典型發(fā)酵過程的特性與工業(yè)控制

典型發(fā)酵過程的特性與工業(yè)控制第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日第二節(jié)動物細胞培養(yǎng)第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日動物細胞和微生物細胞的總體差異內(nèi)容微生物細胞動物細胞細胞壁普遍存在存在生長速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營養(yǎng)要求普遍簡單復雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~2000nm10000~100000nm接種濃度低高（10-5.ml-1）生長濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、動物細胞培養(yǎng)的特性動物細胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動物細胞離體生長和增殖，并保持其特性和功能的技術，這些細胞不再形成組織。第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日

1細胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應性差

3需氧少，不耐受強力通風與攪拌

4群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）

5培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內(nèi)外，成本高

6原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡

第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日兩個專業(yè)術語細胞系：首次分離組織的培養(yǎng)稱之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細胞系。細胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標記的培養(yǎng)物稱為細胞株。第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日細胞生長的類型貼壁依賴性來自動物實體組織的大多數(shù)細胞需要貼壁單層生長。只要它們沒有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長。非貼壁依賴性細胞無需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長的細胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的細胞和大多數(shù)腫瘤細胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈圓形。第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日生長特性：貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。

第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

●容易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當細胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細胞將更有效的表達一種產(chǎn)品。

●同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。

●適用于所有類型細胞。

第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日.貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細胞的生長；

第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細胞培養(yǎng)物的獲得原代培養(yǎng)物在無菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個細胞，放入培養(yǎng)容器中無菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細胞類型，它們的生長速率不同，成纖維細胞最易生長，常會在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢。仔細控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細胞類型的生長。第十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化細胞正常細胞經(jīng)過一個轉(zhuǎn)化的過程，喪失了對生長控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細胞對貼壁的依賴及細胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細胞仍需貼壁生長，但可能生長到不止單層。細胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：①有些細胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化②化學轉(zhuǎn)化。某些化學致癌物會增加轉(zhuǎn)化頻率③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化細胞由于有無限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用于生成生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對她們的安全性仍然非常關心，對可能造成的生物危害性進行嚴格的檢測和控制。第十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日腫瘤細胞腫瘤細胞使來自于腫瘤組織的細胞或經(jīng)腫瘤細胞與其它細胞融合產(chǎn)生的細胞，如雜交瘤細胞。與轉(zhuǎn)化細胞相比，它們是惡性的，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細胞有很好的增殖特性，生長速率高。對生長因子的依賴程度低，對培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。。腫瘤細胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來分離純化技術的進步和對這些細胞致瘤性的深刻認識，對其在生產(chǎn)中的應用有所松動，如雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，C127細胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)所需的一般條件適宜的培養(yǎng)皿血清成分370CCO25％95～100％濕度抗生素第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細胞系在pH7.4下生長得很好。一些正常的成纖維細胞系以7.4~7.7最好，轉(zhuǎn)化細胞系以pH7.0~7.4更合適。緩沖在高細胞密度下，轉(zhuǎn)化細胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。黏度培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚己烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)基的基本組成1、水細胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來配置，對水的純度要求很高。通常細胞培養(yǎng)用水的污染物標準可參考醫(yī)藥上注射用水標準，單原則上應高于注射用水標準。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲細胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問題是它的自發(fā)降解，降解量與時間、溫度、血清和磷酸濃度有關，降解產(chǎn)物為氨，對細胞有毒性。第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、氮源氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細胞合成復雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類的細胞對氨基酸的種類和濃度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，還有12種氨基酸不能在細胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時常會增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日4、維生素維生素是維持細胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細胞中多形成酶的輔基或輔酶，對細胞的代謝過程有重要影響。5、無機離子無機離子分為兩組，一種是含量較高的，，包括維持膜電勢的（Na+，K+），維持滲透壓平衡（Na+，Cl－），作為酶的輔因子（Mg2+），促進細胞貼附（Mg2+Ca2+），起緩沖作用（HPO42-，HCO3-）；另一種勢微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日6、脂類和磷脂前體在使用血清的細胞培養(yǎng)中，脂類來自血清，在無血清培養(yǎng)中，有些細胞需要添加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細胞，對某種脂類有很高的依賴性。非營養(yǎng)性物質(zhì)1、抗生素細胞培養(yǎng)中，特別是原代細胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH緩沖劑最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/L，接近血中濃度，必須與5％～10％CO2平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。HEPES是緩沖能力很強的化合物，但由于它相當昂貴，細胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基的pH指示劑4、保護劑細胞保護劑指保護細胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應器中培養(yǎng)的細胞會受到機械攪拌和氣泡運動所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。5、還原劑某些還原劑在細胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進胱氨酸利用。第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是極其復雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設計的，使用血清技術也很成熟，盡管使用血清有許多缺點，仍將其作為細胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、細胞計數(shù)及活力測定

培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。

第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。

用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區(qū)分死細胞與活細胞。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應，也可測定細胞相對數(shù)和相對活力。

第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動性大，如果培養(yǎng)操作場地于外界隔離不嚴格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進入造成污染。因此，培養(yǎng)設施不能設在通風場所。無菌操作應在凈化臺內(nèi)進行，工作時要帶口罩

第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日2器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實驗操作無菌觀念不強，技術不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生產(chǎn)時就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細胞或培養(yǎng)液中，影響細胞細胞生長。

第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是細胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動物細胞，其最適的生長溫度不同。例如昆蟲細胞的最適溫度是25～280C，人和哺乳動物細胞的最適溫度是370C，細胞代謝強度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導致死亡。第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日2、pH大規(guī)模培養(yǎng)時影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：（1）緩沖液的緩沖能力及種類（2）對流空間大?。?）葡萄糖濃度培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pK為6.1，低于生理學最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對流空間加入CO2以防止它的丟失及增加羥基離子。第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對動物細胞有毒害作用。HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是由于HEPES的pK為7.0，HEPES被加入后，其緩沖能力為pH6.8～7.2。。但是當HEPES濃度高于25mmol/L時，它對大多數(shù)動物細胞都有毒害作用。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)時常有幾種方法來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH：（1）在培養(yǎng)基中添加NaHCO3作為緩沖劑及通入含CO2的空氣進行調(diào)節(jié)第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進行調(diào)節(jié)。由于動物細胞培養(yǎng)時要求低攪拌和弱混合，利用NaOH或HCl進行調(diào)節(jié)時會發(fā)生局部過酸或過堿的現(xiàn)象，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動物細胞培養(yǎng)時不太合適。通常通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中CO2濃度來控制發(fā)酵過程的pH。第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得目的有兩個：一是提供細胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)容器1、多孔板、Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時放在滾瓶機上緩慢滾動，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積交大，接種后放入溫室或?qū)ｉT的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細胞時，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應器是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設備。它有各種不同形式，容積可以從1升到幾十立方米。第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日微載體微載體是指直徑在60～250μm、適合于動物細胞貼附和生長的微珠。微載體法培養(yǎng)動物細胞有很多好處;①可在反應器中提供大的比表面積②可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了各種環(huán)境因素的檢測和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性③可用普通顯微鏡觀察細胞在微載體上的生長情況④容易放大⑤適合于多種貼壁依賴性細胞培養(yǎng)⑥容易收獲細胞。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點是：①細胞生長在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細胞生長②微載體價格較貴，一般不能重復使用③需要較高的細胞接種量。第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長的過程，主要用于非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等。動物細胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較接近，但由于動物細胞對攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應器的設計和操作上又有特殊要求如利用螺旋帶葉輪減小生物反應器培養(yǎng)過程中的剪切作用，并通過表面充氣及誘導表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日目前，動物細胞培養(yǎng)用生物反應器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應器、多層板反應器、螺旋膜反應器、管式螺旋反應器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應器、流化床反應器、中空纖維及其它膜式反應器、攪拌反應器、氣升式反應器等。第三十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日細胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應器氣升式生物反應器氣升式生物反應器與其它反應器相比，結(jié)構(gòu)簡單，無轉(zhuǎn)動部件，細胞損傷率低，減少了污染的機會；產(chǎn)生的湍動溫和而均勻，剪切力相當??；當大容易；直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細胞和營養(yǎng)成分混合均勻。存在問題：由于液體混合的能量唯一來自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴重的細胞機械損傷第三十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日通氣攪拌生物反應器根據(jù)動物細胞培養(yǎng)的特點，要求攪拌器轉(zhuǎn)動時混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設計有多種形式的攪拌器，應用最多的是籠式攪拌器。籠式攪拌器有兩個由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部的是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進行，其中的液體通過絲網(wǎng)與腔外的液體進行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細管進入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應器中積累。

第三十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日攪拌器有三個導流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當導流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動時，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再從三個導流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細胞或貼附有細胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復循環(huán)，充分混合。在微載體法培養(yǎng)貼壁動物細胞時，一般攪拌轉(zhuǎn)速在30～60r/min范圍內(nèi)，混合時間為12～24s。第四十頁，共四十五頁，2022年，8月28日中空纖維生物反應器用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細胞近似生理條件的體外生長微環(huán)境，使細胞不斷生長。中空纖維是一種細微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細胞利用；細胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，