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第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。

(Restrictionendonuclease)2.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護(hù)作用3.功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)(R/M體系)1.來源由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象---20世紀(jì)60年代,Linn和Arber發(fā)現(xiàn)(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn):切酶。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí),由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列,被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列,但可在EcoB甲基化酶的作用下,催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基,使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng)(B)(B)酶切位點(diǎn)不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點(diǎn)被修飾基因組DNA不被切割Ⅰ型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型Ⅱ型限制性內(nèi)切酶

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶IV型限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性

特性1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中

I型雙功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)5‘端至少1000bp不是(隨機(jī))無用

II型限制酶和修飾酶分開單一成分

Mg2+位于識(shí)別位點(diǎn)上是非常有用

III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處是用處不大1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng),命名原則如下:三、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名,組成酶的基本名稱。大腸桿菌(Escherichiacoli)用Eco表示;流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示2.

如果酶存在于一種特殊的菌株中,則將該菌株名的第一個(gè)字母加在基本名稱后,若酶的編碼基因位于噬菌體(病毒)或質(zhì)粒上,則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ:d菌株

EcoRI:抗藥性R質(zhì)粒

3.如果一種特殊殊的菌株內(nèi)有有幾種不同的的限制與修復(fù)復(fù)系統(tǒng),用羅羅馬字母表示示該菌株中發(fā)發(fā)現(xiàn)某種酶的的先后次序。如HindⅡ:d菌株中發(fā)現(xiàn)的的第二個(gè)酶4.所有的限制酶酶,除以上名名稱外還要冠冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切切酶的系統(tǒng)命命名為R,甲基化酶為為M。如R.HindⅢ表示限制性內(nèi)內(nèi)切酶M.HindⅢ表示相應(yīng)的甲甲基化酶實(shí)際應(yīng)用中,,R常被省略。首先由和在1970年從流感嗜血血菌中分離出出來。(1)識(shí)別位點(diǎn)序序列未甲基化修飾飾的雙鏈DNA上的特殊靶序序列(多數(shù)是是呈典型的旋旋轉(zhuǎn)對稱型的的回文結(jié)構(gòu)))4-6bp。與DNA的來源無關(guān),,即沒有種的特特異性。四.Ⅱ類類限制性內(nèi)內(nèi)切酶的基基本特性分離的第一一個(gè)酶是HindⅡ稀有切割限限制酶(rarecutter)可以識(shí)別6個(gè)以上的核核苷酸序列列的少數(shù)的的限制內(nèi)切切酶。如NotI(GCGGCCGC)某些限制性性內(nèi)切酶的的識(shí)別序列列中,某一一個(gè)或兩個(gè)個(gè)堿基并非非嚴(yán)格專一一。如HindⅡ可識(shí)別4種核苷酸序序列:Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端(2)切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA,形成粘性末端(stickyend)或平齊末端(bluntend)。如:識(shí)別位點(diǎn)處處含有幾個(gè)核核苷酸單鏈的末端。分兩種類型型:GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端(stickyends,cohensiveends)?。?’端凸出(如如EcoRI切點(diǎn))CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTCⅱ)3’端凸出((如PstI切點(diǎn))i)不同的DNA雙鏈:只要粘性性末端堿堿基互補(bǔ)補(bǔ)就可以以連接。。這比連接接兩個(gè)平平齊末端端容易得得多。[2]粘性末端端的意義義①連接便利利ii)同一個(gè)DNA分子內(nèi)連連接:通過兩個(gè)個(gè)相同的的粘性末末端可以以連接成成環(huán)形分子子。[3]平齊末端端(bluntend)在識(shí)別序序列的對稱軸上上同時(shí)切割割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV不同來源源的酶,,識(shí)別相同同的序列列,切割方式式相同或或不同。。識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)和切點(diǎn)點(diǎn)完全相相同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶((Isoschizomer)①完全同裂裂酶:XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)相同,,但切點(diǎn)點(diǎn)不同。。如XmaI和SmaI。②不完全同同裂酶::識(shí)別的序序列不同同,但能能切出相同同的粘性性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤呤;Y代表嘧啶啶。[6]同尾酶(Isocaudamers)限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的識(shí)別和和酶切活活性一般般在一定定的溫度、離離子強(qiáng)度度、pH等條件下下才表現(xiàn)現(xiàn)最佳切切割能力力和位點(diǎn)點(diǎn)的專一一性。如果改變變反應(yīng)條條件就會(huì)會(huì)影響酶酶的專一性和和切割效效率,稱為星星號(hào)(*)活性性。所以一般般使用專專一的反反應(yīng)緩沖沖液。影響限制制酶的酶酶活性的的因素星號(hào)(*)活性性EcoRI和BamHI等都有*活性。。在低鹽、、高pH(>8)時(shí)可識(shí)識(shí)別和切切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI:使用的時(shí)候要要特別注意??!7誘發(fā)星號(hào)(*)活性的原原因?。└吒视秃苛竣ⅲ﹥?nèi)切酶用量量過大ⅲ)低離子強(qiáng)度度ⅳ)高pHⅴ)含有機(jī)溶劑劑,如乙醇ⅵ)Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二價(jià)陽離子子的存在酶量不宜過多多,盡量遵循循生產(chǎn)商推薦薦的反應(yīng)條件件從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測測,必定存在在一種能把兩兩條DNA雙鏈連接到一一起的酶。第二節(jié)DNA連接接酶一、DNA連接酶(ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷斷口DNA連接酶:一種能夠催化化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶1967年,世界上數(shù)數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)讕缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了一種能夠夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶,即DNA連接酶。(1)大腸桿菌連連接酶1.兩種共價(jià)連接接DNA限制片段的DNA連接酶連接粘性末端,準(zhǔn)確性高,NAD+齊平末端,效效率低二、DNAligase的特點(diǎn)(2)T4噬菌體的連接接酶不但能連接粘粘性末端;還還能連接齊平平末端DNA-DNARNA-RNADNA-RNAATP(1)必須是雙鏈DNA(2)DNA3’端有游離的-OH,5’端有一個(gè)磷酸酸基團(tuán)(P)(3)需要能量ATP或NAD+2.DNA連接酶催化的的連接反應(yīng)特特點(diǎn)(4)只能連接缺缺口(nick),不能連接裂口口(gap)。是兩條鏈-因此不能將兩兩條單鏈連接接起來或使單單鏈環(huán)化起來來。OHP××××是相鄰的-因此只能封閉閉nick.不能封閉gapgapNONickOK三、DNA連接酶酶的反應(yīng)條件件Tris-HCl50-100mM,pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃,4-16hr1.反應(yīng)溫度理論37℃黏性末端:12~16℃平頭末端:10~20℃2.ATP濃度一般,ATP最適的終濃度度為0.5mmol/L.ATP濃度高至5mmol/L,影響平頭末末端的連接ATP濃度高至7.5mmol/L,抑制粘性末末端及平頭末末端的連接。。四、影響連接接反應(yīng)的因素素3連接酶的濃度度:平末端DNA分子的連接反反應(yīng)中,最適適1~2個(gè)單位。粘性末端DNA片段之間的連連接,0.1個(gè)單位。時(shí)間:16℃4小時(shí)4℃過夜增加插入片段段與載體的接接觸機(jī)會(huì),減減少同一個(gè)分分子末端自我我連接的現(xiàn)象象。4.DNA末端的濃度3:1插入片段與載載體的濃度比比例兩種構(gòu)型:線線狀分子和環(huán)環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長度相關(guān)注意事項(xiàng):10xLigationBuffer含有ATP,使用前應(yīng)在在室溫放置至至融化或用手掌溫度輔助融化,然然后置于冰上上。不要加熱熱融化以免ATP降解。T4DNALigase對熱敏感,容容易失活。使使用時(shí)請放置冰上,用后立即置置冰箱中冷凍保存。。第三節(jié)DNA聚合酶酶和反轉(zhuǎn)錄酶酶DNA聚合酶(DNApolymerase)能在引物和模板的存在下,把把脫氧核糖多多核苷酸連續(xù)續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端,催化核核苷酸的聚合合作用.一、基因工程程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶7.TaqDNA聚合酶1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引引物的3’-OH端2.主要要區(qū)區(qū)別別T7DNA聚合合酶酶可以以連連續(xù)續(xù)添添加加數(shù)數(shù)千千個(gè)個(gè)dNTPs而不不從從模模板板上上掉掉下下來來。。有的的DNA聚合合酶酶只只能能連連續(xù)續(xù)添添加加10多個(gè)個(gè)dNTPs就會(huì)會(huì)從從模模板板上上解解離離下下來來。。二、、常常用用的的DNA聚聚合合酶酶的的特特點(diǎn)點(diǎn)持續(xù)續(xù)合合成成能能力力和和外外切切酶酶活活性性不不同同。。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常常用用DNA聚聚合合酶酶的的特特性性比比較較三、、DNA聚聚合合酶酶在在基基因因工工程程中中的的用用途途1.大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶Ⅰ主要要用用來來制制備備帶帶放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記的的DNA探針針((32P標(biāo)記記))。。(1)大大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶Ⅰ的性性質(zhì)質(zhì)①一一條條單鏈鏈多多肽肽②5’’3’’外切切酶酶活活性性位位于于N端③用用枯草草桿桿菌菌蛋蛋白白酶酶處理理可可以以切切掉掉N端的的5’’3’’外切切酶酶活活性性部分分,就成成為為Klenowfragment。2.Klenowfragment具有有5’’3’’聚合合酶酶活活性性和和3’’5’’外切切酶酶活活性性。。((失去去了了5’’3’’外切切酶酶活活性性)。。(1)Klenowfragment的性性質(zhì)質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD)枯草草桿桿菌菌蛋蛋白白酶酶①3’’端補(bǔ)補(bǔ)平平5’’5’’klenow②DNA3’’末末端端標(biāo)標(biāo)記記補(bǔ)平平限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切酶酶切切后后形形成成的的3’’隱蔽蔽端端。在3’’隱蔽蔽端端加上上放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記的的dNTP。klenow(2))主主要要用用途途3’’隱蔽蔽末末端端的的DNA片斷斷Klenowfragment補(bǔ)平平根據(jù)據(jù)末末端端的的順順序序選選擇擇一一種種-32P-dNTPs末端端標(biāo)標(biāo)記記的的DNA限制制性性內(nèi)內(nèi)切切酶酶切切5’’----G3’’3’’----CTTAA5’’5’’----GAA3’’3’’----CTTAA5’’5’’----GAATT3’’3’’----CTTAA5’’5’’----G3’’3’’----CCTAG5’’5’’----GG3’’3’’----CCTAG5’’5’----GGATC3’’3’----CCTAG5’’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h③cDNA第第二鏈鏈的合合成mRNA逆轉(zhuǎn)錄錄cDNA第二鏈鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物(1)T4DNA聚合酶酶的性性質(zhì)3.T4DNA聚合合酶從T4噬菌體體感染染后的的大腸腸桿菌菌培養(yǎng)養(yǎng)物中中分離離純化化,由由噬菌體體基因因43編碼。。有5’3’聚合酶酶活性性和3’5’外切酶酶活性性(降降解單單鏈更更快))。①來來源②酶酶活性性③特特點(diǎn)A當(dāng)沒有有dNTP時(shí),T4DNA聚合酶酶行使使3’5’外切酶酶功能能,制制造出出3’隱蔽端端。B如果只只有一一種dNTP,則降降解到到該dNTP的位置置。C在四種種dNTP均存在在時(shí),,聚合合活性性占主主導(dǎo)地地位。。5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶酶無dNTPsT4DNA聚合酶酶有dNTPs5’5’(2))T4DNA聚聚合酶酶的用用途標(biāo)記末末端((取代代合成成法或或置換換合成成法))用3’5’’外切酶酶活性性作用用于所有末末端形形式的的3’端(平端端、3’隱蔽端端、5’隱蔽端端)制制造出出3’隱蔽端端。再利用用它的的5’3’’聚合酶酶活性性補(bǔ)平平,并并加入入放射射性標(biāo)標(biāo)記的的dNTP。①補(bǔ)補(bǔ)平隱隱蔽末末端②DNA3’末端標(biāo)標(biāo)記4.T7DNA聚合合酶(1)來源源從T7噬菌體體感染染大腸腸桿菌菌細(xì)胞胞中純純化出出來的的,由由兩個(gè)個(gè)亞基基組成成:①T7噬菌體體基因因5編碼的的大亞亞基::T7噬菌體體5蛋白有5’3’聚合酶酶和3’5’外切酶酶活性性。②大大腸桿桿菌編編碼的的小亞亞基::硫氧還還蛋白白增加大大亞基基對模板的的親和和性。(2))T7DNA聚合合酶的的特點(diǎn)點(diǎn)①持持續(xù)合合成能能力強(qiáng)強(qiáng)一旦與與模板板結(jié)合合就會(huì)會(huì)不間間斷地地合成成互補(bǔ)補(bǔ)鏈。。②3’5’外切酶酶活性性高單鏈和和雙

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