RNA干擾技術(shù)原理及應(yīng)用

RNA干擾的原理及其應(yīng)用

賀杰2011018081

生工A1101

一、RNAi的發(fā)現(xiàn)簡史

90年代初，RichJorgensen和其同事,在對(duì)矮牽牛(petunias)進(jìn)行研究中有個(gè)奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個(gè)能產(chǎn)生紅色素的基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制現(xiàn)象(cosuppression),因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制。開始這被認(rèn)為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象。然而，并非只有植物學(xué)家才注意到了這種意外的現(xiàn)象。意大利的Cogoni等,將外源類胡蘿卜素基因?qū)腈滄呙?Neurosporacrassa),結(jié)果轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制。而在真菌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中這種共抑制現(xiàn)象被稱為“quelling”現(xiàn)象。What’smore...1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues嘗試用反義RNA(antisenseRNA)去阻斷秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis.elegans)的par-1基因的表達(dá)以探討該基因的功能,結(jié)果反義RNA的確能夠阻斷基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA(senseRNA)作為對(duì)照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。反義RNA技術(shù)反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，也包括與其它RNA互補(bǔ)的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合,即抑制了該mRNA的翻譯。通過反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，最早是在E.coli的產(chǎn)腸桿菌素的ColE1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的，許多實(shí)驗(yàn)證明在真核生物中也存在反義RNA。反義RNA技術(shù)

根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列(Shine-Dalgarnosequence）和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA技術(shù)的原理

利用基因重組構(gòu)建人工表達(dá)載體,使其體外或體內(nèi)表達(dá)反義RNA,通過堿基互補(bǔ)與靶RNA配對(duì)結(jié)合,封閉或抑制靶基因的表達(dá),從而對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后1998才被解開———華盛頓卡耐基研究院的AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的CraigMello首次將雙鏈dsRNA———正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。將制備的RNA高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義RNA無基因抑制作用，反義RNA的基因抑制作用也很微弱，而用純化后的dsRNA注入線蟲，卻能高效、特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈ＲＮＡ已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達(dá)。后來的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈ＲＮＡ不單可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）。并證明了Guo和kemphues所發(fā)現(xiàn)的正義RNA的基因壓制作用其實(shí)是轉(zhuǎn)錄時(shí)污染微量dsRNA所造成的。RNA干擾

（RNAinterference，RNAi）

RNAi是與靶基因序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性基因沉默現(xiàn)象。

它是真核生物中存在的一種抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制，具有重大生物學(xué)意義。

二、RNAi現(xiàn)象的普遍性

隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。

RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，在線蟲，果蠅體內(nèi)，RNAi能達(dá)到基因敲除的效果。三、RNAi的作用機(jī)制

基因沉默

基因沉默分為轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)

和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)兩種：

TGS是指轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默；對(duì)于部分植物來說，轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因沉默可能是因?yàn)榛蛱禺惖募谆鴮?dǎo)致;

PTGS則是指轉(zhuǎn)基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA存在這一現(xiàn)象。目前普遍認(rèn)為RNAi、共抑制、quelling均屬于PTGS！dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程

第一步（起始階段）是較長dsRNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。rRNAi過程的功能單元：siRNA

siRNA的兩條單鏈末端為5’－磷酸和3’－羥基，且3’端均有２~3個(gè)突出的核苷酸。果蠅中的RNaseⅢ樣核酸酶稱為Dicer。19ntduplex2nt3’overhangs

第二步（效應(yīng)階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以單鏈siRNA為向?qū)ёR(shí)別同源性的單鏈靶mRNA，并在距離RISC的3’端11個(gè)堿基位置切割靶mRNA，導(dǎo)致靶基因的沉默。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成。DicerRISC堿基互補(bǔ)酶解第二步第一步RNAi的放大效應(yīng)機(jī)制

siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解，生成大量的次級(jí)siRNA。形成一種鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使特定的基因表達(dá)被阻止。四、RNAi研究的一般技術(shù)路線

1.基因功能的研究由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢(shì).

在線蟲的體內(nèi)外試驗(yàn)及哺乳動(dòng)物的體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，RNAi都能達(dá)到基因敲除的結(jié)果，如對(duì)于一些敲除后小鼠在胚胎時(shí)就會(huì)死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。五、RNA干擾的應(yīng)用2.基因治療

RNAi作用的高度特異性有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常的等位基因。

腫瘤的基因治療：腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單個(gè)癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA即可以使多個(gè)基因同時(shí)沉默?；蛑委熅窒蓿?.運(yùn)載體系一直是體內(nèi)基因治療的瓶頸，如何將雙鏈RNA高效特異的轉(zhuǎn)入體內(nèi)靶細(xì)胞仍是一個(gè)難題；2.大于30個(gè)核苷酸的雙鏈RNA進(jìn)入哺乳動(dòng)物的成體細(xì)胞后，會(huì)非特異的阻斷基因的表達(dá)

治療肝炎病毒感染JudeLieberman等已經(jīng)成功地利用RNAi技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎。他們干擾的目標(biāo)是“凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)（FAs）基因”。FAs存在于細(xì)胞表面，它能夠啟動(dòng)細(xì)胞的自殺程序。據(jù)認(rèn)為，許多肝病是由于病毒、免疫系統(tǒng)失?；蚵跃凭卸炯せ盍薋As基因所導(dǎo)致的。JudeLieberman等給實(shí)驗(yàn)鼠尾部血管注入旨在“沉默”

FAs基因的siRNA，發(fā)現(xiàn)有90％的肝細(xì)胞接收到了這種RNA分子，F(xiàn)As蛋白質(zhì)的產(chǎn)量變成原先的十分之一。結(jié)果，未接受RNAi治療的實(shí)驗(yàn)鼠有40％在３天內(nèi)死亡。而40只接受過治療的實(shí)驗(yàn)鼠有33只活了下來，10天后研究人員檢查這些實(shí)驗(yàn)鼠的肝部，發(fā)現(xiàn)完全正常。

3.病毒類疾病的治療治療肝炎病毒感染McCaffreA及其導(dǎo)師KayM結(jié)果則證明RNAi可以直接治療肝炎病毒。他們首先將HBV的基因組插入到小鼠肝臟細(xì)胞中，模擬HBV感染，然后合成靶向HBV基因組不同部分的2種siRNA并分別與表達(dá)載體連接后導(dǎo)入感染小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠體內(nèi)肝炎病毒RNA的數(shù)量與對(duì)照組相比減少了92%。治療組小鼠沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。但Kay指出，這種運(yùn)送siRNA方法不能用于人類。他們正在實(shí)驗(yàn)更溫和的途徑將siRNA運(yùn)送到細(xì)胞中。對(duì)于人來說，身體比老鼠大得多，血液循環(huán)系統(tǒng)也龐大。如果解決了將siRNA有效而又充足地運(yùn)送到細(xì)胞的問題，將為許多疾病和感染提供新療法。RNAi與其它病毒

HuWY等證明了siRNA能阻抑逆轉(zhuǎn)錄Rous肉瘤病毒（RSV）感染脊椎動(dòng)物；Leonid等發(fā)現(xiàn)針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒中編碼衣殼蛋白或編碼病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒復(fù)制，加速清除受染細(xì)胞中的脊髓灰質(zhì)炎病毒；Jia等發(fā)現(xiàn)Rta-siRNA(Rta是皰疹病毒基因表達(dá)的一種起始轉(zhuǎn)錄因子)和ORF45-