雙向免疫擴散試驗

實驗三

雙向免疫擴散試驗一目的要求1.復習鞏固免疫化學的基本知識2.熟練掌握免疫擴散法的操作步驟3.掌握其在抗血清效價的測定和特異性抗體的分析中的應用二實驗原理瓊脂糖的疏散網(wǎng)狀結(jié)構有利于大分子的自由遷移合適比例的抗原抗體結(jié)合后聚集形成沉淀；沉淀的產(chǎn)生阻止抗原抗體復合物的自由運動；沉淀帶形成一種特異性的半滲透性屏障，阻滯相同抗原抗體復合物，而允許不同的分子通過。沉淀線的特征與位置：

1抗原、抗體的特異性和濃度，

2抗原、抗體分子的大小

3擴散率當抗原體存在多種成分時，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應用范圍較廣。1.雙擴散用于疾病診斷：以IBD診斷為例，中心孔加IBD標準陽性血清，周圍孔分別加IBD標準抗原、生理鹽水、待檢抗原1.2.3.4。2.雙擴散用于抗體檢測：以免疫雞IBD抗體檢測為例，中心孔加IBD標準抗原，周圍孔分別加IBD標準陽性血清、IBD陰性血清、待檢血清1.2.3.4。三操作步驟1．瓊脂玻板的制備梅花型打孔圖將溶化的1.5%瓊脂倒在培養(yǎng)皿中，使之能將表面覆蓋，制成厚度約2～3mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔。（切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現(xiàn)。）2．免疫擴散及結(jié)果觀察注意：加樣至孔滿為止，不可外溢。待孔內(nèi)液體滲入凝膠后即可放于溫盒中。濕盒于37℃中，一般保溫24～48h，觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。每孔加入抗原/抗體10μl四結(jié)果記錄五討論ABCDEFAgAb試討論以上六種情況中抗原和抗體的濃度差異以及在凝膠中的擴散率大?。ㄓ茫尽ⅲ?、≈表示）實驗四

火箭免疫電泳【目的要求】1.復習鞏固免疫化學的基本知識2.熟練掌握火箭免疫電泳的操作步驟3.掌握其在抗血清效價的測定和特異性抗體的分析中的應用。【實驗原理】在電場作用下，抗原在含定量抗體的離子瓊脂糖中泳動后，如二者比例合適時，可在短時間內(nèi)出現(xiàn)錐形的沉淀峰，形似火箭狀，故又稱為火箭電泳。此沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比，與抗體的濃度成反比。+10mm5mm【操作步驟】1.瓊脂糖玻板的制備

30ml1.5％的瓊脂糖懸液（0.45g瓊脂糖+0.025M的巴比妥緩沖液）→微波爐溶解→等溫度降到56℃時→加入200μl抗體→澆制瓊脂厚度為1～2mm抗體瓊脂板。2.抗原在稀釋板中倍比稀釋

1/1、1/2、1/4、1/8、待測樣品100ul抗原50ul1/1抗原50ul緩沖液50ul緩沖液50ul緩沖液50ul1/2抗原50ul1/4抗原1/11/21/41/8首先加入首先加入首先加入3．打孔、加樣火箭電泳試驗示意圖待瓊脂凝固后，于距玻板一長邊10mm處，以3mm孔徑打孔器打孔一排，孔距5mm。電泳前各孔中加入抗原液，每孔20μL。4．電泳：250伏1.5小時（濾紙搭橋）5．結(jié)果判定電泳結(jié)束