食品中大腸菌群的檢驗(yàn)

食品中大腸菌群的檢驗(yàn)

1.食品微生物檢驗(yàn)的意義有害微生物對人類和生產(chǎn)的影響：引起食品變質(zhì)引起食物中毒導(dǎo)致人體患病1.食品微生物檢驗(yàn)的意義是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo),也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生的情況,為衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)可以有效地防止或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生保證產(chǎn)品的質(zhì)量,避免不必要的損失生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)原輔料的檢驗(yàn)食品加工、儲藏、銷售儲環(huán)節(jié)的檢驗(yàn)食品的檢驗(yàn)2.食品微生物檢驗(yàn)的范圍3.食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)指示菌概念:在常規(guī)安全衛(wèi)生監(jiān)測中，用以指示檢樣衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物類型：一般性、特定性（如糞便污染）、其他項(xiàng)目：菌落總數(shù)、大腸菌群、耐熱大腸菌群、總大腸菌群食源性致病菌及其毒素沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、溶血性鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲菌、致病性大腸埃希氏菌等霉菌酵母菌及其毒素黃曲霉毒素B1、B2等其他項(xiàng)目抗生素殘留、beta-內(nèi)酰胺酶、商業(yè)無菌等商業(yè)無菌概念：罐頭食品經(jīng)過適度的殺菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物。這種狀態(tài)叫做商業(yè)無菌。保溫：低酸性罐頭食品——36±℃，10天酸性罐頭食品——30±1℃，10天預(yù)定輸往熱帶地區(qū)的低酸性食品——55±1℃，5~7天每日檢查是否胖聽、泄露開罐留樣pH測定感官檢查涂片染色接種4.常用儀器設(shè)備4.0光學(xué)顯微鏡4.1培養(yǎng)箱4.2水浴箱4.常用儀器設(shè)備4.3超凈工作臺：側(cè)流式、直流式和外流式4.4干燥箱4.5高壓蒸汽滅菌器4.常用儀器設(shè)備4.6離心機(jī)4.7濾菌器4.8均質(zhì)器（勻漿器）4.9冰箱4.常用儀器設(shè)備玻璃器材及其他試管三角燒瓶燒杯玻璃棒培養(yǎng)皿接種環(huán)涂布棒酒精燈移液管移液器剪刀、鑷子試管架一、實(shí)驗(yàn)?zāi)磕康?.了解解大腸菌群群在食品檢檢驗(yàn)中的意意義。2.掌握握檢驗(yàn)的程程序和步驟驟。3.通過過MPN檢檢索表的檢檢索得出實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。。二、基本原原理大腸菌群系系指一群在在32～37℃下24h內(nèi)，，能發(fā)酵乳乳糖產(chǎn)酸、、產(chǎn)氣、需需氧或兼性性厭氧的革革蘭氏陰性性無芽孢桿桿菌。該菌菌群主要來來源于人畜畜糞便，故故以此作為為糞便污染染指標(biāo)，來來評價(jià)食品品衛(wèi)生質(zhì)量量狀況，推推斷食品中中腸道致病病菌污染的的可能。具具有廣泛的的衛(wèi)生學(xué)意意義。大腸菌群的的食品衛(wèi)生生學(xué)意義作為糞便污污染食品的的指標(biāo)菌，，MPN值值愈低則說說明食品受受糞便污染染程度及對對人體健康康危害程度度愈低作為腸道致致病菌污染染食品的指指針，大腸腸菌群數(shù)量量越多則腸腸道致病菌菌存在的可可能性就越越高，但兩兩者之間并并不總是呈呈平行關(guān)系系要求食品中中大腸菌群群完全不存存在是不可能能的，重要要的是其污污染程度即菌量量產(chǎn)氣克雷白白氏菌ETEC

EIEC

陰溝腸桿菌EHEC

大腸菌群耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157：H7大腸桿菌是人和溫血血?jiǎng)游锬c道道內(nèi)普遍存存在的細(xì)菌菌，是糞便便中的主要要菌種。一一般生活在在人大腸中中并不致病病，但它侵侵入人體一一些部位時(shí)時(shí)，可引起起感染。。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)學(xué)分類命名名，而是衛(wèi)衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)領(lǐng)域的用語語，它不代代表某一個(gè)個(gè)或某一屬屬細(xì)菌，而而指的是具具有某些特特性的一組組與糞便污污染有關(guān)的的細(xì)菌，這這些細(xì)菌在在生化及血血清學(xué)方面面并非完全全一致。一一般認(rèn)為可可包括大腸腸埃希氏菌菌、檸檬酸酸桿菌、產(chǎn)產(chǎn)氣克雷伯伯氏菌和陰陰溝腸桿菌菌等。總大腸菌群群系指一群在在37℃培培養(yǎng)24小小時(shí)能發(fā)酵酵乳糖、產(chǎn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣、、需氧和兼兼性厭氧的的革蘭氏陰陰性無芽胞胞桿菌。耐熱大腸菌菌群即糞大腸菌菌群，作為為一種衛(wèi)生生指標(biāo)菌，，耐熱大腸腸菌群中很很可能含有有糞源微生生物，因此此耐熱大腸腸菌群的存存在表明可可能受到了了糞便污染染，可能存存在大腸桿桿菌。但是是，耐熱大大腸菌群的的存在并不不代表對人人有什么直直接的危害害。致病性大腸腸桿菌能引起食物物中毒。致致病性菌株株能侵入腸腸粘膜上皮皮細(xì)胞，具具有痢疾桿桿菌樣致病病力。腸致致病性大腸腸桿菌（EPEC））、腸毒素素性大腸桿桿菌（ETEC）和和腸侵襲性性大腸桿菌菌（EIEC）等。。O157:H7（EHEC)腸出血性大大腸桿菌，，感染性腹腹瀉是近年年來新發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的危害嚴(yán)嚴(yán)重的腸道道傳染病，，已逐漸成成為威脅人人群健康的的重要公共共衛(wèi)生問題題。大腸菌群、、糞大腸菌菌群、大腸腸桿菌的從從屬關(guān)系GB4789.3-2010《大大腸菌群計(jì)計(jì)數(shù)》第一法：大大腸菌群MPN計(jì)數(shù)數(shù)法第二法：大大腸菌群平平板計(jì)數(shù)法法三、檢測方方法第一法：大大腸菌群MPN計(jì)數(shù)數(shù)法大腸菌群計(jì)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流流程0將產(chǎn)氣的試試管內(nèi)樣品品接種到BGLB肉肉湯LST不產(chǎn)產(chǎn)氣（-））小導(dǎo)管里無無氣泡LST產(chǎn)氣氣（+）需要用到的的培養(yǎng)基（1）LST肉湯培培養(yǎng)基：月月桂基硫酸酸鹽胰蛋白白胨成分：胰蛋白胨或或胰酪胨（（Tryticase）20g，NaCL5.0g，，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基基硫酸鈉0.1g，，蒸餾水1000mL。制法：將各成分溶溶解于蒸餾餾水中。分分裝到有倒倒立發(fā)酵管管的20mm×150mm試試管中，每每管10mL。121℃高壓壓滅菌15min。。最終pH6.8±±0.2。。（2）BGLB：煌煌綠乳糖膽膽鹽肉湯成分：蛋白胨10.0g，，乳糖10.0g，，牛膽粉溶溶液200mL，0.1%煌煌綠水溶液液13.3mL，蒸蒸餾水800mL，，pH7.2±0.1。制法：略抑菌劑的選選擇大腸菌群檢檢驗(yàn)中常用用的抑菌劑劑有膽鹽、、十二烷基基硫酸鈉、、洗衣粉、、煌綠、龍龍膽紫、孔孔雀綠等。。抑菌劑的主主要作用是是抑制其它它雜菌，特特別是革蘭蘭氏陽性菌菌的生長。。國家標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)中LST肉湯利用用十二烷基基硫酸鈉作作為抑菌劑劑，BGLB肉湯利利用煌綠和和膽鹽作為為抑菌劑。。抑菌劑雖可可抑制樣品品中的一些些雜菌，而而有利于大大腸菌群細(xì)細(xì)菌的生長長和挑選，，但對大腸腸菌群中的的某些菌株株有時(shí)也產(chǎn)產(chǎn)生一些抑抑制作用。。實(shí)驗(yàn)步驟及及操作要點(diǎn)點(diǎn)：1）無菌取取樣并制作作梯度稀釋釋液；2）樣品勻勻液的pH值應(yīng)在在6.5～～7.5之之間，必必要時(shí)分別別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)調(diào)節(jié)。3））從從制制備備樣樣品品勻勻液液至至樣樣品品接接種種完完畢畢，，全全過過程程不不得得超超過過15min。。4））初初發(fā)發(fā)酵酵試試驗(yàn)驗(yàn)每個(gè)個(gè)樣樣品品，，選選擇擇3個(gè)個(gè)適適宜宜的的連連續(xù)續(xù)稀稀釋釋度度的的樣樣品品勻勻液液（（液液體體樣樣品品可可以以選選擇擇原原液液）），，每每個(gè)個(gè)稀稀釋釋度度接接種種3管管月月桂桂基基硫硫酸酸鹽鹽胰胰蛋蛋白白胨胨（（LST））肉肉湯湯，，每每管管接接種種1mL（（如如接接種種量量超超過過1mL，，則則用用雙雙料料LST肉肉湯湯）），，36℃℃±±1℃℃培培養(yǎng)養(yǎng)24h±±2h，，觀觀察察倒倒管管內(nèi)內(nèi)是是否否有有氣氣泡泡產(chǎn)產(chǎn)生生，，24h±±2h產(chǎn)產(chǎn)氣氣者者進(jìn)進(jìn)行行復(fù)復(fù)發(fā)發(fā)酵酵試試驗(yàn)驗(yàn)，，如如未未產(chǎn)產(chǎn)氣氣則則繼繼續(xù)續(xù)培培養(yǎng)養(yǎng)至至48h±±2h，，產(chǎn)產(chǎn)氣氣者者進(jìn)進(jìn)行行復(fù)復(fù)發(fā)發(fā)酵酵試試驗(yàn)驗(yàn)。。未未產(chǎn)產(chǎn)氣氣者者為為大大腸腸菌菌群群陰陰性性。。LST結(jié)結(jié)果果判判斷斷大腸腸菌菌群群的的產(chǎn)產(chǎn)氣氣量量，，多多者者可可以以使使發(fā)發(fā)酵酵倒倒管管全全部部充充滿滿氣氣體體，，少少者者可可以以產(chǎn)產(chǎn)生生比比小小米米粒粒還還小小的的氣氣泡泡。。如如果果對對產(chǎn)產(chǎn)酸酸但但未未產(chǎn)產(chǎn)氣氣的的乳乳糖糖發(fā)發(fā)酵酵如如有有疑疑問問時(shí)時(shí)，，可可以以用用手手輕輕輕輕打打動(dòng)動(dòng)試試管管。。5））復(fù)復(fù)發(fā)發(fā)酵酵試試驗(yàn)驗(yàn)用接接種種環(huán)環(huán)從從產(chǎn)產(chǎn)氣氣的的LST肉肉湯湯管管中中分分別別取取培培養(yǎng)養(yǎng)物物1環(huán)環(huán)，，移移種種于于煌煌綠綠乳乳糖糖膽膽鹽鹽肉肉湯湯（（BGLB））管管中中，，36℃℃±±1℃℃培培養(yǎng)養(yǎng)48h±±2h，，觀觀察察產(chǎn)產(chǎn)氣氣情情況況。。產(chǎn)產(chǎn)氣氣者者，，計(jì)計(jì)為為大大腸腸菌菌群群陽陽性性管管。。6））大大腸腸菌菌群群最最可可能能數(shù)數(shù)（（MPN））的的報(bào)報(bào)告告按5））確確證證的的大大腸腸菌菌群群LST陽陽性性管管數(shù)數(shù)，，檢檢索索MPN表表（（見見附附錄錄B）），，報(bào)報(bào)告告每每g（（mL））樣樣品品中中大大腸腸菌菌群群的的MPN值值。。表B.1大大腸腸菌菌群群最最可可能能數(shù)數(shù)（（MPN））檢檢索索表表第二二法法：：大大腸腸菌菌群群平平板板計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)法法需要要用用到到的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基（1））VRBA：：結(jié)結(jié)晶晶紫紫中中性性紅紅膽膽鹽鹽瓊瓊脂脂成分分：：蛋蛋白白胨胨7.0g，，酵酵母母膏膏3.0g，，乳乳糖糖10.0g，，氯氯化化鈉鈉5.0g，，膽膽鹽鹽或或3號號膽膽鹽鹽1.5g，，中中性性紅紅0.03g，，結(jié)結(jié)晶晶紫紫0.002g，，瓊瓊脂脂15g～～18g，，蒸蒸餾餾水水1000mL，，pH7.4±0.11））樣樣品品的的稀稀釋釋：如如第第一一法法2））平平板板計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)選取取2個(gè)個(gè)～～3個(gè)個(gè)適適宜宜的的連連續(xù)續(xù)稀稀釋釋度度,每每個(gè)個(gè)稀稀釋釋度度接接種種2個(gè)個(gè)無無菌菌平平皿皿，，每每皿皿1mL。。同同時(shí)時(shí)取取1mL生生理理鹽鹽水水加加入入無無菌菌平平皿皿作作空空白白對對照照。。3））及及時(shí)時(shí)將將15mL～～20mL冷冷至至46℃℃的的結(jié)結(jié)晶晶紫紫中中性性紅紅膽膽鹽鹽瓊瓊脂脂（（VRBA））約約傾傾注注于于每每個(gè)個(gè)平平皿皿中中。。小小心心旋旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)平平皿皿，，將將培培養(yǎng)養(yǎng)基基與與樣樣液液充充分分混混勻勻，，待待瓊瓊脂脂凝凝固固后后，，再再加加3mL～～4mLVRBA覆覆蓋蓋平平板板表表層層。。翻翻轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)平平板板，，置置于于36℃℃±±1℃℃培培養(yǎng)養(yǎng)18h～～24h。。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步步驟驟及及操操作作要要點(diǎn)點(diǎn)：：4））平平板板菌菌落落數(shù)數(shù)的的選選擇擇選取取菌菌落落數(shù)數(shù)在在15CFU～～150CFU之之間間的的平平板板，，分分別別計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)平平板板上上出出現(xiàn)現(xiàn)的的典典型型和和可可疑疑大大腸腸菌菌群群菌菌落落。。典型型菌菌落落為為紫紫紅紅色色，，菌菌落落周周圍圍有有紅紅色色的的膽膽鹽鹽沉沉淀淀環(huán)環(huán)，，菌菌落落直直徑徑為為0.5mm或或更更大大。。5））證證實(shí)實(shí)試試驗(yàn)驗(yàn)從VRBA平平板板上上挑挑取取10個(gè)個(gè)不不同同類類型型的的典典型型和和可可疑疑菌菌落落，，分分別別移移種種于于BGLB肉肉湯湯管管內(nèi)內(nèi)，，36℃℃±±1℃℃培培養(yǎng)養(yǎng)24h～～48h，，觀觀察察產(chǎn)產(chǎn)氣氣情情況況。。凡凡BGLB肉肉湯湯管管產(chǎn)產(chǎn)氣氣，，即即可可報(bào)報(bào)告告為為大大腸腸菌菌群群陽陽性性。。6））大大腸腸菌菌群群平平板板計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)的的報(bào)報(bào)告告經(jīng)最最后后證證實(shí)實(shí)為為大大腸腸菌菌群群陽陽性性的的試試管管比比例例乘乘以以4））中中計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)的的平平板板菌菌落落數(shù)數(shù)，，再再乘乘以以稀稀釋釋倍倍數(shù)數(shù)，，即即為為