10～2.310.23～3.675%以下，表12。動(dòng)物中念珠狀鏈桿菌的檢測(cè)結(jié)果TaqmanMGBqPCR8231.5%(1/65)，樹鼩陽性率61.7%(37/60)。討論16SrRNAV3［16］TaqmanMGBFusobacteriaceaeBoot16SrRNAPCR2～6copis/μL，F(xiàn)usobacteriumnecrogenesSebaldellatermitidisBfaI［8］。1qPCRTab.1RepeatabilityverificationofS.moniliformisreal-timequantitativePCRintra-assayinthesamesampleindifferentconcentrationsRepeatabilityCopiesCTCTvalueMeanSDCV%組內(nèi)Differentconcentrationofthesamesample10912.57412.95012.98112.8350.2271.7710815.72915.94815.79715.8250.1120.7110719.79919.60919.33719.5820.2321.1910622.94322.89422.83922.8920.0520.2310526.77026.84526.66126.7590.0930.3510429.28129.33429.28829.3010.0290.1010333.35933.31433.13033.2680.1210.3610236.52535.83734.88335.7480.8252.312qPCRTab.2RepeatabilityverificationofS.moniliformisreal-timequantitativePCRinter-assayindifferentsamplesindifferentconcentrations重復(fù)性Repeatability質(zhì)粒拷貝數(shù)CopiesCT值CTvalueMeanSDCVDifferentsamplesofthesameconcentration10814.63914.70014.69414.6780.0340.2310718.29218.39018.04918.2440.1760.9610621.54920.93021.32021.2660.3131.4710524.90223.27024.70924.2940.8923.6710427.96427.98528.46828.1390.2851.013qPCRFig.3SpecificityoftheMongoliangerbilsamplesandtheresultsofTaqManMGBproberealtimequantitativePCRforS.moniliformis.1～61×109～1×104/uL;7DNA;848;9.水為模板空白對(duì)照;10～6364;64～96.23圖4qPCR檢測(cè)念珠狀鏈桿菌敏感性結(jié)果Fig.4SensitivityresultsofTaqManMGBproberealtimequantitativePCRforS.moniliformis.1～9.模板質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為1×109～1拷貝/μL;10.水為模板空白對(duì)照。用本研究所建立的TaqmanMGBqPCR方法對(duì)北京地區(qū)絕大部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中未檢出念珠狀鏈桿菌的存在，與培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果相符。而在普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠和野生樹鼩中檢測(cè)出陽性，與此前的研究結(jié)果不同，分離培養(yǎng)法未分離得到念珠狀鏈桿菌［17］。這與R.Boot的研究結(jié)果相符，用PCR和ELISA方法能夠檢測(cè)出陽性的人工感染大鼠，用培養(yǎng)法則不能檢出［8］。念珠狀鏈桿菌對(duì)培養(yǎng)條件要求相對(duì)較高，通過血瓊脂平皿培養(yǎng)時(shí)，(48～72)h僅形成(0.5～1)mm的不溶血小菌落，臨床樣本中又存在大量多種微生物，使分離培養(yǎng)非常困難。長(zhǎng)爪沙鼠和樹鼩還屬于新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，長(zhǎng)爪沙鼠雖已經(jīng)經(jīng)過了一定程度的凈化，但本研究中所用沙鼠為普通級(jí)別，所含微生物種類依然很豐富。樹鼩樣品為野生馴化種群，其較高的感染率應(yīng)為其野生狀態(tài)的直接體現(xiàn)。日本學(xué)者Kimura同樣根據(jù)16SrRNA建立了普通PCR方法，在褐家鼠(R.norvegicus)和黑鼠(R.rattus)中檢出念珠狀鏈桿菌的陽性率分別為92%(61/66)和58%(30/52)，而在SPF及大鼠(Wistar，SD)中則未檢測(cè)出該菌污染［18］。823PCR參考文獻(xiàn):［1］WullenweberM.Streptobacillusmoniliformis—azoonoticpathogen.Taxonomicconsiderations，hostspecies，diagnosis，therapy，geographicaldistribution［J］.LabAnim，1995.29(1):1-15.［2］ElliottSP.RatbitefeverandStreptobacillusmoniliformis［J］.ClinlMicrobiolRev.2007，20(1):13-22.［3］劉星，李紅.念珠狀鏈桿菌的研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007(06):474-476.［4］李紅，陳衛(wèi)蘭，蔣觀成，等.念珠狀鏈桿菌在小鼠群中的自然感染和發(fā)病特征的觀察［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，1995，3(02):80-86.［5］王春玲，關(guān)偉紅，蔡錦霞，等.實(shí)驗(yàn)小鼠念珠狀鏈桿菌和鼠痘病毒混合感染的診斷［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，1999，16(1):3-5.［6］GB/T14922.2-2010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)［S］，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，2010.［7］BootR，BakkerRH，ThuisH，etal.Anenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)formonitoringrodentcoloniesforStreptobacillusmoniliformisantibodies［J］.LabAnim，1993.27(4):350-357.［8］BootR，OosterhuisA，ThuisHC，etal.PCRforthedetectionofStreptobacillusmoniliformis［J］.LabAnim，2002.36(2):200-208.［9］BootR，VandeBergL，ReubsaetFA，etal.PositiveStreptobacillusmoniliformisPCRinguineapigslikelyduetoLeptotrichiaspp［J］.VetMicrobiol.2008，128(3-4):395-399.［10］BootR，VandeBergL，VlemminxMJ，etal.DetectionofantibodiestoStreptobacillusmoniliformisinratsbyanimmunoblotprocedure［J］.LabAnim，2006.40(4):447-455.［11］MackeyJR，MelendezEL，F(xiàn)arrellJJ，etal.DirectdetectionofindirecttransmissionofStreptobacillusmoniliformisratbitefeverinfection［J］.JClinMicrobiol，2014，52(6):2259-2261.［12］林樹柱，張麗芳，劉星，等.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌的一