真核細胞提取與酶切鑒定

關(guān)于真核細胞提取與酶切鑒定第一頁，共三十五頁，2022年，8月28日實驗本身:實驗室規(guī)則:時間、穿著、

儀器不能亂動、

賠償制度、

整潔、衛(wèi)生。實驗報告（如實記錄）

規(guī)范操作（辨認標(biāo)簽…）、

污染物、毒物、廢棄物

（酸堿燒傷大量自來水沖洗）規(guī)則實驗

第二頁，共三十五頁，2022年，8月28日實驗報告要求題目，組號實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒灢僮鳎喝鐚嵱涗泴嶒灲Y(jié)果及結(jié)果分析：實事求是討論或小結(jié)：認真分析，仔細思考第三頁，共三十五頁，2022年，8月28日4真核細胞基因組DNA的分離提取及酶切電泳第四頁，共三十五頁，2022年，8月28日

實驗?zāi)康?.掌握人外周血基因組DNA的提取原理、提取方法和注意事項。2.學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定DNA的原理和技術(shù)。第五頁，共三十五頁，2022年，8月28日基因組DNA提取的操作流程

〖實驗步驟〗第六頁，共三十五頁，2022年，8月28日１、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml

Eppendorf離心管中。

抗凝劑

EDTA-Na2、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑

第七頁，共三十五頁，2022年，8月28日２、加入1mlSTMT，充分混勻

使其溶血。STMT（破壞細胞膜)sugar：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機械作用而降解。Tris·HCl:不含金屬離子,與EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。MgCl2:提供Mg2+，穩(wěn)定DNA。TritonX-100:非離子去污劑（表面活性劑），直接破裂血中紅細胞和白細胞膜，釋出血紅蛋白及細胞核。第八頁，共三十五頁，2022年，8月28日３、10000g離心2min，棄上清。注意離心機的使用⑴配平⑵上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。第九頁，共三十五頁，2022年，8月28日4、用0.4ml生理鹽水洗沉淀，10000g

離心2min，棄上清。注意離心機的使用⑴配平⑵上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。第十頁，共三十五頁，2022年，8月28日５、加450μlNE溶液將沉淀重新懸浮。NENaCL:50mmol/LEDTA:1.二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2.降低細胞膜的穩(wěn)定性第十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日６、加50μl10%SDS，迅速混勻;再加50μl蛋

白酶K，輕輕搖勻后置50℃水浴1h。SDS

1.溶解膜蛋白和脂肪，從而是細胞膜破裂2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3.對RNA、DNA酶有抑制作用4.與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶)

廣譜蛋白酶，水解蛋白質(zhì)。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。第十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日７、加入TE飽合酚500μl，輕搖2min，10000g離心

1min，將上層水相移至另一新Eppendorf管內(nèi)。酚能有效地使蛋白質(zhì)變性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10％一15％的水分。第十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日８、加入酚－氯仿－異戊醇混合液500μl，輕搖

1min，10000g離心1min，將上層水相移至另

一Eppendorf管內(nèi)。氯仿也是一種蛋白變性劑，但氯仿的變性作用不如酚。氯仿有助于加速有機相和水相的分離；使用兩種不同的有機溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一一種有機溶劑效果好。酚和氯仿兩者交替反復(fù)抽提，還可克服酚的缺點。第十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日９、加入氯仿－異戊醇混合液500μl，輕搖

1min，10000g離心1min，將上層水相移至另

一新Eppendorf管內(nèi)。（定體積）移上清時要定量，寧少勿多氯仿：①將殘留在水相中的酚帶走②也可以再次使蛋白變性異戊醇：①降低分子表面張力，減少氣泡產(chǎn)生②有助于分層上層為水相中間為變性的蛋白下層為有機相第十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日10、向上清中加入1/10體積的NaAc，并混勻。

再加入2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻，

于－80℃放置10min。核酸是多聚陰離子的水溶性化合物，能與鈉、鉀、鎂等很多1價、2價陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機溶劑中不溶解，也不會被變性。最常用的沉淀劑為1價鈉、鉀、銨和鋰等離子鹽類，如醋酸鈉、氯化鈉等。常用有機沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。第十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日11、10,000g離心5min，棄上清,將小管倒置于濾紙上。室溫干燥10min。第十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日12、加入20μl雙蒸水溶解基因組DNA?；蚪MDNA8μl10XH緩沖液1μlEcoRⅠ1μl離心甩一下，37℃溫浴1h。另外剩余的10μl留做電泳分析用。酶切體系第十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日

酶切注意事項按順序加樣，每加一個樣品更換一次tip頭一定要將酶加進去加酶的時候一定保證低溫，在冰上操作加完后要充分混勻，用離心機“甩”一下再水浴（配平后，隨意調(diào)時間，將轉(zhuǎn)速調(diào)到接近最大值，即刻再調(diào)回零）第十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日13、1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(上樣量10μl)10μL酶切后基因組DNA2μL6×Loadingbuffer10μ基因組DNA2μL6×Loadingbuffer10μLMarker1×TBE恒壓100V電泳0.5-1h第二十頁，共三十五頁，2022年，8月28日

實驗原理核酸：包括DNA、RNA兩種分子。

DNARNA多呈單鏈線性分子雙鏈線性分子雙鏈環(huán)狀分子第二十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日

真核生物DNA95%存在于細胞核5%存在于細胞器真核生物RNA10%存在于細胞核15%存在于細胞器75%存在于細胞質(zhì)第二十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日

分離純化核酸總的原則應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染第二十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日

完整性的保證盡量簡化操作步驟，縮短提取過程減少化學(xué)因素對核酸的降解減少物理因素對核酸的降解如機械剪切力、高溫防止核酸的生物降解

DNA酶、RNA酶第二十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日

純度的保證核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度排除其它核酸分子的污染第二十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日

從全血中制備基因組DNA

首先用去污劑TritonX-100直接破裂紅細胞和白細胞膜，使之釋放出血紅蛋白及細胞核，通過離心分離即可獲得白細胞核；用SDS破壞核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，從而使DNA釋放入水相中。用酚／氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，再用氯仿除去DNA溶液中殘存的蛋白質(zhì)及酚；用無水乙醇沉淀水相中的DNA，即可獲得基因組DNA。破裂細胞→消化蛋白質(zhì)→有機抽提除去蛋白質(zhì)→沉淀水相中的DNA第二十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日DNA抽提示意圖第二十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠMolecularscissor第二十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日

均來自微生物，并據(jù)此而進行命名；識別序列長度常為4－8核苷酸序列;大部分酶識別序列呈二元旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)即回文結(jié)構(gòu);

其切割后的DNA可產(chǎn)生不同的末端。限制酶的特點（Ⅱ類酶）第二十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日

DNA的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海洋植物瓊脂中提取來的，為一種聚合鏈線性分子。線性DNA分子在電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)成反比DNA的空間構(gòu)型不同，即使分子量相同其遷移率也不相同

第三十頁，共三十五頁，2022年，8月28日

核酸電泳的染色劑

最常用的是溴乙錠染色法。(ethidiumbromide，EB)對1ngRNA，DNA均可顯色。EB染料是一種強烈的誘變劑，操作時應(yīng)注意防護，應(yīng)戴上聚乙烯手套。在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光(590nm）。

第三十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日

實驗結(jié)果酶切后的基因組DNA第三十二頁，共