鑒定山羊傳染性胸膜肺炎病原的生物學方法綜述,畜牧獸醫(yī)論文

鑒定山羊傳染性胸膜肺炎病原的生物學方法綜述,畜牧獸醫(yī)論文內(nèi)容摘要：山羊傳染性胸膜肺炎(contagiouscaprinepleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,MCCP)引起的山羊急性或慢性呼吸道傳染病,其病原MCCP的分離培養(yǎng)困難,同絲狀支原體簇其他成員之間具有類似的生化和血清學性質(zhì),因而用傳統(tǒng)的病原學和血清學方式方法無法對其進行準確鑒定。而基于PCR的分子檢測技術(shù),憑借其特異性高和敏感性強等眾多優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于疾病的早期臨床診斷。本文綜述了CCPP的分子診斷方式方法,以期為該病的防治提供技術(shù)參考。本文關(guān)鍵詞語：山羊傳染性胸膜肺炎;山羊支原體山羊肺炎亞種;病原;分子診斷方式方法;Abstract：Contagiouscaprinepleuropneumonia(CCPP)ingoatsiscausedbymycoplasmacapricolumsubsp.Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae(MCCP)isanacuteorchronicrespiratoryinfectiousdiseasewhosepathogensaredifficulttoisolateandculture.Similaritytothebiochemicalandserumpropertiesoftheothermembersofthefiliformmycoplasmafamilymakesitimpracticaltopreciselyidentifythepathogen.However,PCR-basedmoleculardetectiontechnology,withitsadvantagesofhighspecificity,sensitivity,andsoon,hasbeenwidelyappliedtoearlyclinicaldiagnosisofdiseases.ThispapersummarizestheexistingdiagnostictechniquesforCCPP,providingtechnicalreferencesforpreventionandtreatmentofthisdisease.Keyword：contagiouscaprinepleuropneumonia;Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae;pathogen;moleculardiagnosis;山羊傳染性胸膜肺炎(contagiouscaprinepleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumonia,Mccp)引起的一種接觸性傳染病,其死亡率和發(fā)病率高達60%和90%,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的疫病之一[1]。早在1873年,國外就有關(guān)于CCPP的記載,但對其病原的認識一直比擬模糊[2]。直到100多年后的1976年,McOwan等[3]分離到1株病原體Mccp,并證明了其致病性。國內(nèi)在分離到Mccp之前,有學者從患CCPP的山羊肺臟中分離出絲狀支原體山羊亞種(M.mycoidessubsp.capri.,Mmc)和綿羊肺炎支原體(M.ovipneumoniae,MO)[4]。此后一直以為二者是CCPP的主要病原[5-6]。造成這種對病原認識不清的主要原因是由于Mccp的分離培養(yǎng)比擬困難、對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求特別苛刻,加上病料中其他支原體如綿羊肺炎支原體(MO)生長迅速,掩蓋了Mccp的生長[7]。2007年,辛九慶等[8]從山羊肺炎病料中成功分離出1株支原體,利用分子生物學方式方法對其進行了基因特征比擬,證明分離到的支原體為Mccp,這是國內(nèi)初次報道從臨床病例中分離到Mccp。李媛等[9]利用PCR技術(shù)、限制性酶切和序列分析等手段對中國早期分離的4株CCPP病原進行分子特征研究,初次提出其與Mccp親緣關(guān)系近期,并將國內(nèi)流行的CCPP病原定為Mccp。2018年,郭晗[10]從甘肅患CCPP的山羊體內(nèi)分離到1株純培養(yǎng)物M1601,通過分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、生化試驗、PCR鑒定和人工感染試驗,證明其屬于Mccp。然后根據(jù)16SrRNA基因和5個看家基因進行分子進化分析,進一步從分子水平證明M1601株為Mccp,進而獲得了Mccp甘肅分離株M1601。這些結(jié)果證明了CCPP在我們國家流行,危害我們國家養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)。在臨床病理學上,CCPP很難與小反芻獸疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)等引起的山羊呼吸道異常感覺和狀態(tài)區(qū)分開[11]。除此之外,由絲狀支原體(M.mycoides)和山羊支原體山羊亞種(M.capricolumsubsp.caprcolum)引起的乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜炎、肺炎和敗血癥(MAKePS)與CCPP具有類似的臨床異常感覺和狀態(tài)[11-12]。因而,CCPP的診斷極為復(fù)雜,除病原學和血清學診斷以外,還需結(jié)合其他方式方法進行確診。分子生物學的發(fā)展,尤其是近年來發(fā)展起來的各種PCR方式方法,為病原的快速診斷提供了理論根據(jù)和技術(shù)支持。用分子生物學方式方法鑒定CCPP病原,最初是用Cap-21基因探針雜交從絲狀支原體簇成員中鑒別出Mccp/Mcc,然后用F38-12基因探針從Mccp/Mcc中鑒定Mccp[13]。由于該方式方法操作步驟復(fù)雜,已被各種愈加方便快速的PCR診斷技術(shù)所代替?，F(xiàn)將主要的6種方式方法進行詳細介紹。1、聚合酶鏈式反響(polymerasechainreac-tion,PCR)PCR技術(shù)的發(fā)展在很大程度上促進了獸醫(yī)工作者對各種流行病病原的認識,該技術(shù)能夠從混合培養(yǎng)物、或者直接從臨床病料組織如胸腔積液、肺臟以及帶有這些組織的枯燥濾紙片上快速檢出支原體。Woubit等[12]以MccparcD基由于靶標序列,設(shè)計特異性引物Mccp-spec-F/R(擴增片段大小為318bp),以Mccp不同菌株、其他絲狀支原體簇成員以及腐敗支原體的基因組DNA為模板進行PCR擴增,結(jié)果只要在Mccp各菌株中擴增出目的片段,證明該方式方法能夠特異性鑒定Mccp。2018年,儲岳峰等[14]采用PCR技術(shù)從患病山羊肺組織和胸水中直接檢出Mccp,從病原學上證實CCPP在我們國家流行。由于多殺性巴氏桿菌、小反芻獸醫(yī)病毒等可以引起類似CCPP的臨床異常感覺和狀態(tài),且容易與Mccp混合感染,因而,為了快速而準確地診斷CCPP病原,亢寧寧等[15]采用Mccp和多殺性巴氏桿菌特異性引物,建立了一種能同時檢測Mccp和多殺性巴氏桿菌的雙重PCR方式方法,檢測結(jié)果具有特異性好、敏感性高等特點。鑒于臨床上能引起類似CCPP疾病病原的復(fù)雜性,根據(jù)各病原特異性基因序列設(shè)計不同引物對,建立能夠同時檢測多種病原的多重PCR方式方法,將是快速、準確診斷CCPP病原的趨勢。2、聚合酶鏈式反響-限制性酶切分析(polymerasechainreaction-restrictionenzymeanalysis,PCR-REA)絲狀支原體簇所有成員均含2個rRNA操縱子,在2個操縱子的16SrRNA基因上存在序列變異[16],B9lske等[17]通過對絲狀支原體簇成員16SrRNA基因的2個操縱子序列進行比對分析發(fā)現(xiàn),Mccp的2個操縱子之間部分序列的變異會導(dǎo)致酶切位點發(fā)生變化,并根據(jù)該位點變異建立了一種用來鑒定Mccp的PCR-REA方式方法,PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶PstⅠ消化后,Mccp可產(chǎn)生特異性的限制性酶切帶型,由此能夠?qū)ccp與其他絲狀支原體簇成員加以區(qū)分。3、實時熒光定量PCR(real-timefluore-scencequantitativePCR,qPCR)與傳統(tǒng)PCR方式方法相比,qPCR對病原檢測的特異性和敏感性明顯提高,同時對實驗室和實驗人員的要求愈加嚴格,當前該方式方法主要用于專業(yè)實驗室對疾病的診斷工作。2004年,Woubit等[12]根據(jù)絲狀支原體簇成員的arcD基因序列差異建立了一種特異性鑒定Mccp的PCR方式方法。在該PCR方式方法的基礎(chǔ)上,Lorrenzon等[18]建立了一種用于檢測Mccp的qPCR方式方法,結(jié)果表示清楚,所建立的q方式方法(SYBRgreen法)在同樣的樣品條件下,較普通PCR的敏感性和特異性更強。但眾所周知,與SYBRgreen法相比,TaqMan探針法的特異性和敏感性更高層次,但截至當前,國內(nèi)外還沒有關(guān)于TaqMan探針qPCR檢測Mccp的報道。因而,本實驗室正在建立一種用于快速診斷CCPP病原的TaqMan探針qPCR方式方法。4、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisother-malamplification,LAMP)LAMP是2000年日本學者Notomi等[19]建立的一種核酸等溫擴增技術(shù),與普通PCR相比,具有簡單、快速、敏感、特異和不需要特殊儀器設(shè)備等特點。當前,LAMP技術(shù)已廣泛用于疾病診斷、病原微生物檢測和轉(zhuǎn)基因食品的鑒定[20-22]。謝秀蘭等[23]以絲狀支原體簇16SrRNA基由于靶序列,設(shè)計4條特異性引物,建立了快速檢測絲狀支原體簇的LAMP方式方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方式方法能夠?qū)z狀支原體簇各成員進行LAMP擴增,而對綿羊肺炎支原體及羊的其他病原體不發(fā)生反響,對絲狀支原體山羊亞種PG3檢測的最低限為10pg/L,講明所建立的LAMP方式方法特異性強、敏感性高。為了從絲狀支原體簇中快速檢測出Mccp,He等[24]以MccpH2基因序列為模板設(shè)計4條特異性引物,建立了檢測Mccp的LAMP方式方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mccp與絲狀支原體簇其他菌株無穿插反響,且每個反響能檢測出約0.75fg的Mccp基因組DNA,而普通PCR只能檢出750pg的Mccp基因組DNA。由此表示清楚所建立的方式方法特異性和敏感性較好,可用于CCPP流行病學的診斷和調(diào)查。5、恒溫隔絕式PCR(insulatedisothermalPCR,iiPCR)2002年,Krishnan等[25]發(fā)明了以POCKITTM核酸分析儀(POCKITTMNucleicAcidAnalyzer)為操作儀器的核酸等溫擴增技術(shù),iiPCR。它實現(xiàn)了用分子生物學方式方法檢測病原的快速化和便捷化。其原理是將R-tubeTM放入POCKITTM核酸分析儀內(nèi),通過底部加熱可使R-tubeTM內(nèi)的反響液自發(fā)構(gòu)成對流運動,即底部溫度高的液體因密度小而上浮,上部溫度低的液體因密度大而下沉,如此循環(huán)往復(fù),以實現(xiàn)普通PCR的變性、退火和延伸等步驟。除此之外,該方式方法還引入了熒光水解探針技術(shù),通過集成在儀器中的數(shù)據(jù)處理模塊,在42min內(nèi)自動產(chǎn)生熒光信號,并將其轉(zhuǎn)換成陽性(+)或陰性(-)判讀結(jié)果。華而不實,四通道POCKITTM核酸分析儀(POCKITTMmicroplus,GeneReach,Taichung,Taiwan)具有小巧輕盈(自重只要380g)、操作簡單、反響時間短(整個iiPCR反響在42min內(nèi)便可完成)、便于攜帶、自帶電源(充電1次可用6h)、無需設(shè)置反響條件和無需瓊脂糖凝膠電泳檢測等優(yōu)點,實現(xiàn)了病原檢測的現(xiàn)場化和程序化,十分適用于疫病現(xiàn)場病原的快速診斷。該技術(shù)自2002年在Science雜志上報道以來,已用于豬瘟病毒[26]、豬流行性腹瀉病毒[27]、犬瘟熱病毒[28]、犬細小病毒[29]、馬流感病毒[30]、馬孢疹病毒[31]和牛輪狀病毒[32]等病原的快速檢測,同時也用于食品中沙門菌[33]的檢測。截至當前,國內(nèi)外還沒有用iiPCR方式方法檢測CCPP病原的報道。本實驗室前期利用arcD基因作為靶基因,設(shè)計了1套引物和探針,通過優(yōu)化反響條件,已初步建立了檢測CCPP病原的iiPCR方式方法,有望適用于臨床現(xiàn)場的快速檢測。6、重組酶聚合酶擴增(recombinasepolymer-aseamplification,RPA)近年來,核酸等溫擴增技術(shù)得到了快速發(fā)展,這些技術(shù)彌補了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的缺乏,可在短時間內(nèi)快速擴增出目的片段,進而到達快速檢測和診斷病原的目的[34]。2006年,Piepenburg等[35]建立了一種新型核酸等溫擴增技術(shù),RPA。它主要依靠于3種酶:能與寡核苷酸引物結(jié)合的重組酶(recombinase)、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶(polymerase),這3種酶的混合物在常溫下也有活性,最佳反響溫度在37℃左右。重組酶與寡核苷酸引物結(jié)合構(gòu)成的重組酶-引物復(fù)合體能在雙鏈DNA模板上尋找與引物對應(yīng)的互補序列,一旦引物定位到靶標序列,雙鏈DNA分子會在重組酶的作用下解鏈,然后SSB與每條單鏈DNA迅速結(jié)合,同時在引物和DNA聚合酶的作用下構(gòu)成2條完好的DNA雙鏈,作為下一次反響的模板,進行指數(shù)式擴增。整個RPA反響經(jīng)過進行的非?？?其擴增產(chǎn)物的檢測方式方法有3種,瓊脂糖凝膠電泳檢測、試紙條檢測和熒光探針檢測。6.1、瓊脂糖凝膠電泳檢測RPA擴增能夠在PCR儀或水浴鍋中進行,一般在37℃20min內(nèi)即可完成擴增反響,擴增產(chǎn)物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。6.2、試紙條檢測該方式方法結(jié)合了免疫技術(shù)、分子雜交技術(shù)、膠體金標記技術(shù)和側(cè)向流層析技術(shù),其原理為生物素標記的核酸擴增產(chǎn)物能夠和FAM標記的特異性探針進行雜交,然后與試紙條上Anti-FAM/DIG抗體的金標物結(jié)合,免疫復(fù)合物通過層析膜擴散到檢測線時,生物素標記的擴增產(chǎn)物被配體捕獲,構(gòu)成具有顏色的檢測線(detectionline),不被捕獲的免疫復(fù)合物繼續(xù)擴散到質(zhì)控線(controlline)被特異性抗體捕獲,構(gòu)成具有顏色的質(zhì)控線。該方式方法特異性好、檢測時間短、2~10min就能觀察到檢測結(jié)果。Yin等[36]采用側(cè)向流試紙條RPA(LF-RPA)方式方法對疫區(qū)環(huán)形泰勒蟲病(T.annulata)進行快速診斷,發(fā)現(xiàn)該方式方法可快速(常溫下5min內(nèi)可檢測到結(jié)果)、敏感(基因組DNA最低檢測限為2pg)、特異(與牛犁漿蟲無穿插反響)檢測泰勒蟲病。6.3、熒光探針檢測在RPA反響體系中參加1個熒光標記的探針可對擴增產(chǎn)物實時檢測,使用便攜式的熒光檢測儀可在10~20min內(nèi)檢測到熒光曲線,該方式方法已應(yīng)用于病原微生物的檢測[37-38]。Liljnder等[39]以分離自肯尼亞疫區(qū)MccpILRI181菌株的全基因組序列為靶標序列設(shè)計RPA引物和探針,建立了一種快速、敏感和特異性檢測Mccp的RPA方式方法,他們利用該方式方法直接從患病山羊的臨床樣本(包括胸腔積液和肺臟組織)中快速診斷CCPP。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方式方法能夠通過熒光信號的產(chǎn)生從CCPP陽性感染動物的胸腔積液中直接檢出Mccp。7、小結(jié)筆者通過對上述6種方式方法進行可行性比擬發(fā)現(xiàn),普通PCR技術(shù)具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點,但是該方式方法容易出現(xiàn)穿插污染而影響檢測結(jié)果的準確性。PCR-REA方式方法固然在一定程度上彌補了普通PCR的缺乏,但在后反響經(jīng)過中還需進行限制性酶切分析,步驟復(fù)雜,不宜用于病原的快速診斷。qPCR技術(shù)固然在特異性和敏感性方面遠遠超過普通PCR方式方法,但試劑價格昂貴、儀器設(shè)備成本較高、需要專業(yè)的試驗人員進行操作,因而該方式方法僅用于專業(yè)實驗室對病原的診斷和定量工作,當前還無法推廣到疫病現(xiàn)場和資源稀缺的地區(qū)。LAMP技術(shù)具有較普通PCR更高層次的敏感性、特異性以及操作簡便等優(yōu)點,但該技術(shù)需要4條特異性引物,且引物設(shè)計復(fù)雜,反響溫度通常在60℃左右,其擴增產(chǎn)物需要進行分離純化和瓊脂糖凝膠電泳檢測等步驟,限制了該方式方法在田間推廣應(yīng)用。近年來,隨著核酸等溫擴增技術(shù)的發(fā)展,iiPCR和RPA技術(shù)憑借其操作簡便、反響時間短(可在1h內(nèi)獲取檢測結(jié)果)和可對疫病進行現(xiàn)場診斷等優(yōu)點,在病原的診斷和疫病檢測方面頗受廣大科研人員和基層獸醫(yī)工作者的青睞。但就當前來看,2種方式方法所需試劑價格昂貴,因而開發(fā)出成本低廉的診斷試劑盒將是上述2種方式方法加以大規(guī)模推廣應(yīng)用的有力保證?？傊?在今后病原的診斷工作中,應(yīng)根據(jù)實驗室條件選擇適宜的檢測方式方法,或一種或多種方式方法結(jié)合使用,這樣更能增加檢測結(jié)果的準確性和可靠度。當然,對于基層獸醫(yī)站或養(yǎng)殖場而言,合適于臨床快速檢測的iiPCR和RPA技術(shù)可成為其首選方式方法。以下為參考文獻[1]NicholasR,ChurchwardC.Contagiouscaprinepleuropneumonia:newaspectsofanolddisease[J].TransboundEmergDis,2020,59(3):189-196.[2]McMartinDA,McOwanKJ,SwiftLL.Acenturyofclassicalcontagiouscaprinepleuropneumonia:fromoriginaldescriptiontoanetiology[J].BrVetJ,1980,136(5):507-515.[3]McOwanKJ,MinetteJE.AmycoplasmafromacutecontagiouscaprinepleuropneumoniainKenya[J].TropAnimHealthProd,1976,8(2):91-95.[4]王棟,張瑞亭.我們國家山羊傳染性胸膜肺炎病原的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1988,18(9):3-5.[5]賀英,趙萍,儲岳峰,等.由絲狀霉形體山羊亞種引起的羊傳染性胸膜肺炎診斷方式方法的研究進展[J].畜牧業(yè)與飼料科學,2018,30(2):169-170.[6]鐘文彬,吳燕,李如舉,等.山羊傳染性胸膜肺炎病例分子病原學診斷[J].貴州畜牧獸醫(yī),2018,35(6):1-6.[7]WorldOrganizationforAnimalHealth.Contagiouscaprinepleuropneumonia.In:MannualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals(Mammals:birdsandbees)[M].5thedvolⅡ.Pairs:OfficeInternationaldesEpizooties,2004:623-634.[8]辛九慶,李媛,張建華,等.一株山羊支原體山羊肺炎亞種的分離鑒定與分子特征[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學