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文檔簡介

基因組序列注釋功能基因組學第一頁,共五十頁,2022年,8月28日為什么需要功能基因組學?雖然從結構基因組學可以揭示基因組中基因的數量和分布,并預測基因的種類和功能,但這僅僅是預測而已,并不能肯定其確切功能,而且有許多基因的功能還無法預測。從結構基因組學也無法知道各個基因參與了哪些生命過程,其表達是如何調控的,不同基因之間是如何互作的??傊瑥慕Y構基因組學無法了解基因的確切功能、表達調控以及相互作用。功能基因組學的產生正是為了研究這些內容。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二頁,共五十頁,2022年,8月28日功能基因組學是反向遺傳學傳統的遺傳學也稱為正向遺傳學,它是在已知基因功能的前提下,去尋找基因(序列)的,亦即“從功能到基因”。功能基因組學正好相反,它是在已知基因(序列)的前提下,去尋找基因功能的,亦即“從基因到功能”,所以也稱為反向遺傳學。第三頁,共五十頁,2022年,8月28日正向遺傳學的研究方法圖位克隆法:根據目標基因在染色體上定位的結果,對目標基因進行克隆,最后了解其核苷酸序列。轉座子(或T-DNA)標簽法:利用轉座子(或T-DNA)插入引起的突變,克隆控制突變性狀的基因。第四頁,共五十頁,2022年,8月28日圖位克?。≒ositionalCloning)

圖位克隆又稱基于圖譜的克隆(map-basedcloning)。首先是尋找與目標基因緊密連鎖的標記,然后通過染色體步行方法(chromosomewalking)建立局域物理圖,找到與目標基因共分離的BAC克隆。進一步通過亞克隆和遺傳互補試驗(將野生型基因轉入突變體中),找到目標基因。第五頁,共五十頁,2022年,8月28日轉座子標簽/T-DNA標簽

(TransposonTagging/T-DNATagging)

轉座子轉座插入是一個自發(fā)的過程,而T-DNA插入則是通過轉基因產生的。轉座子插入和T-DNA插入引起突變的頻率要比自然突變的頻率高。因此,在已知存在轉座子的群體或轉基因后代群體中發(fā)現的突變體,很可能是轉座子或T-DNA插入引起的。通過轉座子或T-DNA標簽克隆基因的方法主要有以下三種:菌落原位雜交法(insituhybridization)反向PCR法(inversePCR,IPCR)質粒拯救法(plasmidrescue)

COLLEGEOFLIFESCIENCE第六頁,共五十頁,2022年,8月28日菌落原位雜交法建立突變體基因組DNA克隆文庫,以轉座子序列為探針與菌落克隆雜交,陽性克隆即包含被轉座子插入的目標基因。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第七頁,共五十頁,2022年,8月28日反向PCR法將突變體基因組DNA進行限制酶切,然后用連接酶使之連成環(huán)狀。依據轉座子序列設計反向引物,進行PCR,即可擴增出目標基因片段。為了提高特異性,可以采用巢式(nested)PCR方法。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第八頁,共五十頁,2022年,8月28日質粒拯救法經過改造的轉座子帶有質粒的復制原點和選擇標記基因,從而猶如一個載體。將突變體基因組DNA酶切并連接后,可以得到轉座子和目標基因片段組成的環(huán)狀DNA。用它轉化大腸桿菌,目標基因片段即被克隆出來。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第九頁,共五十頁,2022年,8月28日反向遺傳學的研究方法:針對特定基因消除或抑制基因的表達基因敲除(geneknockout)反義RNA(antisenseRNA)RNA干擾(RNAinterference)提高或改變基因的表達使目標基因過量表達(overexpression)使目標基因異位表達(ectopicexpression)

COLLEGEOFLIFESCIENCE第十頁,共五十頁,2022年,8月28日基因敲除在體外先將某個基因的內部插入一個選擇標記基因,使該基因失活。并將包含該失活基因的染色體片段組裝到載體上。導入細胞后,通過同源重組,失活基因會取代細胞中原來正常的基因,從而產生基因失活突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第十一頁,共五十頁,2022年,8月28日第十二頁,共五十頁,2022年,8月28日第十三頁,共五十頁,2022年,8月28日

COLLEGEOFLIFESCIENCE第十四頁,共五十頁,2022年,8月28日反義RNA將目標基因顛倒過來,使其編碼鏈變成模板鏈,而模板鏈變成編碼鏈,即成為該目標基因的反義RNA基因。將反義基因轉入到植物細胞中,反義基因將轉錄出反義RNA,而反義RNA會與目標基因的mRNA結合,使之無法翻譯,從而達到抑制目標基因表達的目的。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第十五頁,共五十頁,2022年,8月28日RNA干擾(RNAi)RNA干擾是指dsRNA(雙鏈RNA)在細胞中可以誘發(fā)與之同源的mRNA降解,從而導致編碼該mRNA的基因沉默的現象。RNA干擾的最初證據來自1995年Guo和Kemphues對線蟲的研究。他們發(fā)現,將par-1基因的反義RNA和正義RNA注射進線蟲體內,都能引起該基因的沉默?;谠撗芯拷Y果,1998年AndyFire首次在線蟲中證明,dsRNA可以有效地、特異地抑制基因的表達。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第十六頁,共五十頁,2022年,8月28日RNA干擾所需的酶Dicer:為RNaseIII家族的一個成員,可以產生雙鏈小型干擾RNA(siRNA,長度21~23bp)。該酶含有多個結構域,包括一個解旋酶結構域,兩個相鄰的RNaseIII結構域,以及一個dsRNA結合基元。RISC(RNA-inducedsilencingcomplex):由RNA誘導的沉默復合體,是一種核酸蛋白復合體。RdRP(RNA-directedRNApolymerase):由RNA指導的RNA聚合酶。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第十七頁,共五十頁,2022年,8月28日RNA干擾的基本過程Dicer與dsRNA結合,將dsRNA剪切成siRNA。siRNA與RISC結合,形成有活性的RISC復合體。有活性的RISC與目標mRNA結合(siRNA單鏈與mRNA互補),將mRNA切斷。第十八頁,共五十頁,2022年,8月28日RNA干擾的分子機制第十九頁,共五十頁,2022年,8月28日dsRNA的來源用于RNA干擾的dsRNA既可以在體外合成,然后導入到受體細胞里,也可以人為地構建一個基因(將目標基因中某一段序列鏡像對接),將它導入到受體細胞,直接在受體細胞中合成dsRNA。該基因具有自互補結構,因而轉錄出來的RNA可以形成發(fā)夾結構。5-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATGAAAGGTTCCGCTATAGG-33-TTCGAATAGGGCACCACCATACTTTCCAAGGCGATATCC-55-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATCCACCACGGGATAAGCTT-33-TTCGAATAGGGCACCACCATAGGTGGTGCCCTATTCGAA-5第二十頁,共五十頁,2022年,8月28日過量表達和異位表達通過轉基因技術將完整的目標基因(包括啟動子區(qū)域)導入正常個體細胞中,使目標基因的拷貝數增加,這樣可能會使目標基因的表達量增加,超過了正常的需要(即過量表達),這會引起性狀的改變。由此可以推斷目標基因的功能。如果轉基因中所用的啟動子是組織特異的,而且其表達的部位與目標基因正常表達的部位不同,則出現異位表達現象。異位表達可能使得某種(些)性狀在非正常的部位出現。據此也可推斷目標基因的功能。使用組成型啟動子會同時造成過量表達和異位表達。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十一頁,共五十頁,2022年,8月28日水稻OsMADS3基因過量和異位表達的表現使用組成型啟動子讓來自水稻的OsMADS3基因在水稻中過量和異位表達,發(fā)現在正常的小穗旁邊還長出一個不完全的小穗。由此可以推斷,該基因與水稻的小穗發(fā)育有關。第二十二頁,共五十頁,2022年,8月28日功能基因組學的研究方法:高通量建立大規(guī)模隨機插入突變體庫及基因機械篩選(genemachinescreening)分析基因表達譜(expressionprofile)轉錄組(transciptome)蛋白組(proteome

)代謝組(metabolome

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十三頁,共五十頁,2022年,8月28日突變體庫對于遺傳學研究的意義隨著一些物種全基因組測序的完成,以及數據庫中現有的成百上千的ESTs序列,如何分析這些基因的功能、如何理解基因與基因之間在生物體內的相互作用是一項重要的工作?;蚬δ艿念A測建立在與其他物種同源基因之間的比對,但許多基因的預測功能與他們實際的功能并不一致。還有許多的基因功能尚未歸類。突變體在研究基因的功能的過程中十分重要。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十四頁,共五十頁,2022年,8月28日突變體庫對于遺傳學研究的意義

COLLEGEOFLIFESCIENCE30%為原來已鑒定的基因;30%為同源分析鑒定的基因;10%為數據庫中存在同源序列,但功能未知,稱為孤兒家族;剩下30%在數據庫中無同源序列,其中7%很可能不是基因,23%看起來像基因,稱為單身孤兒。酵母基因組中基因的分類第二十五頁,共五十頁,2022年,8月28日產生突變體庫的方法

研究一個基因的功能,最可靠的方法是把一個基因的結構破壞掉,然后研究破壞后的表現型。借助大量的突變體,將會加速人們對這個物種基因功能的研究。常見的方法是:1、插入突變2、缺失突變3、物理化學誘變

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十六頁,共五十頁,2022年,8月28日插入突變

插入突變作為研究基因組基因功能的有效手段,廣泛地應用于植物、哺乳動物的基因功能的研究。這個技術手段的優(yōu)勢在于,插入片段的序列已知,并且攜帶容易識別的報告基因。其中,常用的插入突變技術有T-DNA插入突變Ac/Ds

轉座子插入突變

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十七頁,共五十頁,2022年,8月28日T-DNA

T-DNA是農桿菌Ti質粒中的一個片段。農桿菌Ti質粒可以從植物傷口侵入植物細胞,T-DNA可以整合到植物基因組中,并引起細胞瘋狂分裂,形成冠狀腫瘤。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十八頁,共五十頁,2022年,8月28日轉座子Ac/Ds系統Ac/Ds是目前植物中最常用的轉座子系統。該系統來自玉米,但已經通過轉基因技術將該系統導入其它植物(如水稻)中。Ac是自主型轉座子,而Ds是非自主型轉座子,需要Ac存在時才能發(fā)生轉座。因此,可以通過有性雜交的方法將Ac和Ds聚合在一個基因組中。當發(fā)現某個Ds插入引起的突變體時,又可以通過有性雜交的方法使Ac和Ds分開,這樣就能穩(wěn)定地保存Ds插入突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第二十九頁,共五十頁,2022年,8月28日建立隨機插入突變體庫及基因機械篩選為了高通量地研究基因的功能,應該大規(guī)模地建立T-DNA或轉座子插入株系,然后對所有已知序列的基因進行篩選,確定各個基因的插入突變體。采取基因機械篩選的策略,可以同時對許多基因進行篩選,實現高通量的分析目標。主要有以下三種方法:PCR檢測分子雜交檢測側鄰DNA測序

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十頁,共五十頁,2022年,8月28日PCR檢測法根據目標基因和T-DNA(或轉座子)的序列設計一對引物,則僅當T-DNA(或轉座子)插入到目標基因中間時,才能得到PCR產物。因此,能得到PCR產物的株系即為該目標基因的插入突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十一頁,共五十頁,2022年,8月28日分子雜交檢測法對所有株系進行反向PCR(IPCR),然后將各株系IPCR的產物按陣列形式固定在尼龍膜或玻璃片上,再以各個待測基因的序列為探針進行雜交,有陽性雜交信號的點(株系)即為該基因的插入突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十二頁,共五十頁,2022年,8月28日側鄰DNA測序法將所有株系的T-DNA(或轉座子)插入位點兩側的序列擴增出來并測序,然后將這些序列儲存在一個基因敲除數據庫中。用生物信息學的方法將各個待測基因的序列與該數據庫中的序列進行比較,即可獲知哪些株系發(fā)生了哪些基因的插入突變。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十三頁,共五十頁,2022年,8月28日分析基因表達譜(expressionprofile)

—轉錄組分析(transcriptome)轉錄組(transcriptome)是指在某一特定條件下單個或一組細胞所具有的mRNA的總和。對轉錄組的分析,就是檢測各種mRNA的表達水平,由此可以反映各種基因的表達調控,推斷其可能的功能和作用網絡。對轉錄組的分析主要有以下兩種方法:SAGE(SerialAnalysisofGeneExpression)Microarray(微陣列)/DNAchip(DNA芯片)

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十四頁,共五十頁,2022年,8月28日SAGE分析

SAGE:能同時分析大量的轉錄本

三項原則:取短片段的序列(10-14bp),必須包括能區(qū)分一個轉錄本的足夠的信息。短片段的序列之間能夠相互連接形成長的序列分子,這樣的分子能夠被克隆與測序。某特異序列被觀察到的時間量(標簽出現的頻率)代表某個轉錄本的表達豐度。技術關鍵:用一種特殊的限制性內切酶,能夠切取特定的標簽長度。如:BsmF1

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十五頁,共五十頁,2022年,8月28日SAGE從特定組織中提取mRNA,通過反轉錄成為cDNA。通過限制酶切從每條cDNA上得到一條長10-15bp的片段,稱為SAGE標簽。將來自各種cDNA上的標簽連接成許多串聯復合體,并將其克隆。對這些克隆進行測序,然后統計各種標簽的數量。這樣就能了解各種mRNA的相對豐度。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十六頁,共五十頁,2022年,8月28日SAGE實驗計算機軟件的用途選擇具有合適相間距離的限制性內切酶位點在繁浩的基因序列數據中提煉“標簽”將標簽的序列信息儲藏在數據庫之中在計算機中模擬“標簽”序列與基因組序列的相匹配

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十七頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片

(Microarry)-什么是Microarry技術?一種非常有效的基因表達研究技術,可以同時檢測多達10萬個基因的表達狀況。特別是用于了解在一種組織中各類mRNA的豐度。它的特點是:平行性高通量大范圍、大規(guī)?;蚪M水平上的

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十八頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片(DNAMicroarry)-概況?原則上是在玻璃片、尼龍膜或其他材料上點上一系列的DNA片段,然后與不同的轉錄本探針進行雜交。這些有序排列的“點”可以是細菌克隆、純化后的質粒DNA、插入片段、或者是核苷酸片斷。點樣的密度可以達到每片10萬個多種高技術的有機組合

COLLEGEOFLIFESCIENCE第三十九頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片(DNAMicroarry)-尼龍膜上點樣用放射性物質標記探針,這是一種經濟的方法

COLLEGEOFLIFESCIENCE第四十頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片(DNAMicroarry)-幾種常見的技術高速的機器手在玻璃芯片上點樣,通常是點經過PCR擴增的cDNAs,所謂芯片的“印制”依賴高速機器手,點長片段的核苷酸(70merAgilent技術)用所謂的照相平板印刷法,直接在芯片上合成25mer的多低聚核苷酸(AffymetrixGeneChips)用“鋁鏡”技術在芯片上直接合成25-70mers的低聚核苷酸(NimbleGeneChips技術)

COLLEGEOFLIFESCIENCE第四十一頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片的分析過程

COLLEGEOFLIFESCIENCE第四十二頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片的分析過程

COLLEGEOFLIFESCIENCE第四十三頁,共五十頁,2022年,8月28日DNA芯片的分析過程

COLLEGEOFLIFESCIENCE第四十四頁,共五十頁,2022年,8月2

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