《基因工程》第二章工具酶

第二章:基因工程工具酶主講教師:楊應(yīng)斌答疑QQ號:715656164基因工程一、DNA限制性內(nèi)切酶二、甲基化酶三、分子克隆過程中所需要的另一些酶Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）發(fā)現(xiàn)了噬菌體λ的限制作用各種細(xì)菌都能合成一種或幾種順序?qū)Ｒ坏暮怂醿?nèi)切酶。這些酶切割DNA的雙鏈，因?yàn)樗鼈兊墓δ芫褪乔懈頓NA，限制外源性DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，所以稱這種核酸內(nèi)切酶為限制酶。合成限制酶的細(xì)胞自身的DNA可以不受這種酶的作用，因?yàn)榧?xì)胞還合成了一種修飾酶，它改變了限制酶識別的DNA順序的結(jié)構(gòu)，使限制酶不能起作用。目前，從各種生物中分離出的限制性內(nèi)切酶已接近200種，其中80多種是切割DNA雙鏈。（一）命名原則限制性內(nèi)切酶主要是從原核生物中提取的。現(xiàn)在通用的命名原則是：屬名種名株名如果同一菌株中有幾種不同的內(nèi)切酶時(shí)，則分別用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……來代表。Haemophilusinflueuzaed酶名HindIIIEscherichiacoliRY13EcoRⅠ（二）分類和特性第二類限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文順序,如EcoRI的識別順序?yàn)椋?’……G*A-A-T-T-C……3’3’……C-T-T-A-A*G……5’討論:下面的序列中可能含有多少個潛在的酶切位點(diǎn)?GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA132654一、DNA限制性性內(nèi)切切酶二、甲甲基化化酶三、分分子克克隆過過程中中所需需要的的另一一些酶酶二、甲甲基化化酶限制-修飾系系統(tǒng)中中的修修飾作作用是是由甲甲基化化酶（（methylase）來完完成的的。甲甲基化化酶同同限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶具有有完全全相同同的識識別順順序。。甲基基化酶酶使識識別順順序中中的某個堿堿基發(fā)發(fā)生甲甲基化化，保護(hù)護(hù)DNA不被限限制性性內(nèi)切切酶切切開。。DNA甲基化化酶普普遍存存在于于原核核和真真核生生物中中，能能將S-腺苷甲甲硫氨氨酸上上的甲甲基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到腺嘌嘌呤或或者是是胞嘧嘧啶上上。在原核核生物物中，，DNA甲基化化酶作作為限限制修修飾系系統(tǒng)的的一個個組成成部分分廣泛泛存在在，它它們的的作用用是保保護(hù)宿宿主菌菌不被被相應(yīng)應(yīng)的限限制性性內(nèi)切切酶切切割。。大多多數(shù)實(shí)實(shí)驗(yàn)室室使用用的大大腸桿桿菌包包括三三種位位點(diǎn)特特異性性的DNA甲基化化酶。。由dam基因（（Dam甲基化化酶））編碼碼的甲甲基化化酶能能將甲甲基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到GATC序列中中的腺腺嘌呤呤N6位點(diǎn)上上。由dcm基因編編碼的的Dcm甲基化化酶，，能在在CCAGG和CCTGG序列內(nèi)內(nèi)部的的胞嘧嘧啶C5位置上上甲基基化。。EcoKI甲基化化酶，，可將將AAC（N6A）GTGC和GCAC（N6A）GTT上的腺腺嘌呤呤進(jìn)行行甲基基化修修飾。。(1)原核生生物ＤＤＮＡＡ甲基基化如果限限制性性內(nèi)切切酶的的識別別位點(diǎn)點(diǎn)是從從表達(dá)達(dá)Dam或Dcm甲基化化酶的的菌株株中分分離而而得，，并且且其甲甲基化化識別別位點(diǎn)點(diǎn)與內(nèi)內(nèi)切酶酶識別別位點(diǎn)點(diǎn)有重重疊，，那么么該限限制性性內(nèi)切切酶的的部分分或全全部酶酶切位位點(diǎn)有有可能能不被被切割割。例如，，從dam+E.coli中分離離的質(zhì)質(zhì)粒DNA完全不不能被被識別別序列列為GATC的MboI所切割割。E.coli菌株株中中的的DNA甲基基化化程程度度并并不不完完全全相相同同。。pBR322DNA能被被完完全全修修飾飾（（因因此此完完全全不不能能被被MboI切割割）），，而而λDNA只有有大大約約50%的Dam位點(diǎn)點(diǎn)被被甲甲基基化化，，這這是是因因?yàn)闉樵谠讦薉NA被包包裝裝到到噬噬菌菌體體頭頭部部之之前前，，甲甲基基化化酶酶還還沒沒來來得得及及將將DNA完全全甲甲基基化化。。因因此此，，被被Dam或Dcm甲基基化化完完全全阻阻斷斷的的酶酶卻卻能能對對這這些些λDNA進(jìn)行行部部分分切切割割。。被Dam或Dcm甲基基化化的的限限制制性性位位點(diǎn)點(diǎn)可可以以通通過過克克隆隆DNA至dam-/dcm-菌株株【如dam-/dcm-E.coli感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞（（NEB#C2925）】進(jìn)行行去去甲甲基基化化。。(1)真核核生生物物ＤＤＮＮＡＡ甲甲基基化化在高高等等真真核核生生物物（（如如Dnmt1）中中發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的的CpG甲基基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶（（CpGMTases），，將將甲甲基基基基團(tuán)團(tuán)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移至至胞胞嘧嘧啶啶殘殘基基上上的的C5位點(diǎn)點(diǎn)。。CpG甲基基化化形形式式受受遺遺傳傳因因素素的的影影響響，，具具有有組組織織特特異異性性，，并并與與基基因因表表達(dá)達(dá)相相關(guān)關(guān)。。因因此此，，我我們們推推測測CpG甲基基化化在在基基因因分分化化和和表表達(dá)達(dá)中中起起了了一一定定的的作作用用。。在消消化化真真核核基基因因組組DNA時(shí)尤尤其其要要關(guān)關(guān)注注CpG甲基基化化的的影影響響。。需需要要注注意意的的是是，，一一旦旦DNA被克克隆隆到到宿宿主主菌菌中中，，將將不不存存在在CpG甲基基化化形形式式。。一、、DNA限制制性性內(nèi)內(nèi)切切酶酶二、、甲甲基基化化酶酶三、、分分子子克克隆隆過過程程中中所所需需要要的的另另一一些些酶酶（一一））DNA聚合合酶酶（二二））RNA聚合合酶酶（三三））反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶（四四））核核酸酸外外切切酶酶（五五））核核酸酸酶酶S1（六六））DNA酶（七七））RNA酶（八八））連連接接酶酶（九九））末末端端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶（十十））堿堿性性磷磷酸酸酶酶（一一））DNA聚合合酶酶（DNapolymerase）的的作作用用是是將將1個脫脫氧氧三三磷磷酸酸核核苷苷酸酸加加到到引引物物（（primer）的的3’’-OH上，，釋釋放放出出一一個個焦焦磷磷酸酸分分子子（（ppi)聚合合酶酶主主要要有有以以下下兩兩種種種種：：1．大大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶Ⅰ2．噬噬菌菌體體DNA聚合合酶酶1．大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶（E.ColiDNApolymerase）主主要要有有3種作作用用：：①5’’→→3’’的聚聚合合作作用用。。但不不是是復(fù)復(fù)制制染染色色體體而而是是修修補(bǔ)補(bǔ)DNA，填填補(bǔ)補(bǔ)DNA上的的空空隙隙或或是是切切除除RNA引物物后后留留下下的的空空隙隙。。②3’’→→5’’的外外切切酶酶活活性性。。消除除在在聚聚合合作作用用中中摻摻入入的的錯錯誤誤核核苷苷酸酸。。③5’→3’外切酶活活性。切除受損損傷的DNA。大腸桿菌菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完完整的DNA聚合酶Ⅰ的一個片片段，只只有在5’→3聚合酶活活性和3’→5’外切酶活活性，失失去了5’→3外切酶活活性。2．噬菌體體DNA聚合酶這里以T4DNA聚合酶為為例。它它也具有有5’→3聚合酶活活性，但但它的外外切酶活活性比大大腸桿菌菌的要高高200倍。因此此，它也也可用來來補(bǔ)齊單單鏈末端端或標(biāo)記記同位素素。催化轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶是是一種由由多個蛋蛋白亞基組成的復(fù)復(fù)合酶。。（二）RNA聚合酶真核生物物的RNA聚合酶真核生物物的RNA聚合酶分分三類：：RNA聚合酶Ⅰ存在于核核仁中，，轉(zhuǎn)錄rRNA順序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核核質(zhì)中，，轉(zhuǎn)錄大大多數(shù)基基因，需需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核核質(zhì)中，，轉(zhuǎn)錄很很少幾種種基因如如tRNA基因如5SrRNA基因。（三）反反轉(zhuǎn)錄酶酶反