IKCA基因項目立項

PIK3CA、TP53基因項目立項報告分子診斷部徐正紅20150302PIK3CA基因項目TP53基因項目技術(shù)方法風險評估一.PIK3CA基因項目1.項目背景吉非替尼厄洛替尼西妥昔單抗帕尼單抗FDA要求對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的患者,進行EGFR基因突變檢測FDA要求使用西妥昔單抗、帕尼單抗治療結(jié)直腸癌前，必須進行KRAS基因檢測耐藥PIK3CA基因定位于3q26.3，長34kb，包含21個外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產(chǎn)生一組長124kD的蛋白。PIK3CA編碼I類磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinases,PI3Ks)的p110催化亞單位，即PI3Kp110a。I類PI3K為異源二聚體，由一個調(diào)節(jié)亞基（p85）和一個催化亞基（p110）組成。1.項目背景PIK3CA的突變約4/5發(fā)生在螺旋區(qū)(exon9)和激酶區(qū)(exon20)這兩個熱點區(qū)域。PIK3CA基因突變引起p110a異常激活，進而活化PI3Ks，激活下游Akt等信號分子，激活或抑制其下游靶蛋白進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等生物學效應，最終導致腫瘤的發(fā)生。1.項目背景CFDA注冊產(chǎn)品：產(chǎn)品名稱生產(chǎn)單位批準日期人PIK3CA基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）北京雅康博生物科技有限公司2014.06.17人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒（流式熒光雜交法）益善生物技術(shù)股份有限公司2014.07.07人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司2013.04.021.項目背景其他的PIK3CA基因突變檢測試劑盒：產(chǎn)品名稱公司一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒及檢測方法廣州達健一種檢測人PIK3CA基因突變的方法和試劑盒蘇州科貝用于檢測直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點杭州艾迪康醫(yī)學檢驗PIK3CA

基因突變檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司1.項目背景國內(nèi)相關(guān)專利：專利名稱申請（專利權(quán)）人申請?zhí)柣蚴跈?quán)公告號PIK3CA基因驅(qū)動突變的檢測探針、引物及試劑盒廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司CN102453765BPIK3CAH1047R敲入非人動物乳腺癌模型霍夫曼-拉羅奇有限公司CN201280046858一種PIK3CA基因突變檢測液相芯片廣州益善生物技術(shù)股份有限公司CN201010160769PIK3CA基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法廣州益善生物技術(shù)股份有限公司CN101445832B一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司CN201310260412一種用于檢測PIK3CA基因突變的試劑盒武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司CN201410734805引物及該引物質(zhì)譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法武漢康圣達醫(yī)學檢驗所有限公司CN201210574584一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒及其檢測方法廣州達健生物科技有限公司

CN201210330990用于檢測結(jié)直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司

CN201210234133一種檢測人PIK3CA基因突變的方法和試劑盒蘇州科貝生物技術(shù)有限公司

CN2010106085001.項目背景cancer%PIK3CAmutationSamplesource(primarytissue

vscancercellline)ExonmutatedFunctionaldomainReferenceLiver35.6(26/73)Primary9and20HelicalandkinaseLee

etal

(2004)Totalliver36%(26/73)

Breast33.3(4/12)Celllines9and20HelicalandkinaseBachman

etal(2004)Breast21.4(9/42)Primary1,9and20p85,helicalandkinaseBachman

etal(2004)Breast18.1(13/72)Primary9and20HelicalandkinaseLevine

etal(2005)Breast40.0(28/70)Primary6,7,9and20C2,helicalandkinaseCampbell

etal(2004)Breast20.7(19/92)Primary9and20HelicalandkinaseWu

etal

(2005a)Breast8.3(1/12)Primary20kinaseSamuels

etal(2004)Breast33.3(5/15)Celllines9and20HelicalandkinaseWu

etal

(2005a)Breast26.9(25/93)Primary9and20HelicalandkinaseLee

etal

(2004)Breast28.0(14/50)Celllines1,9and20p85,helicalandkinaseSaal

etal

(2005)Breast26.4(77/292)Primary1,4,7,9,13,18,20p85,C2,helicalandkinaseSaal

etal

(2005)Totalbreast26%(195/750)

Colon31.6(74/234)Primary1,2,4,7,9,18and20P85,C2,helicalandKinaseSamuels

etal(2004)Colon13.6(14/103)Primary9and20HelicalandkinaseVelho

etal(2005)Colon18.8(6/32)Primary9and20HelicalandkinaseCampbell

etal(2004)Totalcolon25%(94/369)2.臨床意義---突變率Ovarian12.1(24/198)Primary9and20HelicalandkinaseLevine

etal(2005)Ovarian6.0(11/182)Primary9and20HelicalandkinaseCampbell

etal(2004)Totalovarian9%(35/380)Gastric25.0(3/12)Primary18and20KinaseSamuels

etal(2004)Gastric10.6(5/47)Primary9and20HelicalandkinaseVelho

etal(2005)Gastric6.5(12/185)Primary9and20HelicalandkinaseLee

etal

(2004)Gastric4.3(4/94)Primary9and20HelicalandkinaseLi

etal

(2005)Totalgastric7%(24/338)

Brain26.7(4/15)Primary4,5and13C2andhelicalSamuels

etal(2004)Brain4.6(13/285)Primary9and20HelicalandkinaseBroderick

etal(2004)Totalbrain6%(17/300)

Lung1.3(3/229)Primary9and20HelicalandkinaseLee

etal

(2004)Lung4.2(1/24)Primary9HelicalSamuels

etal(2004)Totallung2%(4/253)

Leukaemia1.1(1/88)Primary9HelicalLee

etal

(2004)Totalleukaemia1%(1/88)Totalcancersreported15%(382/2551)[*]2.臨床意義義---突變率藥物檢測項目檢測意義易瑞沙特羅凱EGFR基因突變預測療效KRAS基因突變預測療效西妥昔單抗帕尼單抗KRAS基因突變預測療效BRAF基因突變預測療效威羅菲尼BRAF基因突變預測療效易瑞沙特羅凱西妥昔單抗帕尼單抗PIK3CA基因突變耐藥相關(guān)2.臨床意義義---耐藥PI3K作為EGFR下游信信號分子子被激活活，可導導致腫瘤瘤細胞對對EGFR-TKI藥藥物的耐耐藥，例例如PIK3CA基因的突突變可導導致西妥昔單單抗（愛愛必妥）），帕尼尼單抗（（維克替替比）對對轉(zhuǎn)移性性結(jié)直腸腸癌治療療的耐受受，導致致吉非替替尼，厄厄洛替尼尼對非小小細胞肺肺癌和食食道癌晚晚期患者者的治療療耐受[1-4]。K-ras，BRAF和PIK3CA基因因突變率率約占結(jié)結(jié)直腸癌癌總體患患者的56％。。KRAS，BRAF，PIK3CA任何何一個或或多個突突變對個個體化靶靶向藥物物西妥昔單單抗（愛愛必妥）），帕尼單抗抗（維克克替比））治療無效效，全部部為野生生型治療療有效[4]。PIK3CA突突變對于于乳腺癌癌個體化化靶向藥藥物曲妥珠單單抗（赫赫賽?。┲委煙o效效，野生生型治療療有效[5-6]。2.臨床意義義---耐藥COSMICIDNMAAChange突變率775c.3140A>Gp.H1047R80%Commonmutations776c.3140A>Tp.H1047L760c.1624G>Ap.E542K763c.1633G>Ap.E545K765c.1635G>Tp.E545D3.項目內(nèi)容容PIK3CAmutationorgeneamplificationwasdetectedin30.5%ofallovariancancersand45%oftheendometrioidandclearcellsubtypes,andE542K,E545K,E545D,H1047RandH1047Lmutationsweredetected[7].PIK3CAE542K,E545K,andE545Dmutationinexon9,H1047RandH1047Lmutationinexon20arethecommonmutations,andmaybeassociatedwiththeefficacyofEGFR-TKItherapy[8-9].Mostofthemutationsoccurattwohotspots,namelyE545KinthehelicaldomainandH1047Rinthecatalyticdomain,andE545KH1047Rareassociatedwithinvasionandmetastasis[10-12].continuedactivationofPI3KsignalingbythePIK3CAoncogenicmutant,p110alphaE545K,wassufficienttoabrogategefitinib-inducedapoptosis.

[13]PIK3CAE542KmayaffecttheefficacyofEGFR-TKItherapyinlungcancer[14].3.項目內(nèi)容引文[1]Sartore-BianchiA,MartiniM,MolinariF,etal.PIK3CAmutationsincolorectalcancerareassociatedwithclinicalresistancetoEGFR-targetedmonoclonalantibodies[J].Cancerresearch,2009,69(5):1851-1857[2]PaezJG,J?nnePA,LeeJC,etal.EGFRmutationsinlungcancer:correlationwithclinicalresponsetogefitinibtherapy[J].Science,2004,304(5676):1497-1500.[3]JanmaatML,Gallegos-RuizMI,RodriguezJA,etal.PredictivefactorsforoutcomeinaphaseIIstudyofgefitinibinsecond-linetreatmentofadvancedesophagealcancerpatients[J].JournalofClinicalOncology,2006,24(10):1612-1619.[4]FidlerMJ,MorrisonLE,BasuS,etal.PTENandPIK3CAgenecopynumbersandpooroutcomesinnon-smallcelllungcancerpatientswithgefitinibtherapy[J].Britishjournalofcancer,2011,105(12):1920-1926.[5]SuetaA,

YamamotoY,

Yamamoto-IbusukiM.Anintegrativeanalysisof

PIK3CA

mutation,PTEN,andINPP4Bexpressionintermsof

trastuzumab

efficacyinHER2-positivebreastcancer.PLoSOne.

2014Dec26;9(12):e116054.doi:10.1371/journal.pone.0116054.eCollection2014.[6]YuanK,WuH,WangY,etal.Phospho-PRAS40Thr246predictstrastuzumabresponseinpatientswithHER2-positivemetastaticbreastcancer[J].OncologyLetters,2015,9(2):785-789.[7]CampbellIG,RussellSE,ChoongDYH,etal.[J].Cancerresearch,2004,64(21):7678-7681.MutationofthePIK3CAgeneinovarianandbreastcancer[8]BroderickDK,DiC,ParrettTJ,etal.MutationsofPIK3CAinanaplasticoligodendrogliomas,high-gradeastrocytomas,andmedulloblastomas[J].Cancerresearch,2004,64(15):5048-5050.[9]ZhangL,ShiL,ZhaoX,etal.PIK3CAgenemutationassociatedwithpoorprognosisoflungadenocarcinoma[J].OncoTargetsandtherapy,2013,6:497.[10]YamaguchiH,YoshidaS,MuroiE,etal.Phosphoinositide3-kinasesignalingpathwaymediatedbyp110αregulatesinvadopodiaformation[J].TheJournalofcellbiology,2011,193(7):1275-1288.[11]Isakoff,

S.J.,

J.A.

Engelman,

H.Y.

Irie,

J.

Luo,

S.M.

Brachmann,

R.V.

Pearline,

L.C.

Cantley,J.S.

Brugge.

2005.

Breastcancer-associatedPIK3CAmutationsareoncogenicinmammaryepithelialcells.

CancerRes.

65:10992–11000.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-2612[12]

Kang,

S.,

A.G.

Bader,

P.K.

Vogt.

2005.

Phosphatidylinositol3-kinasemutationsidentifiedinhumancancerareoncogenic.

Proc.Natl.Acad.Sci.USA.

102:802807.doi:10.1073/pnas.0408864102[13]EngelmanJA,MukoharaT,ZejnullahuK,etal.AllelicdilutionobscuresdetectionofabiologicallysignificantresistancemutationinEGFR-amplifiedlungcancer[J].JournalofClinicalInvestigation,2006,116(10):2695.[14]HanJY,KimSH,LeeYS,etal.Comparisonoftargetednext-generationsequencingwithconventionalsequencingforpredictingtheresponsivenesstoepidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitor(EGFR-TKI)therapyinnever-smokerswithlungadenocarcinoma[J].LungCancer,2014,85(2):161-167.3.項目內(nèi)容二.TP53基因項目TP53(tumorprotein53)基因定位位于17p13.1，約20kb長，由11個外顯子和和10個內(nèi)含子組組成。編碼碼393個氨基酸蛋蛋白，分子子量53kD，是一種半半衰期短的的核內(nèi)磷酸酸化蛋白，，能通過自自身修飾或或和其他蛋蛋白相互作作用來調(diào)節(jié)節(jié)細胞周期期及細胞凋凋亡。1.項目背景當細胞在正正常狀態(tài)時時，TP53維持一個較較低的蛋白白水平，不不干擾正常常細胞的運運行，當細細胞在有損損傷或在應應激情況下下，TP53蛋白的水平平迅速升高高，使之很很快的激活活并啟動對對正常細胞胞的修復功功能。而當當細胞DNA損傷嚴重而而不能完全全修復時，，TP53蛋白將引發(fā)發(fā)細胞凋亡亡，發(fā)揮其其抑制細胞胞生長的作作用。“基因組衛(wèi)衛(wèi)士”1.項目背景CFDA注冊產(chǎn)品：：無產(chǎn)品名稱生產(chǎn)單位TP53基因6種突變檢測試劑盒（僅供科研使用）廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司人腫瘤蛋白p53(TP53)檢測試劑盒上海信裕生物技術(shù)有限公司科研類產(chǎn)品品：1.項目背景相關(guān)專利：：發(fā)明名稱申請（專利權(quán)）人申請/公開號一種檢測P53基因SNP位點的試劑及其應用中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院CN104131101Ap53基因突變的快速檢測方法上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司CN103436593A一種檢測P53基因突變的引物和探針遼寧琦潤生物科技有限公司CN102533957B基于納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基因突變的方法中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所CN101392286A一種鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒四川大學華西醫(yī)院CN101067153A1.項目背景-相關(guān)產(chǎn)品專專利TP53是迄今發(fā)現(xiàn)現(xiàn)與人類腫腫瘤相關(guān)性性最高的基基因（50%以上人類腫腫瘤中發(fā)生TP53突變），同同時TP53的突變率在在所有的腫腫瘤中也是是最高的，，尤其是在在上皮組織織發(fā)生的腫腫瘤中，TP53的突變率可可以高達50%-90%。野生型TP53能夠抑制多多藥耐藥蛋蛋白基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄，減少少多藥耐藥藥蛋白生成成。突變型的TP53是一種腫瘤瘤促進因子子，可引起起腫瘤形成成或細胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化，增強多藥耐耐藥基因表表達。TP53變異與腫瘤瘤細胞對鉑類化療藥的耐耐藥性相關(guān)關(guān)，但不影影響紫杉醇類藥的敏感性性，所以TP53作為一個新新的耐藥基基因，其突突變檢測可可用于指導導臨床腫瘤瘤患者化療療的個體化化用藥。臨床意義鉑類藥的作作用機理：：作用于DNA，引起DNA復制障礙，，從而抑制制癌細胞的的分裂。與與其他抗癌癌藥一樣，，鉑類抗癌癌藥影響DNA合成的作用用是非特異異性的。但但腫瘤細胞胞比正常細細胞增殖快快，合成DNA迅速，并且且DNA受損后的修修復功能不不完善，因因此，腫瘤瘤細胞對抗抗癌藥的細細胞毒作用用更為敏感感，從而顯顯示出藥物物的抗癌作作用。紫杉醇類藥藥物作用機機理：抗微管藥物物,通過促進微微管蛋白聚聚合抑制解解聚,保持微管蛋蛋白穩(wěn)定,抑制細胞有有絲分裂。。體外實驗驗證明紫杉杉醇具有顯顯著的放射射增敏作用用，可能是是使細胞中中止于對放放療敏感的的G2和M期。臨床意義COSMICIDNMAAChangeIARCTP53Database:Numberofreports10648c.524G>Ap.R175H1210Hotspots;commonmutations;themostfrequentmutations10656c.742C>Tp.R248W73410662

c.743G>Ap.R248Q93310659c.817C>Tp.R273C70610660c.818G>Ap.R273H851項目內(nèi)容Codons248,273,and175aretheTP53mutationhotspotsfoundinmosthumancancers.Mostmutationsathotspots,includingR248W,R248Q,R273C,R273H,R175H,arenonfunctional[1].p53mutantssuchasR248WandR273HcanbindtheMre11-Rad5-NBS1(MRN)complexandinterferewithitsabilitytorecruittheataxia–telangiectasia-mutated(ATM)kinasetoDNAdouble-strandbreaks,ultimatelycausinggeneticinstability[2].p53His175andp53His273exertedverysimilareffectsonthecellularresponsetocisplatin;bothconferredincreasedresistancetolowconcentrationsofthedrug[3].Theexpressionofallformsofmutantp53proteinexceptp53His273enhancedsensitivitytocisplatinanddoxorubicin[4].R175HandR273H,exhibitsignificantlygreaterresistancetoanumberofantitumordrugs,includingdoxorubicin,cisplatin,etoposide,and5-FU[5].Reconstitutionofamutantp53(R248W)inthesecellsinhibitedthesensitivitytocisplatintreatment[6].ThetransformantofR248Qmutationgainedhigheractivityofinvasion,whileitsanti-cancerdrugsensitivityalsoincreased[7].R273Hand

R273Cincreaseresistancetocisplatintreatment[8].項目內(nèi)容Q:廈門艾德的的TP53基因檢測試試劑盒可以以6種突變（R175H,R175C,R248W,R248Q,R273H,R273C)，為什么我我們只檢測測5種突變，不不檢測R175C突變點？A：R175C突變?yōu)榉菬釤狳c突變，，其突變蛋蛋白具有部部分功能，，且無文獻獻支持該突突變點與藥藥物的相關(guān)關(guān)作用關(guān)系系。項目內(nèi)容ThemutantCys175exhibitswild-typeproperties.ItisonlyrecognizedbyPAb1620anddoesnotbindtohsp7O.Indeed,italsobehavesasawild-typeintransactivationassay[9].InvitroevidenceforsuchdifferenceswasprovidedbythesystematicmutagenesisoftheR175hotspotcodoninhumanp53:theR175Cmutantwaswild-typeinitsphenotype[1,10].FunctionalclassificationbasedontheoveralltranscriptionalactivityofR175CisclassifiedaspartiallyfunctionalinIARCTP53database.R175Cisafalse-positivedetection,andthep.R175Cmutant(c.523C>T)isnotimpairedforanyTP53function.Consideringthisbodyofevidence,wehypothesizethatp.R175Cmaybeapassengermutationcoselectedduringneoplastictransformation[11].項目內(nèi)容[1]Xu-MonetteZY,WuL,ViscoC,etal.MutationalprofileandprognosticsignificanceofTP53indiffuselargeB-celllymphomapatientstreatedwithR-CHOP:reportfromanInternationalDLBCLRituximab-CHOPConsortiumProgramStudy[J].Blood,2012,120(19):3986-3996.[2]SongH,HollsteinM,XuY.

p53gain-of-functioncancermutantsinducegeneticinstabilitybyinactivatingATM.NatureCellBiol2007;

9:573––580[3]BlandinoG,LevineAJ,OrenM.Mutantp53gainoffunction:differentialeffectsofdifferentp53mutantsonresistanceofculturedcellstochemotherapy[J].Oncogene,1999,18(2):477-485.[4]CHANGFULIN,LAIMD.Variousformsofmutantp53confersensitivitytocisplatinanddoxorubicininbladdercancercells[J].TheJournalofurology,2001,166(1):304-310.[5]Martinez-RiveraM,SiddikZH.Resistanceandgain-of-resistancephenotypesincancersharboringwild-typep53[J].Biochemicalpharmacology,2012,83(8):1049-1062.[6]LiuK,LingS,LinWC.TopBP1mediatesmutantp53gainoffunctionthroughNF-Yandp63/p73[J].Molecularandcellularbiology,2011,31(22):4464-4481.[7].KamiyaY,OhshimaT.Theindividualcellpropertiesoforalsquamouscellcarcinomaandp53tumorsuppressorgenemutation[J].OralScienceInternational,2005,2(2):104-117.[8]LiJ,YangL,GaurS,etal.MutantsTP53p.R273Handp.R273Cbutnotp.R273GEnhanceCancerCellMalignancy[J].Humanmutation,2014,35(5):575-584.[9]GohAM,CoffillCR,LaneDP.Theroleofmutantp53inhumancancer[J].TheJournalofpathology,2011,223(2):116-126.[10]LeroyB,AndersonM,SoussiT.TP53mutationsinhumancancer:databasereassessmentandprospectsforthenextdecade[J].Humanmutation,2014,35(6):672-688.[11]OryK,LegrosY,AuguinC,etal.Analysisofthemostrepresentativetumour-derivedp53mutantsrevealsthatchangesinproteinconformationarenotcorrelatedwithlossoftransactivationorinhibitionofcellproliferation[J].TheEMBOjournal,1994,13(15):3496.項目內(nèi)容引文三.技術(shù)方法PCR技術(shù)：castPCR?technologyTaqMan?MutationDetectionAssays技術(shù)原理Highspecificity—mutantalleledetectionisbasedonanallele-specificprimer,whilewildtypebackgroundissuppressedbytheproprietaryMGBblockeroligonucleotideHighsensitivity—assayscandetectdownto0.1%mutationinabackgroundofwildtypeDNA,asdemonstratedinspikingexperimentsWidedynamicrangeandexcellentPCRefficiency—assaysdemonstrateatleast4logsofdynamicrangeandanaveragePCRefficiencyof100%±10%Fast,simplework?ow—likeotherTaqMan?Assays,typicallyrequires3hoursfromsampletoresults,withminimumhands-ontime技術(shù)優(yōu)勢樣本類型：：gDNA,FFPEtissues,freshfrozentissues,celllines適合機型：：樣本和機型型時間4月5-7月8-10月11-12月內(nèi)容采購相關(guān)試劑，質(zhì)粒，開始預實驗反應體系優(yōu)化，靈敏度，精密度，穩(wěn)定性等試驗臨床試驗，測序?qū)嶒灁?shù)據(jù)整理，相關(guān)材料的編寫項目進程項目預算產(chǎn)品價格使用次數(shù)單次檢測TaqMan?mutationdetectionassay8130.0075108.4TaqMan?GenotypingMasterMix,2?8600.0010008.6IPCMix2767.005005.5每孔合計122.5使用ABI試劑研發(fā)的的預算：項目預算項目價格（萬元）試劑3.0耗材1.0測序0.6其他0.4合計5.0自己研發(fā)的的預算：試劑和PCR技術(shù)的穩(wěn)定性性實驗過程中的的不確定性（（實驗室、試試劑等污染情情況）技術(shù)路線調(diào)整整和時間臨床樣本的收收集、樣本的的質(zhì)量試劑盒生產(chǎn)市場推廣四.風險評估Thankyou!9、靜夜四無鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。1月-231月-23Wednesday,January4,202310、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。22:00:1822:00:1822:001/4/202310:00:18PM11、以以我我獨獨沈沈久久，，愧愧君君相相見見頻頻。。。。1月月-2322:00:1822:00Jan-2304-Jan-2312、故人江海別別，幾度隔山山川。。22:00:1822:00:1822:00Wednesday,January4,202313、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。1月-231月-2322:00:1822:00:18January4,202314、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。04一一月202310:00:18下下午22:00:181月-2315、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。一月2310:00下下午1月-2322:00January4,202316、行動出成果果，工作出財財富。。2023/1/422:00:1822:00:1804January2