生物制藥課件

生物制藥課件本章主要內(nèi)容多肽及蛋白類藥物的一般生產(chǎn)方法重要的多肽類藥物生產(chǎn)工藝重要的蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)工藝

本章要求（1）掌握蛋白質(zhì)提純的一般方法（2）掌握肽的固相合成法

（3）熟悉胸腺素、干擾素、胰島素、白蛋白的制備工藝（4）了解胃膜素等的生產(chǎn)方法

第一節(jié)多肽及蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)方法

一、蛋白質(zhì)類藥物的分離與純化

（一）材料選擇

原料來源:動、植物組織和微生物

選擇原則:富含所需蛋白質(zhì)多肽成分易得易提取

無害

基因工程菌（或細(xì)胞）、轉(zhuǎn)基因動、植物

影響天然蛋白質(zhì)類藥物質(zhì)量、產(chǎn)量和生產(chǎn)成本的因素：

牛胰豬胰

含量（IU/Kg胰臟）4000

3000抗原性高低與人胰島素差異3個Aa1個Aa（2）發(fā)育生長階段

（1）種屬

胸腺原料必須采自幼齡動物一般從胎兒、胎豬或胎牛肝中獲得

（3）生物狀態(tài)

（4）原料來源（5）原料解剖學(xué)部位（6）對生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求

胃粘膜總提取物、胃蛋白酶、凝乳酶、粘多糖（二）蛋白質(zhì)提純的一般方法

分離依據(jù)：

分子量大小

溶解度

電荷

吸附性質(zhì)

對其他分子的生物親和力等電點的概念在一定pH環(huán)境中，某一種蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，或解離成兩性離子，其凈電荷為零，此時環(huán)境的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點RCHCOO-

NH3+RCH

COO-

NH2RCHCOOH

NH3+酸性堿性1、根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同來純化蛋白質(zhì)等電點時蛋白質(zhì)的特性性質(zhì)比較穩(wěn)定，物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、粘度、滲透壓等均最小

等電點的偏移

兩性物質(zhì)的等電點會因條件不同（不同離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑）而改變。

當(dāng)鹽存在時，pr若結(jié)合較多陽離子子，則PI向較高的pH偏移；反之，PI移向較低pH根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同來純化蛋白質(zhì)的方法：

等電點沉淀法

用等電點法沉淀蛋白質(zhì)常需配合鹽析操作，而除去不需要的雜蛋白時，常需配合熱變性操作。

等電聚焦電泳

a.分離蛋白質(zhì)b.測定蛋白質(zhì)的等電點2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子形狀和大小的不同來純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是生物大分子,不同種類蛋白質(zhì)分子量大小不同.

方法：凝膠過濾法、超濾法、離心法及透析法

適用范圍：蛋白質(zhì)與其他小分子物質(zhì)分離，以及大小不同的蛋白質(zhì)分離。

[注意]

用超濾法時，超濾膜截留分子量常與實際情況不一致。分子量相近的蛋白質(zhì)由于在介質(zhì)中有呈線形溶質(zhì)或者是球形溶質(zhì)的區(qū)別，可能出現(xiàn)不同的結(jié)果。（分子形狀）

凝膠過濾（體積排阻色譜）3、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的不同來純化蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)溶解度的影響因素

溶液的pH

離子強(qiáng)度溶劑的電解質(zhì)性質(zhì)溫度

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的不同來純化蛋白質(zhì)的方法：

a,鹽溶與鹽析法硫酸銨分級沉淀

b,結(jié)晶法

c,低溫有機(jī)溶劑沉淀法常用溶劑：乙醇和丙酮

4、根據(jù)蛋白質(zhì)電離性質(zhì)的不同來純化蛋白質(zhì)原理：利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離。蛋白質(zhì)的離子交換劑：陰離子交換基：DEAE（二乙胺乙基）、QAE（季胺乙基）陽離子交換基：CM（羧甲基）、SP（磺丙基）、P（膦酸基）骨架材料：葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺,纖維素商品化離子交換劑：DEAE-SephadexA-25離子交換條件選擇原則

1.對已知等電點的物質(zhì)，在pH高于其等電點時，用陰離子交換劑，在低于其等電點時，用陽離子交換劑。

2.

等電點未知的物質(zhì)，可參照電泳結(jié)果

3.若吸附太牢，可改用交換當(dāng)量較小的交換劑或改變條件降低交換劑上帶電基團(tuán)的解離度5、根據(jù)蛋白質(zhì)功能專一性的不同來純化蛋白質(zhì)

親和層析法，即利用蛋白質(zhì)分子能與其相應(yīng)的配體進(jìn)行特異的、非共價鍵的可逆性結(jié)合而達(dá)到純化的目的。固相化金屬親和層析（IMAC）利用蛋白質(zhì)分子中的咪唑基和巰基與一些金屬元素（如Cu2＋、Zn2+等）形成配位結(jié)合，使蛋白質(zhì)得到分離純化。6、根據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)與相應(yīng)的載體基團(tuán)結(jié)合來純化蛋白質(zhì)

原理：蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)與吸附劑上的疏水基團(tuán)結(jié)合，再用洗脫劑（調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、極性、PH)將蛋白質(zhì)洗脫下來。方法：疏水性相互作用層析應(yīng)用：用含酚基疏水基團(tuán)的瓊脂糖純化重組人表皮生長因子（rhEGF），純度可達(dá)94%，回收率達(dá)82%。7、根據(jù)蛋白質(zhì)的選擇性吸附性質(zhì)來純化蛋白質(zhì)

常用吸附劑：結(jié)晶磷酸鈣（羥灰石）、磷酸鈣凝膠、硅膠、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化鋁以及活性炭等。

應(yīng)用：催產(chǎn)素、胰島素、HCG、HMG、細(xì)胞包素C等的純化8、根據(jù)蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中分配的不同來純化蛋白質(zhì)

逆流分溶：以化合物在兩個不相溶的液相之間進(jìn)行分配為基礎(chǔ)的分離過程

應(yīng)用：垂體激素、氨基酸、DNA等的純化。9、根據(jù)酶對蛋白質(zhì)的作用來純化蛋白質(zhì)

二、多肽與蛋白質(zhì)的化學(xué)合成液相合成法在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的均相反應(yīng)，始于50年代

適用范圍：分子量不太大的多肽（30肽以下）

缺點：合成分子量較大的蛋白質(zhì)時，產(chǎn)物不能表現(xiàn)出全部活力且不能結(jié)晶固相合成法

始于1962年

適用范圍：小肽的合成（30肽以下）缺點：對大分子的合成，還不能達(dá)到天然物質(zhì)的全部活力（如124肽的核糖核酸酶）。多肽合成的幾個主要步驟：

①氨基保護(hù)和羧基活化；②羧基保護(hù)和氨基活化；③接肽和除去保護(hù)基團(tuán)。

（一）基團(tuán)保護(hù)保護(hù)基必須具備的條件

（1）易在預(yù)定的部位引入（2）易除去（3）引入和除去保護(hù)基時，分子中的其它部位不會受到影響，特別是已接好的肽鍵。氨基保護(hù)劑：芐氧羰酰氯（Cbz-Cl）

可用催化氫化法或鈉氨法（用金屬鈉在液氨中處理）除去保護(hù)基叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）用稀鹽酸或乙酸在室溫除去保護(hù)基。氯甲酸芐酯Benzoxycarbonyl（簡寫Z）羧基保護(hù)劑

種類：乙醇或甲醇

引入：無水乙醇或甲醇在鹽酸存在下進(jìn)行酯化，使羧基接上烷基。脫除：常溫下，氫氧化鈉皂化法。

側(cè)鏈的保護(hù)

His咪唑基、Ser羥基、Tyr酚基、Cys巰基等的保護(hù)保護(hù)劑：芐基（—B2），鈉氨法除去。

Glu和Asp的β－及γ-羧基的保護(hù)保護(hù)劑：β-及γ-苯甲酯，催化氫化法除去。

Arg胍基的保護(hù)保護(hù)劑：對甲基磺?；═os-）。（二）肽的液相合成法

階梯伸長法

片斷縮合法1.階梯伸長法

定義：

將帶有R-O-CO-型保護(hù)基的氨基酸（不是肽）的羧基活化，從肽的C-端開始每次接上一個氨基酸，逐步遞增的辦法。適用范圍：合成比較小的肽或肽段。根據(jù)羧基活化方法不同,又分為:混合酸酐法和活化酯法

注意：一般采用羧基活化的方法，合成肽的常規(guī)方法是從C-端向N-端進(jìn)行。（原因：活化氨基的反應(yīng)激烈，且常常產(chǎn)生消旋化）活化酯法（帶有氨基保護(hù)的氨基酸對硝基芳香族酯與另一氨基酸酯的氨基縮合成肽）DCC+N-端保護(hù)的Aa(R1CO)2OR2-NH2R1-CO-NH-R2混合酸酐法----DCC法：加入碳二亞胺縮合劑H-Gly-OMEZ-Leu-OC6H4NO2Z-Leu-Gly-OME2.片斷縮合法片斷縮合法是由小肽縮合成大肽的方法，為避免消旋，常用疊氮法接肽。優(yōu)點：產(chǎn)品光學(xué)純度高（不消旋）。

（三）肽的固相合成法

定義：在不溶性的聚苯乙烯樹脂載體上進(jìn)行肽鏈的延長。

過程：

1.C-末端的固定

合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯樹脂（氯化芐酯樹脂）反應(yīng)形成芐酯

2.接肽按肽鏈一級結(jié)構(gòu)的順序?qū)被艘驯槐Ｗo(hù)的氨基酸逐個加上去，使肽鏈延長。

在多肽合成中通常采用氨基保護(hù),羧基活化的方法多肽固相合成原理的發(fā)明

1963年美國洛克菲勒大學(xué)教授

Robert.BruceMerrifield發(fā)明了肽的固相合成法（BOC法）,成功地合成出了舒緩激肽（9肽）和具有124個氨基酸殘基的核糖核酸酶

,并因此于1984年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。

Robert.BruceMerrifield(1921-May,2006)固相法合成多肽反應(yīng)示意圖羧基通過N,Nˊ-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC,Dicyclohexylcarbodiimide）活化

BOC法固相合成多肽示意圖固相合成多肽的常用方法：

t-BOC法ａ－氨基用叔丁氧羰基保護(hù)，最后一步脫保護(hù)和水解應(yīng)用強(qiáng)酸HF，條件苛刻，不適宜于短肽的大規(guī)模自動化合成Fmoc法現(xiàn)在大多采用Fmoc法（byR.C.SheppardatCambridgeUniversity）ａ－氨基用9-芴甲氧羰基保護(hù)，最后一步脫保護(hù)和水解反應(yīng)用弱酸TFA(三氟乙酸），條件溫和，反應(yīng)易監(jiān)控。9-芴甲氧羰酰氯固相法合成多肽優(yōu)點：最初的反應(yīng)物和產(chǎn)物都是連接在固相載體上，故可在一個反應(yīng)容器中進(jìn)行所有的反應(yīng)，大大減輕了每步產(chǎn)品提純的難度，便于自動化操作，可獲得高產(chǎn)率，產(chǎn)物易分離。

目前化學(xué)合成多肽可以在程序控制的自動化多肽合成儀上進(jìn)行

研究型多肽合成儀生產(chǎn)型多肽合成儀中式型中試型多肽合成儀研究型多肽合成儀固相法合成的多肽產(chǎn)品：

催產(chǎn)素(9肽)、促黃體生成素釋放因子（LRH，9肽）、胸腺肽（5肽），產(chǎn)量高，而且比天然產(chǎn)品好。（四）游離肽的獲得分離純化：結(jié)晶法，層析法，等電點沉淀法，超濾法

產(chǎn)品干燥：

真空冷凍干燥或冷凍干燥（避免失活）第二節(jié)多肽類藥物一、概述

活性多肽來源：生物體的組織、細(xì)胞、體液等

人工合成

第一個人工合成的活性多肽－催產(chǎn)素（1953年）神經(jīng)肽，細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子（60、70年代）

酶催化

無活性的蛋白質(zhì)前體酶加工剪切轉(zhuǎn)化活性蛋白質(zhì)、多肽

多肽藥物的種類多肽激素垂體多肽激素、下丘腦激素、甲狀腺激素、胰島激素、胸腺激素多肽類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)移因子（TF）、心鈉素（ANP）含有多肽成分的其他生化藥物

蜂毒（肽）、蛇毒（肽）二、主要多肽類藥物的制備（一）胸腺激素（Thymushormones）作用：對免疫功能（免疫缺陷病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤以及老年性退化性病變）有多方面的影響。用途：免疫調(diào)節(jié)劑

1、胸腺素（Thymocln）

來源：小牛胸腺

（1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1)由40~50種多肽組成的混合物

2)80℃熱穩(wěn)定

3)分子量在1000～15000之間

4)等電點在～之間。

根據(jù)等電點以及在等電聚焦分離時的順序而命名，共分三個區(qū)域：

α區(qū)：PI低于的組分，

β區(qū)：PI在～之間的組分，

γ區(qū):PI在以上者（此區(qū)內(nèi)組分很少）。有活性的稱為胸腺素，如胸腺素α1，無活性的稱之為多肽，如多肽β1。（2）生產(chǎn)工藝：除雜蛋白：熱變性法（要求目標(biāo)蛋白有較高的熱穩(wěn)定性）沉淀：

-10℃丙酮,避免有機(jī)溶劑引起蛋白失活硫酸銨分級沉淀：25％－50％飽和度超濾：取透過液（萬）脫鹽：SephadexG-25凝膠過濾2、胸腺肽（Thymuspeptides）（1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)：來源：冷凍的小牛（或豬、羊）胸腺

組成：

1）分子量9600和7000左右的兩類蛋白質(zhì)或肽類

2）氨基酸15種，RNA、DNA性質(zhì)：對熱較穩(wěn)定，加溫80℃生物活性不降低。經(jīng)蛋白水解酶作用，生物活性消失。（2）生產(chǎn)工藝：

原料預(yù)處理：除脂（剪刀減去脂肪、筋膜）水提：冷水熱變性除雜蛋白超濾：目蛋白分子量9600和7000

精制液分裝前，需微孔濾膜除菌過濾

（3）作用與用途：

胸腺肽可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，有較好的抗衰老和抗病毒作用。無過敏反應(yīng)和不良的副作用。（二）促皮質(zhì)素（Adrenocorticotropichormone，ACTH）1．結(jié)構(gòu)和性質(zhì):

來源：垂體前葉

溶解性：溶于水，能溶解于70%的丙酮或70％的乙醇。等電點：。

穩(wěn)定性：在干燥和酸性溶液中較穩(wěn)定，耐100℃；在堿性溶液中容易失活。2、生產(chǎn)工藝（促皮質(zhì)素）CMC離子交換吸附（羧甲基纖維素弱酸型陽離子）：靜態(tài)吸附(投料量的20%)二次吸附前，解析液用717陰離子樹脂處理：脫色、熱原、負(fù)離子梯度洗脫。洗滌：除去非特異性吸附的雜質(zhì)717、732/陰、陽離子交換樹脂：除鹽根據(jù)骨架材料不同，離子交換劑分類：

1）離子交換纖維，如CM-CSM-C2）離子交換樹脂,如聚苯乙烯磺酸型鈉樹脂(國產(chǎn)732樹脂）

3）凝膠離子交換劑，如DEAE-SephadexA-50

根據(jù)可解離的交換基團(tuán)（或平衡離子），離子交換劑分類：

1）陽離子交換劑（強(qiáng)酸、中酸、弱酸）

2）陰離子交換劑（強(qiáng)堿、中堿、弱堿）關(guān)于離子交換劑離子交換劑的選擇一般原則：1）根據(jù)物質(zhì)PI及介質(zhì)PH確定其帶電狀態(tài)介質(zhì)PH>物質(zhì)PI，帶負(fù)電，選陰離子交換劑介質(zhì)PH<物質(zhì)PI，帶正電，選陽離子交換劑2）還需考慮物質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解度選擇適合的PH范圍（a）酸性蛋白、DEAE－纖維素、CM-纖維素的解離曲線（b）堿性蛋白、DEAE－纖維素、CM-纖維素的解離曲線蛋白質(zhì)離子交換層析中交換劑的選擇蛋白質(zhì)若pH>PI,蛋白質(zhì)帶負(fù)電，在范圍內(nèi)蛋白質(zhì)和DEAE離子交換劑都是解離的，帶相反電荷當(dāng)pH<PI,蛋白質(zhì)帶正電，只有在范圍內(nèi)蛋白質(zhì)和CM離子交換劑都是解離的（三）降鈣素（Calcitonin，CT）1、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)特性：32個氨基酸殘基組成,分子量約3500溶解特性：溶于水和堿性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、異丙醇及四氯化碳等，難溶于有機(jī)酸。來源：人及哺乳動物的甲狀腺、甲狀旁腺、胸腺和腎上腺等組織中，魚類鮭、鰻、鱒等的終鰓體1.鮭魚降鈣素（Salcatonin）（心臟或心包膜，合成，提取）2.鰻魚降鈣素（Elcatonin）（心臟或心包膜，半合成，提?。?.豬降鈣素（Caltonin）（豬甲狀腺，提取法）2、生產(chǎn)工藝（提取法）將原材料制成丙酮粉的目的：1.使生物材料脫水、脫脂2.使細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，利于提取3.減少體積，便于儲存(1)制丙酮粉：豬甲狀腺于冷丙酮中浸泡至變硬、干燥、磨粉27kg(2)酸溶液提取(1540L酸＋1620Ｌ水)、離心（取上清液）、沉淀水洗（取洗液）、合并上清液和洗液，攪拌2ｈ，再離心離心清液（提取液）(3)有機(jī)溶劑沉淀（異戊醇：醋酸：水，15L）、過濾（硅藻土）沉淀物

(4)鹽溶液溶解(8L)，酸性條件除雜蛋白，離心離心液

(5)CMC離子交換柱：離心液用10倍水稀釋后過CMC柱(動態(tài)吸附)，柱用的緩沖液平衡關(guān)于離子交換的操作方式（補(bǔ)充）1.靜態(tài)交換（吸附）方式：離子交換劑與交換溶液混合、攪拌特點：操作簡單、設(shè)備要求低，分批進(jìn)行交換不完全，不適宜多組分的分離2.動態(tài)交換（吸附）方式：將離子交換劑裝柱，交換溶液上柱，進(jìn)行交換特點：無需攪拌，交換完全，可連續(xù)操作，適用于多組份物質(zhì)分離第三節(jié)蛋白質(zhì)類藥物

一、概述分類：1、蛋白質(zhì)激素2、血漿蛋白質(zhì)3、蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子4、粘蛋白5、膠原蛋白6、堿性蛋白質(zhì)7、蛋白酶抑制劑8、植物凝集素生長素（GH）、促甲狀腺素（TSH）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）、胰島素白蛋白、免疫丙種球蛋白、抗凝血酶、凝血因子干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素（IL）、NGF、EPO胃膜素明膠、阿膠，凍干豬皮硫酸魚精蛋白胰蛋白酶抑制劑植物血球凝集素（PHA）二、主要蛋白質(zhì)類藥物的制備（一）白蛋白（Albumin）（清蛋白）1、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

白蛋白免疫球蛋白，凝血因子等

575個Aa,分子量為溶解性：溶于水和半飽和硫酸銨溶液(>60％析出沉淀)。穩(wěn)定性：對酸較穩(wěn)定，較其他血漿蛋白質(zhì)耐熱（氯化鈉或脂肪酸鹽可提高其熱穩(wěn)定性）分類：人血清白蛋白(健康人血漿)、胎盤血白蛋白（健康產(chǎn)婦胎盤血）血漿蛋白2、生產(chǎn)工藝(5)除菌：先用壓濾器澄清過濾，再用冷滅菌

系統(tǒng)除菌上清液供生產(chǎn)人丙種球蛋白(1)利凡諾：乳酸依沙吖啶,白蛋白沉淀劑，充分?jǐn)嚢琛㈧o置2-4h,分離上清液與絡(luò)合沉淀(2)解離：pH弱酸性,加％NaCL，不斷攪拌解離,65℃恒溫1h,冷卻、離心、過濾（壓濾機(jī)）

(3)濃縮：超濾

(4)熱處理：滅活病毒冷滅菌技術(shù)定義：

冷滅菌是一種不用熱能殺死微生物的新技術(shù)。與傳統(tǒng)的熱滅菌相比，不僅能殺死微生物，保證產(chǎn)品安全，同時還能較好地保持產(chǎn)品的生物活性。冷滅菌方法：膜分離（微濾μm、μm過濾細(xì)菌)、UHP（超高壓滅菌）、輻射滅菌、高壓脈沖電場（二）干擾素（Interferon，IFN）1、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

特點：干擾素誘生劑誘導(dǎo)所產(chǎn)生的一類高活性、多功能的誘生蛋白質(zhì)。

分類：人干擾素按抗原性分為α、β、γ三型。（三種干擾素的理化及生物學(xué)性質(zhì)有明顯差異）2、生產(chǎn)工藝干擾素的制備方法：

人白細(xì)胞培養(yǎng)（以血庫血大量制備，達(dá)到106U／mg蛋白水平）

基因工程發(fā)酵法：重組人α-干擾素、重組人γ-干擾素國內(nèi)已上市的干擾素品種：

聚乙二醇干擾素α-2b注射劑

重組人干擾素α-2b注射液重組人干擾素α-1b滴眼液重組人干擾素α-2a栓、凝膠注射用重組人干擾素α-2a、α-2b、α-1b

(1)

工藝路線（細(xì)胞培養(yǎng)法）：PBS:磷酸鈉緩沖液（NaCl,Na2HPO4，NaH2PO4

）透析：溶解液作內(nèi)液PBS作外液，除KSCN1.白細(xì)胞的分離：離心分離血漿，吸取灰黃層（白細(xì)胞+紅細(xì)胞），用氯化銨（0.83%）裂解紅細(xì)胞，離心，收集白細(xì)胞，制成白細(xì)胞懸液

2.起動與誘生加少許白細(xì)胞干擾素，37℃培養(yǎng)２h，再加適量誘生病毒，37℃培養(yǎng)12h

，收集上清即為粗制干擾素，－20℃保存。

3.純化：KSCN（）鹽析，醇溶（94％冷乙醇）、酸沉淀除雜蛋白，堿沉濃縮4.溶解（硫氰化鉀＋，）、透析除鹽，除菌過濾、半成品檢定，合格后分裝，凍干。

（2）注意事項：

血液分離白細(xì)胞：含ACD抗凝劑血液離心血漿灰黃層氯化銨溶血（除紅細(xì)胞）離心白細(xì)胞

干擾素誘導(dǎo)劑：仙臺病毒（在10天齡雞胚中培養(yǎng)48～72h，收獲尿囊液）或新城雞瘟病毒（NDV）Ｆ株

檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖，加水至1000ml3、作用與用途作用：抗病毒、抗細(xì)胞分裂及免疫調(diào)節(jié)用途：（1）病毒性疾?。浩胀ǜ忻啊捳钚越悄ぱ?、帶狀皰疹、水痘、慢性活動性乙型肝炎。（2）惡性腫瘤：成骨肉瘤、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等（3）病毒引起的良性腫瘤（三）胰島素（Insrlin）

簡介1922年從胰臟中提取得到的一種較純的降血糖物質(zhì)，命名為胰島素1923年開始臨床應(yīng)用我國在1965年完成了結(jié)晶牛胰島素的全合成工作胰島素是世界上第一個人工合成的蛋白質(zhì)迄今胰島素仍是治療胰島素依賴型糖尿病的特效藥1．結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

（1）結(jié)構(gòu)：由51個Aa組成，有A和B兩條鏈

A鏈含21個Aa殘基；B鏈含30個Aa殘基

A、B鏈由兩個二硫鍵相連，A鏈本身還含有一個二硫鍵不同種屬動物胰島素的分子結(jié)構(gòu)大致相同，差別主要在：A鏈二硫橋中間的第8、9和10位上的三個Aa

B鏈C－末端的一個Aa上人胰島素B30蘇氨酸豬、牛胰島素B30丙氨酸人、豬胰島素（A鏈8，9，10位Aa）：蘇、絲、異亮牛胰島素（A鏈8，9，10位Aa）

：丙、絲、纈豬胰島素結(jié)構(gòu)圖

B鏈C末端人的是蘇氨酸，豬的是丙氨酸,抗原性比其他來源的胰島素要低。臨床應(yīng)用的動物胰島素以豬胰島素為主，其抗原性比其他來源（牛、馬、羊、兔、狗）的胰島素要低。（2）胰島素在體內(nèi)的存在形式胰島素由胰島的β細(xì)胞產(chǎn)生，在β細(xì)胞中開始時是以活性很弱的前體胰島素原存在，進(jìn)而分解為胰島素進(jìn)入血液循環(huán)胰島素原經(jīng)蛋白酶水解切除C肽，得活性的胰島素胰島素原是由C肽的一端與胰島素A鏈N-末端相連，另一端與B鏈C－末端相連（3）胰島素的性質(zhì)：

分子量：牛胰島素為5733，豬為5764，人為5784。

等電點：－。

溶解性：在～范圍內(nèi)幾乎不溶于水，易溶于稀酸或稀堿溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中難溶；在乙醚中不溶。在高濃度鋅的溶液中，pH6～8時胰島素溶解度急劇下降。

穩(wěn)定性：在弱酸下或混懸在中性緩沖液中穩(wěn)定2.生產(chǎn)工藝（1）酸醇法制備胰島素工藝路線胰尾（胰島素含量高）①提?。阂绕?6-88％乙醇＋5％草酸；濾渣：68-70％乙醇＋％草酸堿化：濃氨水除堿性蛋白（壓濾）酸化：硫酸除酸性蛋白③減壓濃縮：上層清液，低于30℃，減壓蒸餾濃縮、除乙醇去脂：速熱（50℃）速冷（5℃）⑤鹽析：NaCL(27%)⑥除酸性蛋白：ｐ低溫丙酮沉淀、低溫靜置、低溫離心⑦鋅沉淀:加醋酸鋅溶液，與等電點沉淀配合使用⑧除堿性蛋白、結(jié)晶、丙酮乙醚脫水3、注意事項（1）凍胰：離體后，需立即深凍（蛋白水解酶分解胰島素）。

-30℃以下急凍后轉(zhuǎn)入-20℃保存?zhèn)溆?。液氮或干冰速凍，效果更好。胰尾胰島素含量較高，單獨使用，收率可提高10%。（2）結(jié)晶胰島素的純度國外標(biāo)準(zhǔn)：胰島素原（<10ppm)、脫酰胺胰島素(<1000ppm)

我國：胰島素原含量約為20000ppm

胰島素的發(fā)展

動物胰島素重組人胰島素胰島素類似物存在免疫原性問題

不能模擬生理性胰島素分泌模式作用時間、作用效果更佳（提取或合成）基因工程菌或半合成分子改造或修飾

胰島素結(jié)構(gòu)改造和修飾－－胰島素類似物

優(yōu)點：起效快、降糖能力高、半衰期長、抗熱變性、抗蛋白水解酶的降解等。

產(chǎn)品：

1)重組賴輔胰島素：人胰島素B鏈的28位、29位脯氨酸和賴氨酸的順序換位

2)門冬胰島素：利用啤酒酵母屬，采用重組DNA技術(shù)，將人胰島素氨基酸鏈B28位的脯氨酸由天門冬氨酸替代

3)右旋糖酐胰島素（化學(xué)修飾）

酶促半合成人胰島素

經(jīng)胰蛋白酶的轉(zhuǎn)酰胺作用，將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素B30。再用離子交換層析純化，可得到高純度人胰島素。胰蛋白酶豬胰島素B30丙氨酸人胰島素B30蘇氨酸重組人胰島素的生產(chǎn)方法

1)用基因工程大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素(humaninsulin,hI)的A、B鏈,然后經(jīng)化學(xué)再氧化法,使兩條鏈在一定條件下重新形成二硫鍵,得到hI。（目前已較少使用）2)用基因工程E.coli發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素原(humanproinsulin,hPI),后經(jīng)加工形成hI。優(yōu)點：E.coli系統(tǒng)表達(dá)量高缺點：產(chǎn)物易降解,故常采用融和蛋白形式將hPI連接在一個較大的蛋白質(zhì)后,表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過一系列復(fù)雜的后加工才能形成有活性的hI

3)通過基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)hPI,經(jīng)后加工形成hI。

優(yōu)點：酵母系統(tǒng)下游后加工比細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)簡單缺點：生產(chǎn)周期長,且重組蛋白分泌量少(1～50mg/L),產(chǎn)量低（四）生長素（Growthhormone，GH）1、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)人生長激素由191個Aa組成，，（豬為）穩(wěn)定性好，其活性在冰凍條件下可保持?jǐn)?shù)年，在室溫放置48h無變化。只有靈長類的生長激素對人有活性。

2、生產(chǎn)工藝用含NaCL的Tris-HCl洗脫（2）工藝解析：

提?。杭铀苿驖{，取沉淀沉淀先用0.1mol/L硫酸銨抽提（取沉淀），再用0.25mol/L硫酸銨抽提（取上清）

分級沉淀：硫酸銨1－1.8mol/L(鹽析沉淀）一次沉淀：取上清二次沉淀：取沉淀

凝膠過濾

SephadexG-75，用含NaCL的Tris-HCl洗脫

DEAE-C層析：酸性蛋白適合用陰離子交換劑注意：當(dāng)透析與凝膠過濾或離子交換組合操作時，一般選擇與洗脫劑相似的透析外液。

3.人生長素（hGH)的研制動物生長素不能用于人體傳統(tǒng)方法：從人尸體的腦垂體中提取生物技術(shù)：重組枯草桿菌系統(tǒng)表達(dá)hGH產(chǎn)量達(dá)4.臨床用途治療因垂體功能不全而引起的侏儒癥（五）胃膜素（Gastricmucin）1、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

來源：豬胃粘膜主要成分：粘蛋白性質(zhì)：遇水后膨脹成為粘液，遇酸即沉淀，遇熱不凝固。其水溶液能被60％以上乙醇或丙酮沉淀。與酸較長時作用，能分解成各種蛋白質(zhì)和多糖組分。等電點為～5。2、生產(chǎn)工藝胃膜素、胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝（1）工藝路線：

（2）工藝解析：消化:酸水解，激活3h脫脂：氯仿丙酮分