實(shí)驗(yàn)細(xì)胞工程

《細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》吳慧馮浩王嬋媛封朝亮陽燦陸杏宇彭俊張音音蔡璨江園園湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(

I

I)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

NIH3T3和Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑及耗材實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧罢莆諢o菌操作的具體要求。以小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3和非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero為例，初步掌握哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)技術(shù)。無菌操作的步驟？無菌操作對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)所需的器具和耗材，諸如Tip頭、EP管、PBS等都需要滅菌，并且烘干。PBS、培養(yǎng)基、胰酶、TIP頭、EP管等物在放入到生物安全柜之前需要噴酒精。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室之前，需要紫外照射15min以上進(jìn)行消毒。進(jìn)細(xì)胞房后，必須戴乳膠手套并噴酒精消毒。觀察細(xì)胞的時(shí)候需要用酒精擦拭顯微鏡載物臺(tái)及周邊。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)房進(jìn)行紫外消毒15min。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)的基本環(huán)境？二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)的基本環(huán)境無污染環(huán)境恒定的溫度氣體環(huán)境及PH值

細(xì)胞培養(yǎng)基

為什么需要無污染環(huán)境？培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力（外表皮防護(hù)/循環(huán)系統(tǒng)的供能及排泄代謝廢物），一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。無污染環(huán)境恒定的溫度

維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為（

）℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。魚類細(xì)胞的培養(yǎng)溫度就不一樣，諸如（

）℃等等。多數(shù)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)需要O2的存在，O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。CO2也是細(xì)胞培養(yǎng)所需要的，其與培養(yǎng)基pH值的維持密切相關(guān)，CO2濃度的升高會(huì)引起培養(yǎng)基pH值降低。氣體環(huán)境以及PH值體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的氣體環(huán)境常由95％的空氣和5％的CO2構(gòu)成，針對(duì)培養(yǎng)對(duì)象的不同，CO2的濃度常在2％-10％之間變化。二氧化碳在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH為（），偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。細(xì)胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因?yàn)镹aHCO3可供CO2，但CO2易于逸出，故最適用于細(xì)胞培養(yǎng)。NaHCO3+H2O←→Na++OH-+H2O+CO2↑上式說明，只要維持CO2的濃度處于一個(gè)相對(duì)恒定的狀態(tài)，上述反應(yīng)就會(huì)保持平衡，此時(shí)培養(yǎng)基中的OH-的濃度也就會(huì)相對(duì)穩(wěn)定，換言之培養(yǎng)基的pH值也相對(duì)恒定。同時(shí)這也是為什么在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)要維持一定濃度CO2的重要原因之一。細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基是既是供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)按其物質(zhì)狀態(tài)分為（）培養(yǎng)基和（）培養(yǎng)基兩類；按其來源分為（）培養(yǎng)基和（）培養(yǎng)基。

細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基是既是供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。

合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機(jī)鹽、維生素、微量元素和細(xì)胞生長因子等。單獨(dú)使用細(xì)胞雖有生存但不能很好的生長增殖。

天然培養(yǎng)基：使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以胎/小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，最常見使用為10%。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑及耗材CO2培養(yǎng)箱生物柜顯微鏡冰箱酒精燈/移液槍/真空泵/廢液缸實(shí)驗(yàn)所需試劑？實(shí)驗(yàn)所需試劑75%酒精培養(yǎng)基DMEM(10%FBS,Penicillin/Streptomycin)PBS緩沖液胰酶（0.25%胰酶+0.01%EDTA）NIH3T3細(xì)胞簡介NIH3T3指從Swiss系小鼠胚胎細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)而得到的細(xì)胞株。由于它顯示出強(qiáng)烈的接觸抑制作用，所以能明確地識(shí)別已發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并作為一種重要的細(xì)胞材料使用于由腫瘤病毒和致癌劑等所引起的體外致癌研究。NIH3T3細(xì)胞源自紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系兩位科學(xué)家【GeorgeTodaro&HowardGreen】在1926年所建立的一個(gè)細(xì)胞系。Todaro和Green最初是從瑞士老鼠胚胎組織的原代和傳代培養(yǎng)中得到了這種3T3細(xì)胞。目前NIH3T3細(xì)胞已經(jīng)成為經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)成纖維細(xì)胞系。這個(gè)細(xì)胞系最開始是從鼠的胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)時(shí)的培養(yǎng)方案是所謂的“3T3”培養(yǎng)方案。當(dāng)時(shí)這種鼠胚胎成纖維細(xì)胞嚴(yán)格地執(zhí)行每三天傳代一次/每次固定地傳遞3×105細(xì)胞到20cm2的培養(yǎng)皿中【Theprimarymouseembryonicfibroblastcellsweretransferred(the“T”)every3days(thefirst“3”),andinoculatedattherigiddensityof3x105cellsper20cm2dish(thesecond“3”)continuously】。3T3的命名是參照了“3-daytransfer,inoculum3x105cells”的縮寫。經(jīng)過20~30次傳代培養(yǎng)后，這株保持著穩(wěn)定生長速度的細(xì)胞自發(fā)地被“永生化”了，而后被命名為3T3細(xì)胞。NIH3T3細(xì)胞注：源自ATCC官方網(wǎng)站Vero細(xì)胞簡介Vero細(xì)胞是從非洲綠猴的腎臟上皮細(xì)胞中分離培養(yǎng)出來的細(xì)胞系。該細(xì)胞系由來自日本千葉大學(xué)的Yasumura和Kawakita于1962年建立。該細(xì)胞系取“VerdaReno”(世界語意為‘綠色的腎臟’)的簡寫而命名為“Vero”。Vero細(xì)胞系是連續(xù)的非整倍體細(xì)胞，連續(xù)細(xì)胞系可以經(jīng)過許多分裂周期而不衰老。Vero細(xì)胞有干擾素分泌缺陷的特點(diǎn)；與其它普通哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同，當(dāng)被病毒感染時(shí)，它不能分泌干擾素，但它仍然具有α/β-干擾素的受體，所以對(duì)于其它來源的干擾素仍有正常的反應(yīng)。用于檢查大腸桿菌毒素。大腸桿菌毒素最初就因此細(xì)胞系而被命名為Vero毒素，后來被稱為志賀菌素樣毒素，因?yàn)樗c在痢疾志賀菌中分離出來的志賀菌素很相似。作為培養(yǎng)病毒的細(xì)胞宿主。比如:測(cè)定某種藥物對(duì)病毒復(fù)制速度的影響，檢驗(yàn)是否存在狂犬病毒或者為了研究目的培養(yǎng)病毒。作為真核寄生蟲的宿主細(xì)胞，尤其是錐體蟲屬。Vero細(xì)胞注：源自ATCC官方網(wǎng)站配置培養(yǎng)基、胰酶及PBS：PBS：商業(yè)化的(20×)PBS，50mL(20×)PBS+950mL雙蒸水，高壓滅菌;胰酶：商業(yè)化的胰蛋白酶，PBS中含0.25%的胰酶和0.01%EDTA;培養(yǎng)基：500mL培養(yǎng)基+5mLP/S【penicillin/streptomycin】+50mLFBS;實(shí)驗(yàn)試劑及耗材需要滅菌。四、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟？五、實(shí)驗(yàn)步驟觀察細(xì)胞：將顯微鏡和實(shí)驗(yàn)桌用75%酒精消毒，將NIH3T3/Vero細(xì)胞從CO2培養(yǎng)箱中拿出來，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：

采用1mL移液器【調(diào)至800μL】吸走培養(yǎng)液；用1mL移液器吸取0.8mLPBS洗滌細(xì)胞1～2分鐘，用移液器吸走PBS；400μL胰酶消化細(xì)胞，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿至細(xì)胞全部接觸胰酶后吸