NGS檢測試劑質(zhì)量評價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則

第二代測序技術(shù)檢測試劑質(zhì)量評價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則中國食品藥品檢定研究院2016年8月8日一.刖言本指導(dǎo)原則主要針對第二代測序（nextgenerationsequencing,NGS）技術(shù)檢測試劑（以下簡稱“NGS檢測試劑”）產(chǎn)品質(zhì)量提出指導(dǎo)性要求，涉及基本原則、主要原材料、檢測流程及性能評價(jià)等方面。本指導(dǎo)原則是對企業(yè)和檢驗(yàn)人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。二.適用范圍本指導(dǎo)原則適用于基于NGS技術(shù)的檢測試劑的質(zhì)量評價(jià)。NGS檢測試劑的預(yù)期用途包括但不限于以下內(nèi)容：腫瘤相關(guān)基因異常、遺傳疾病相關(guān)基因異常、胚胎植入前染色體非整倍體、胎兒染色體非整倍體及病原微生物等臨床檢測應(yīng)用。此類檢測試劑涉及的NGS技術(shù)包括靶向性測序和非靶向性測序：靶向性測序法是指對樣本中的基因組進(jìn)行部分測序，如靶基因測序、外顯子（組）測序等；非靶向性測序是指對樣本中潛在生物體的基因組進(jìn)行測序。原則上不建議企業(yè)應(yīng)用全基因組測序進(jìn)行檢測，如果企業(yè)應(yīng)用全基因組測序技術(shù)，應(yīng)進(jìn)行充分的技術(shù)適用性驗(yàn)證并提交報(bào)告。待測樣本可以是人源樣本（如體液、組織、排泄物等）或病原微生物分離培養(yǎng)物（如血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等），檢測對象可以是脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或兩者的混合物。本指導(dǎo)原則盡可能覆蓋所有的NGS技術(shù)原理和測序平臺，所討論和描述的內(nèi)容不限于某個(gè)特定的NGS檢測試劑。但鑒于NGS技術(shù)一直在不斷升級和更新，可能會有本指導(dǎo)原則未能涉及的新技術(shù)。三.基本要求（一）基本原則.NGS檢測試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。.試劑生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量管理體系應(yīng)符合《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》的要求，并應(yīng)通過《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則》的核查。.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境。建立專用實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過程中樣本之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立符合生物安全要求的設(shè)施和措施。（二）主要原材料NGS檢測試劑的主要原材料包括實(shí)驗(yàn)原材料和數(shù)據(jù)分析原材料。實(shí)驗(yàn)原材料包括引物、探針、酶、參考品或標(biāo)準(zhǔn)品等，企業(yè)應(yīng)提供盡量完整的研究資料，如選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等；數(shù)據(jù)分析原材料包括數(shù)據(jù)庫（參考序列）、生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)儲存中心等。數(shù)據(jù)分析原材料能影響檢測結(jié)果，企業(yè)應(yīng)提供盡量完整的研究資料，如數(shù)據(jù)庫（參考序列）的溯源性、生物信息學(xué)分析軟件的算法以及數(shù)據(jù)儲存中心的安全性與穩(wěn)定性等。對于實(shí)驗(yàn)原材料，若企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；若來自市場（從其他單位購買），應(yīng)提供的資料包括：對供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購買合同、供貸方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。原材料或其供應(yīng)商發(fā)生變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請，并重新對產(chǎn)品進(jìn)行性能驗(yàn)證。對于數(shù)據(jù)分析原材料，若企業(yè)自己提供，應(yīng)具有完整的生物信息學(xué)分析軟、硬件能力，制定相應(yīng)的開發(fā)、維護(hù)及升級等方案；若來自市場（購買服務(wù)或產(chǎn)品），應(yīng)提供相應(yīng)的驗(yàn)證資料及后續(xù)的維護(hù)、升級等方案資料。如材料發(fā)生變更，應(yīng)重新對產(chǎn)品進(jìn)行性能驗(yàn)證，并依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請。建議企業(yè)提供的詳細(xì)資料包括但不限于以下內(nèi)容：.核酸提取、分離及純化組分的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料，需覆蓋產(chǎn)品檢測涉及的各樣本類型。.測序文庫構(gòu)建組分的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料構(gòu)建測序文庫的主要原料（脫氧三磷酸核苷、接頭序列、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及研究資料。如以上原材料來自市場，企業(yè)可提供供應(yīng)商出具的質(zhì)檢報(bào)告。如供應(yīng)商提供的原材料為混合體系，可提供針對混合體系的質(zhì)檢報(bào)告。脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；建議提交對純度、濃度及保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。引物、探針及接頭引物、探針及接頭均是由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列。探針帶有特定的標(biāo)記物，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測和捕獲。接頭包括條碼（barcode）或標(biāo)簽（index），用于將待測核酸與測序載體連接、區(qū)分不同來源的樣本等。建議企業(yè)提交序列選擇、制備方法、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以及對分子量、純度、保存穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如果為外購，需提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶應(yīng)具有相應(yīng)的酶活性。建議提交酶活性、熱穩(wěn)定性及工作效率等驗(yàn)證資料。.參考品或標(biāo)準(zhǔn)品原料選擇、制備、定值過程、穩(wěn)定性研究及性能驗(yàn)證等資料。.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染，建議提交相應(yīng)檢測報(bào)告。.數(shù)據(jù)庫（參考序列）數(shù)據(jù)庫（參考序列）用于NGS檢測試劑的生物信息學(xué)分析，輔助測序比對拼接和測序結(jié)果確認(rèn)。建議企業(yè)提交數(shù)據(jù)庫（參考序列）的溯源信息、數(shù)據(jù)庫類型（本地?cái)?shù)據(jù)庫、在線數(shù)據(jù)庫）、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及升級方案等資料。.生物信息學(xué)分析軟件用于對原始測序結(jié)果進(jìn)行分析并報(bào)告最終檢測結(jié)果。建議企業(yè)提交分析軟件的版本、算法、性能驗(yàn)證以及升級方案等資料。.數(shù)據(jù)存儲中心用于儲存原始和經(jīng)過分析后的檢測結(jié)果，可以是本地或云儲存中心。建議企業(yè)提交數(shù)據(jù)存儲中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級方案以及異常情況處置方案等資料。（三）檢測流程N(yùn)GS檢測試劑的檢測流程可以分為樣本收集、樣本制備、測序、生物信息學(xué)分析及報(bào)告和數(shù)據(jù)庫管理等五個(gè)環(huán)節(jié)。企業(yè)在設(shè)計(jì)開發(fā)過程中應(yīng)充分考慮每個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，并進(jìn)行驗(yàn)證。.樣本收集樣本可以為人體樣本（如體液、組織、排泄物等）或病原微生物分離培養(yǎng)物（如血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等）。樣本的獲取及預(yù)處理方式、保存條件及期限（短期、長期）、運(yùn)輸條件等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并引用；若沒有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則企業(yè)應(yīng)該設(shè)立自己內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，以保證樣本的質(zhì)量，并且防止樣本間的混淆與交叉污染。不同類型的樣本所抽提的核酸的質(zhì)量可能有所差異，對于每一種類型的樣本，應(yīng)當(dāng)明確檢測所需樣本的用量。如樣本不符合要求，應(yīng)重新取樣。企業(yè)需明確標(biāo)識出以下內(nèi)容，包括產(chǎn)品適用的樣本類型、采集時(shí)間、采集部位、采集方式、采集量及保存和運(yùn)輸條件等內(nèi)容。樣本的采集時(shí)間的選擇需考慮是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響；采集部位應(yīng)考慮樣本的代表性、操作的難易程度及安全性等因素；采集方式應(yīng)詳述具體的操作方法或列出相關(guān)操作指南文件以指導(dǎo)使用者（含圖示）；企業(yè)根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，設(shè)計(jì)具體的采集量標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)應(yīng)明確采集量判斷標(biāo)準(zhǔn)及方法；保存和運(yùn)輸條件應(yīng)保護(hù)樣本中的核酸，企業(yè)應(yīng)明確樣本的保存條件（溫度、濕度等）及期限（短期、長期）、運(yùn)輸條件（溫度、濕度等）及反復(fù)凍融限制等。.樣本制備核酸提取、分離及純化樣本中核酸的提取、分離及純化的主要目的是為了富集核酸濃度并保證核酸序列的完整性。企業(yè)應(yīng)在NGS檢測試劑的設(shè)計(jì)開發(fā)過程中對配套使用的核酸提取、分離及純化試劑進(jìn)行匹配性驗(yàn)證，以確保其性能滿足檢驗(yàn)的需要。企業(yè)應(yīng)明確檢測所需核酸的最小用量。企業(yè)應(yīng)該設(shè)立核酸抽提及抽提后質(zhì)量控制的書面標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并依據(jù)性能驗(yàn)證結(jié)果在此給出用于擴(kuò)增試驗(yàn)的核酸溶液濃度范圍要求，以保證核酸樣本的質(zhì)量與濃度符合要求，并且防止樣本間的混淆與交叉污染。企業(yè)應(yīng)當(dāng)對抽提的每一次核酸樣本的各種質(zhì)控參數(shù)有詳細(xì)的記錄，建議包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測方法包括但不限于分光光度法、熒光法等；核酸完整性檢測方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。如果提取、分離及純化的核酸樣本質(zhì)量不符合要求，應(yīng)重新取樣或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。靶向序列富集及測序文庫構(gòu)建靶向序列富集是指靶向性擴(kuò)增一定大小的核酸片段，企業(yè)應(yīng)對富集原理及方法進(jìn)行詳細(xì)描述。企業(yè)應(yīng)制定標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，記錄包括靶向序列片段的濃度、純度及大小等參數(shù)。企業(yè)根據(jù)具體的測序平臺的性能特點(diǎn)，對核酸序列進(jìn)行片段化處理，片段的長短應(yīng)符合后續(xù)測序的要求，片段化方法包括但不限于超聲法、酶切法等。企業(yè)應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案，對經(jīng)過片段化的核酸短序列的濃度、純度及大小等參數(shù)進(jìn)行檢測并詳細(xì)記錄。添加接頭（條碼或標(biāo)簽）測序文庫中的短核酸片段需要與測序載體連接后才能進(jìn)行測序反應(yīng)，這一連接過程需要先給短核酸片段添加接頭。NGS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)將多個(gè)來源不同的樣本混合后在一個(gè)測序反應(yīng)中同步檢測，為了區(qū)分這些樣本，通常采用在每一個(gè)原始樣本的測序文庫中加上唯一的寡核苷酸標(biāo)簽的方法進(jìn)行標(biāo)記，這些寡核苷酸標(biāo)簽被稱為條碼或標(biāo)簽。條碼和標(biāo)簽可以包含于接頭序列內(nèi)，也可以獨(dú)立于接頭序列。添加接頭可以是獨(dú)立的步驟，也可以在靶向序列富集過程添加。企業(yè)使用條碼或標(biāo)簽時(shí)，需充分驗(yàn)證并滿足測序所需的質(zhì)量要求，如測序深度、覆蓋度等條件。同時(shí)，企業(yè)應(yīng)對潛在的問題進(jìn)行充分研究，包括但不限于：條碼檢出率的均勻性、條碼互換比率以及條碼間相互污染或干擾等因素。企業(yè)應(yīng)報(bào)告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對每個(gè)條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有詳細(xì)、清晰的記錄。.測序測序平臺目前商業(yè)上常用的第二代測序平臺根據(jù)測序原理可分為光學(xué)技術(shù)（Illumina公司、華大基因公司為代表）和半導(dǎo)體技術(shù)（Thermo公司為代表）。每個(gè)測序平臺都有各自的特異性參數(shù)，包括儀器大小、通量、讀長、運(yùn)行時(shí)間及測序成本等，企業(yè)應(yīng)結(jié)合具體的臨床應(yīng)用需求選擇合適的測序平臺。測序及堿基讀取企業(yè)應(yīng)根據(jù)所選用的測序平臺，選擇合適的參數(shù)指標(biāo)對測序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并明確失控情況下的糾正措施。企業(yè)應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測序所需要的覆蓋度及深度。在測序過程中，企業(yè)應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個(gè)測序過程當(dāng)中的測序質(zhì)量。企業(yè)應(yīng)根據(jù)具體的預(yù)期用途，制定產(chǎn)品的測序覆蓋度和深度，并提供充分的理論依據(jù)及驗(yàn)證結(jié)果。堿基讀取是指識別一段基因序列片段每一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的過程。不同測序平臺具有不同的測序偏好性，可影響堿基讀取過程中的錯(cuò)誤類型與比率。應(yīng)用軟件可以消除或部分抵消測序偏好性的影響，提高堿基讀取的準(zhǔn)確性。堿基讀取后，企業(yè)應(yīng)對每個(gè)堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評估。若堿基讀取質(zhì)量有通用標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)遵循并引用；若沒有通用標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)具體應(yīng)用情況制定堿基讀取質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及分析方法，并提供充分的理論依據(jù)及驗(yàn)證結(jié)果。.生物信息學(xué)分析及報(bào)告企業(yè)應(yīng)對生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。企業(yè)應(yīng)建立生物信息學(xué)分析流程標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，保證測序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析應(yīng)報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。序列比對拼接序列比對是指利用生物信息學(xué)軟件，將短的測序片段與參考序列進(jìn)行比對后完成拼接的過程。參考序列應(yīng)具有明確溯源性，可以是全基因組序列或基因片段序列。若預(yù)期用途為檢測未知病原微生物，難以提前確定參考序列，可以將測序結(jié)果進(jìn)行互相比對，在此基礎(chǔ)上完成長序列的拼接。不同的序列比對軟件的準(zhǔn)確性、特異性及比對速度等方面均有差異，企業(yè)需根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇。企業(yè)需要評估序列比對的質(zhì)量，若比對質(zhì)量有通用的標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)遵循，并引用；若沒有通用的標(biāo)準(zhǔn)，則企業(yè)應(yīng)當(dāng)設(shè)立自己內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)，以保證比對結(jié)果的準(zhǔn)確性。待測基因序列的確認(rèn)決定檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素包括但不限于測序均勻度、覆蓋度和測序深度等。一般地，測序均勻度越好，覆蓋度越廣，深度越深，待測基因序列的拼接結(jié)果越準(zhǔn)確。待測基因序列中某些特殊區(qū)域的測序深度可能很低，可據(jù)此設(shè)置產(chǎn)品的最低檢出限。企業(yè)需要對樣本測序結(jié)果各個(gè)位點(diǎn)的測序覆蓋度和深度有明確的計(jì)算方法和詳細(xì)的描述。文件格式生物信息學(xué)分析結(jié)果的輸出格式有很多種，但是無論何種格式的文件必須包含文件結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)組織形式的說明，以及其它格式文件和生物信息學(xué)分析軟件的兼容性說明。建議使用通用的文件格式，如比對結(jié)果使用“.bam”文件或其他，測序結(jié)果使用“.fastq”文件或其他。如果企業(yè)采用自己內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)格式文件，應(yīng)建立該標(biāo)準(zhǔn)格式的詳細(xì)說明，并注明該文件格式與其它格式的兼容性及相互轉(zhuǎn)換的方法。檢測結(jié)果解讀與報(bào)告若預(yù)期用途為檢測人源基因，報(bào)告中應(yīng)明確報(bào)告說明書中預(yù)期用途與檢測范圍涵蓋的變異位點(diǎn)與變異類型以及相應(yīng)的遺傳注釋。建議基因名字應(yīng)當(dāng)與國際上通用的HUGO基因命名委員會命名規(guī)則（）一■致。若預(yù)期用途為檢測病原微生物，檢測結(jié)果應(yīng)明確測序樣本中是否含有待測病原微生物。如果是分型檢測試劑和耐藥突變檢測試劑還要明確報(bào)告病原微生物的型別及耐藥突變位點(diǎn)信息。報(bào)告中建議包括但不限于明確的檢測結(jié)果，檢測方法及局限性等內(nèi)容。原則上禁止報(bào)告中出現(xiàn)超出產(chǎn)品預(yù)期用途的檢測項(xiàng)目及結(jié)果。企業(yè)應(yīng)制定明確的檢測結(jié)果解讀與報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對不明確的檢測結(jié)果以及非預(yù)期檢測結(jié)果應(yīng)有詳細(xì)明確的處置方案。.數(shù)據(jù)庫（參考序列）及數(shù)據(jù)儲存數(shù)據(jù)庫（參考序列）的易用性、準(zhǔn)確性及全面性等因素對于檢測結(jié)果的正確解讀極為重要。企業(yè)應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的具體使用情況選擇數(shù)據(jù)庫（參考序列）并明確其溯源性。無論選擇何種類型的數(shù)據(jù)庫，企業(yè)應(yīng)對最終的檢測結(jié)果負(fù)責(zé)。若企業(yè)使用自建的數(shù)據(jù)庫，應(yīng)制定完整的維護(hù)方案（實(shí)時(shí)和定期維護(hù)方案）對數(shù)據(jù)庫內(nèi)容進(jìn)行增補(bǔ)或剔除，從而確保數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性及全面性。NGS檢測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大，企業(yè)應(yīng)當(dāng)制定合適的數(shù)據(jù)存儲方案。數(shù)據(jù)存儲方式可為本地或云存儲，無論選擇哪種方式，企業(yè)應(yīng)充分考慮數(shù)據(jù)存儲的時(shí)限性、安全性及穩(wěn)定性等因素。對于已儲存數(shù)據(jù)的重新訪問與分析，企業(yè)應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)記錄（如訪問時(shí)間，訪問人員、訪問內(nèi)容及訪問目的等信息）。對于已存儲的數(shù)據(jù)，原則上允許對其進(jìn)行基于新預(yù)期用途的重復(fù)分析，但禁止出具新的檢測報(bào)告。（四）性能評價(jià).核酸提取、測序文庫構(gòu)建核酸提取的完整性和純度以及測序文庫構(gòu)建的質(zhì)量都能影響檢測結(jié)果，因此應(yīng)對上述步驟進(jìn)行質(zhì)量控制。建議的質(zhì)量控制因素包括但不限于以下各項(xiàng)：用于核酸提取的樣本質(zhì)量、體積；核酸濃度及核酸定量方法；核酸純化的質(zhì)量及檢測方法；測序文庫的核酸質(zhì)量、濃度及片段大小等。.陰性、陽性參考品預(yù)期用途為檢測人源基因陰性參考品應(yīng)涵蓋產(chǎn)品說明書中的預(yù)期用途與檢測范圍的野生型樣本，檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；陽性參考品應(yīng)涵蓋產(chǎn)品說明書中的預(yù)期用途與檢測范圍的變異型樣本，檢測結(jié)果應(yīng)為陽性；預(yù)期用途為檢測病原微生物陰性參考品應(yīng)包括與待檢病原微生物種屬相近、臨床癥狀相似的病原微生物，且應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。相應(yīng)檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；陽性參考品應(yīng)包括產(chǎn)品說明書中預(yù)期用途與檢測范圍待檢病原微生物，且應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。相應(yīng)檢測結(jié)果應(yīng)為陽性。.最低檢出限建議可以從擴(kuò)增反應(yīng)終體系核酸濃度或基因變異序列所占百分率兩方面對最低檢出限進(jìn)行評價(jià)。NGS檢測試劑具有同時(shí)檢測多個(gè)檢測位點(diǎn)或靶點(diǎn)的能力，可將多個(gè)最低檢出限參考品混合進(jìn)行檢測，但應(yīng)分別報(bào)告各個(gè)位點(diǎn)或靶點(diǎn)的最低檢出限結(jié)果。若預(yù)期用途為檢測人源基因，最低檢出限參考品應(yīng)覆蓋所有基因變異類型；若預(yù)期用途為檢測病原微生物，最低檢出限參考品應(yīng)覆蓋所有待測病原微生物。建議最低檢出限參考品優(yōu)先使用臨床獲得的生物樣本（細(xì)胞系、病原微生物等）;對于某些難以獲得的樣本（如罕見基因類型、難以分離培養(yǎng)的病原微生物等），可以使用核酸模擬樣本（如假病毒、核酸片段、質(zhì)粒等）。使用病原微生物或核酸模擬樣本作為參考品時(shí)，應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。.精密性對于定量檢測試劑，建議考察試劑的標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)；若為定性檢測試劑，可不進(jìn)行考察。建議從以下方面對NGS檢測試劑的精密性進(jìn)行評價(jià)：對可能影響檢測精密性的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，還應(yīng)對第二代測序儀、操作者及地點(diǎn)等因素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證；建議精密性評價(jià)方法考慮以下檢測因素，包括檢測周期、檢測次數(shù)、檢測方式（批內(nèi)、批間）以及檢測人員數(shù)量等；若預(yù)期用途為檢測人源基因，用于精密性評價(jià)的參考品建議覆蓋低頻率樣本；若預(yù)期用途為檢測病原微生物，用于精密性評價(jià)的參考品建議覆蓋弱陽性樣本。.干擾物質(zhì)企業(yè)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質(zhì)，并進(jìn)行充分驗(yàn)證。驗(yàn)證干擾物質(zhì)時(shí)，建議驗(yàn)證的項(xiàng)目包括但不限于以下項(xiàng)目：引物之間的互相干擾對檢測結(jié)果的影響；潛在的PCR干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響；若預(yù)期用途為檢測病原微生物，應(yīng)分別檢測目標(biāo)病原微生物存在和不存在的情況下，非目標(biāo)病原微生物（種屬相近、臨床癥狀相似）對檢測結(jié)果的影響，以及人源基因組對檢測結(jié)果的影響。.其他問題若產(chǎn)品適用的樣本類型不止一種，應(yīng)對所涉及的樣本類型的適用性進(jìn)行評估；為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，企業(yè)應(yīng)根據(jù)不同測序平臺的特性確定合適的測序覆蓋度及深度，并進(jìn)行充分驗(yàn)證；生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)庫能直接影響檢測結(jié)果，因此應(yīng)明確版本信息或最后維護(hù)日期。企業(yè)進(jìn)行軟件或數(shù)據(jù)庫升級后，應(yīng)評估對測序結(jié)果的潛在影響，以及是否需要對既往測序結(jié)果重新分析；對于適用多個(gè)儀器的產(chǎn)品，應(yīng)提供所有適用型號儀器的性能評估資料。不同型號儀器配套的測序試劑可能不同，且測序試劑的性能直接影響檢測試劑的整體質(zhì)量，建議提供測序試劑的質(zhì)量控制要求。.起草單位本指導(dǎo)原則由中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所體外診斷試劑二室起草完成。.參考文獻(xiàn)《體外診斷試劑注冊管理辦法》，(國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號)，2014年07月30日?！吨袊镏破芬?guī)程》(2000年版)，化學(xué)工業(yè)出版社。GuidelinesforDiagnosticNext-GenerationSequencing.EuropeanJournalofHumanGenetics,2015,24(1):1584-1589。Next-GenerationSequencingforInfectiousDiseaseDiagnosisandManagement:AReportoftheAssociationforMolecularPathology.TheJournalofMolecularDiagnostics,2015,17(6):623-634。ACMGClinicalLaboratoryStandardsforNext-GenerationSequencing.GeneticsinMedicine,2013,15(9)。CollegeofAmericanPathologists'LaboratoryStandardsforNext-GenerationSequencingClinicalTests.ArchivesofPathology&LaboratoryMedicine,2014,139(4)。MolecularDiagnosticMethodsforInfectiousDiseases;ApprovedGuideline-SecondEdition.ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.NCCLS,MM3-A2,Vol26No.8,ISBN1-56238-596-8。QuantitativeMolecularMethodsforInfectiousDiseases;ApprovedGuideline.NCCLS,MM6-A,Vol.23No.28.ISBN1-56238-508-9。VerificationandValidationofMultiplexNucleicAcidAssays;ApprovedGuideline.ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.NCCLS,MM17-A,Vol.28No.9,ISBN1-56238-661-1oTranslatingCancerGenomesandTranscriptomesforPrecisionOncology.CA:ACancerJournalforClinicians,2016,66:75-88.附錄名詞解釋.脫氧核糖核酸（DNA）核酸的一種。是由特殊序列的脫氧核糖核苷酸單元（dNTP）構(gòu)成的多聚核苷酸，起攜帶遺傳信息的功能。DNA為一種雙鏈分子，通過核苷酸堿基對間較弱的氫鍵維系。DNA包含的4中核苷酸包括：腺嘌吟（A）、鳥嘌吟（6）、胸腺嘧啶（T）和胞喀啶（G）。人類存在兩種類型的DNA:來自細(xì)胞何種染色體的基因組DNA（gDNA）和線粒體DNAo.核糖核酸（RNA）核酸的一種。是與DNA類似的單鏈核酸，由核糖核苷酸按照一定的順序排列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成和其他化學(xué)活動中起重要的作用。RNA分子包含信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）和其他小RNA等多種類型，分別行使