畢業(yè)論文-載體構(gòu)建

SUR1基因的組織定位目錄摘要.........................................................................................1．前言...................................................................................1.1研究背景....................................................................1.2Userfusion 技術(shù)簡(jiǎn)介...............................................

錯(cuò)誤!未定義書簽。錯(cuò)誤!未定義書簽。錯(cuò)誤!未定義書簽。錯(cuò)誤!未定義書簽。2.實(shí)驗(yàn)材料和方法...................................................................錯(cuò)誤!未定義書簽。2.1SUR1啟動(dòng)子的克隆...................................................錯(cuò)誤!未定義書簽。2.2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌................................................................錯(cuò)誤!未定義書簽。2.3農(nóng)桿菌侵染法侵染擬南芥..........................................錯(cuò)誤!未定義書簽。2.4Basta篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥...........................................錯(cuò)誤!未定義書簽。3.結(jié)果......................................................................................錯(cuò)誤!未定義書簽。3.1SUR1啟動(dòng)子Userfusion克隆結(jié)果.........................錯(cuò)誤!未定義書簽。3.2啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物與載體連接.....................................錯(cuò)誤!未定義書簽。3.3大腸桿菌中SUR1啟動(dòng)子菌落PCR檢測(cè)結(jié)果..........錯(cuò)誤!未定義書簽。3.4SUR1啟動(dòng)子農(nóng)桿菌的PCR檢測(cè)..............................錯(cuò)誤!未定義書簽。3.5Basta篩選結(jié)果.........................................................錯(cuò)誤!未定義書簽。SUR1基因的組織定位4.討論

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錯(cuò)誤!未定義書簽。參考文獻(xiàn)

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錯(cuò)誤!未定義書簽。致謝

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錯(cuò)誤!未定義書簽。SUR1基因的組織定位摘要：芥子油苷是一類十字花科植物所特有的硫代產(chǎn)物，芥子油苷代謝與植物防御反應(yīng)密切相關(guān)，且某些芥子油苷的降解產(chǎn)物具有很高的抗腫瘤活性，因而其代謝及調(diào)控機(jī)制的研究備受關(guān)注。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展以及芥子油苷合成途徑中相關(guān)基因的鑒定，SUR1 基因參與硫苷生物合成模式三個(gè)階段中硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成階段，SUR1表達(dá)的C-SlyaseSUR1能將S-烷基硫代烷肟轉(zhuǎn)換成硫代肟基酸。本研究以模式植物擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料。采用USERfusion，構(gòu)建載體，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，GUS染色等方式，觀察其表達(dá)模式，完成其組織定位，結(jié)果用以和其他已知的芥子油苷合成路徑中的一些相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)上的對(duì)比，通過這中方式探討SUR1 基因在芥子油苷的合成途徑中的功能意義，以及SUR1 基因時(shí)空表達(dá)的特異性。SUR1基因的組織定位關(guān)鍵詞：芥子油苷,擬南芥,SUR1,USERfusionAbstract: isaclassofsulfur-containingsecondarymetabolismoutcomesspecializedinCruciferousplants.Glucosinolateshaveanimportantroleinplantdefenseandsomeoftheglucosinolatesdegradationproductscanpreventcancerinhumans.Today,theresearchingabouttheglucosinolatesmetabolismanditsbiosynthesisregulationisunderthespotlight.Alongthedevelopmentofbioinformaticsandthedemonstrationofthenewgeneswhichinvolvethebiosynthesizeofglucosinolates, ，SUR1takepartintheprocessConstructingtheglucosinolatecore,whichcanhappennon -enzymatically,theproducedS-alkylthiohydroximatesareconvertedtothiohydroximatesbyt heC-SlyaseSUR1 。Inthisstudy ，weusethemodelplantArabidopsisasSUR1基因的組織定位experimentalmaterial,USERfusionconstructvectors,Agrobacterium-mediatedtransformation,GUS,toobser veexpressionpatternandcompleteitstissuelocalization.theresultsareusedandsomeotherknownmustardoilglycosidesynthesisrouterelatedgeneexpressioncontrast.thefunctionalsignificanceoftheSUR1geneinthebiosynthesisofglucosinolatesthiswaySUR1genetemporalandspatialexpressionspecificity.SUR1基因的組織定位KeywordGlucosinolates,Arabidopsisthaliana,SUR1,USERfusion前言1.1 研究背景硫代葡萄糖苷即芥子油苷簡(jiǎn)稱硫苷，是一種含氮、硫的化合物。芥子油苷廣泛分布于16個(gè)不同科的雙子葉被子植物中,它們分別是十字花科(Brassicaceae)、藜木科(Bataceae)、鐘萼木科(Bretschneideraceae)、白花菜科(Capparaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、環(huán)蕊科(Gyrostemonaceae)、池花科(Limnanthaceae)、辣木科(Moringaceae)、瘤藥樹科(Pentadiplandraceae)、商陸科(Phytolaccaceae)、海桐花科(Pittosporaceae)、木犀草科(Resedaceae)、刺茉莉科(Salvadoraceae)、烈味三葉草科(Tovariaceae)和旱金蓮科(Tropaeolaceae)[1]。最主要是存在于十字花科植物中，十字花科植物中超過個(gè)屬和3000個(gè)種都可以合成芥子油苷。是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物。SUR1基因的組織定位芥子油苷既分布于植物的生殖器官( 花序、角果/果實(shí)、種子), 也存在于營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)[2]。在同一植物中芥子油苷的含量和成分明顯依賴于株齡[3,4]和組織器官而發(fā)生變化。近年來，由于其在黑芥子酶作用下的分解產(chǎn)物異硫代氰酸鹽在人體抗癌方面的健康功效而不斷受到大家的重視。增加食品中的芥子油苷含量和充分發(fā)揮其分解物的生物有效性已經(jīng)成為現(xiàn)今的一個(gè)研究熱點(diǎn)。芥子油苷一般貯存于植物細(xì)胞液泡中，而芥子酶貯存于特定的蛋白體中，一般情況下二者是分離的，當(dāng)植物組織受到病原體或蟲害侵襲時(shí)，細(xì)胞組織被破壞，芥子酶與硫苷相遇，發(fā)生反應(yīng)，將硫苷水解成異硫氰酸鹽（Isothiocyanates）、硫氰酸脂（Thiocyanates）和腈類（Nitriles）等降解產(chǎn)物[7]。硫苷及其降解產(chǎn)物能調(diào)節(jié)十字花科植物的生長(zhǎng)素代謝，平衡體內(nèi)的硫元素，緩解硫素脅迫，保證植物正常生長(zhǎng)發(fā)育，抵御病原體及蟲害侵襲，此外，還對(duì)癌癥的發(fā)生起阻斷作用。在植物防御與人類營(yíng)養(yǎng)學(xué)上起著重要的作用，具有很高的生物學(xué)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。芥子油苷通常由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團(tuán)以及來源于氨基酸的側(cè)鏈R組成(圖1) 。SUR1基因的組織定位目前至少有120種不同的結(jié)構(gòu)被確定[5] 。根據(jù)側(cè)鏈的氨基酸來源可以將芥子油苷分為脂肪族芥子油苷(側(cè)鏈來源于甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸) 、芳香族芥子油苷(側(cè)鏈來源于苯丙氨酸和酪氨酸)和吲哚族芥子油苷(側(cè)鏈來源于色氨酸)3個(gè)類群。硫苷生物合成模式大致可分為三個(gè)階段：氨基酸側(cè)鏈的延長(zhǎng)、硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成和葡萄糖配基側(cè)鏈的二次修飾。硫苷的有無與含量的高低是由基因來控制的，相關(guān)的主要合成和調(diào)節(jié)基因參與硫苷合成的三個(gè)階段。氨基酸或氨基酸側(cè)臉延長(zhǎng)筒源無可經(jīng)由細(xì)胞色素P450(CYP450) 家族的CYP79s(CYP79subfamily) 和NADPH 催化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的肟。肟形成后被CYP83s(CYP83subfamily) 和NADPH 催化產(chǎn)生不穩(wěn)定的酸式硝基化合物或氧化氰。二者均可與硫供體——半 胱氨酸結(jié)合，在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶作用下生成S-烷基硫代烷肟，之后在C-S裂解酶的催化下生成的硫代肟基酸經(jīng)S—葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，與活化硫酸鹽的磺基結(jié)合形成芥子油苷的硫核心結(jié)構(gòu)，該核心結(jié)構(gòu)之后再需要經(jīng)過羥基化、甲基化、去飽和化、磺化、葡萄糖基化等種種次SUR1基因的組織定位級(jí)修飾形成不同的芥子油苷。本研究所涉及的SUR1基因是在硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成階段起重要作用：在硫苷核心結(jié)構(gòu)形成的階段中SUR1

表達(dá)的C-SlyaseSUR1

能將S-alkylthiohydroximates

（S-烷基硫代烷肟）轉(zhuǎn)換成

Thiohydroximates

（硫代肟基酸）[6]從而保證下一步反應(yīng)的進(jìn)行(見圖2)。本研究旨在完成該基因的組織定位。SUR1基因的組織定位圖2：脂肪族與吲哚族芥子油苷的生物合成路徑1.2USERfusion 技術(shù)簡(jiǎn)介USER fusion 技術(shù)的基礎(chǔ)理論是依賴于PCR引物的使用，該引物包含一個(gè)SUR1基因的組織定位12-nt5 ’尾部中至少含有四個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷（Ts）被替換成脫氧尿苷（Us），之后PCR產(chǎn)物被尿嘧啶-DNA 糖苷酶（uracil DNA glycosidase 即UDG）處理，這種酶可以選擇性的切除尿嘧啶堿基，而保留磷酸二酯骨架的完好性，缺失的堿基位點(diǎn)會(huì)使堿基互補(bǔ)配對(duì)不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，引物的3’突出端在退火過程中同樣的在PCR擴(kuò)增載體3’突出端互補(bǔ)配對(duì)。處理后的PCR產(chǎn)物和載體能形成一個(gè)可被轉(zhuǎn)入一個(gè)不需結(jié)扎的大腸桿菌之中的穩(wěn)定環(huán)狀雜交產(chǎn)物。隨著技術(shù)的發(fā)展，第二種酶被引入PCR產(chǎn)物的處理中——T4核酸內(nèi)切酶V，可以在3’端破壞DNA磷酸二酯骨架制造一個(gè)脫堿基位點(diǎn)。因此，UDG和T4內(nèi)切核酸酶V連續(xù)作用在PCR產(chǎn)物中，與一個(gè)3’端含有單U殘基的引物一起，可以有效地被用于克隆。商用公司通過一種簡(jiǎn)單的雙酶處理法將兩種酶混合到一起，稱為USERTMenzyme mix，并作出一定程度上的優(yōu)化改進(jìn)。這種USER fusion 技術(shù)被認(rèn)為是一種高效率且通用性強(qiáng)的技術(shù)。[8]實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1SUR1 啟動(dòng)子的克隆啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，即啟動(dòng)子是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表SUR1基因的組織定位達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度，本身不控制基因活動(dòng)，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。一般認(rèn)為目的基因上游約2kb即包含目的基因啟動(dòng)子片段，由于所需克隆的片段較長(zhǎng)，故選擇USERfusion 方法來克隆這段目的基因片段，這種方法通用性強(qiáng)，并且準(zhǔn)確率和效率都比較高。2.11 多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增包含SUR1 啟動(dòng)子全長(zhǎng)cDNA 的質(zhì)粒模板，寡核苷酸Invitrogen 公司購(gòu)買，依照說明書使用PfuTurbo CXHotstartDNA駛反應(yīng)。所涉及引物序列見表一（A、B）

引物序列從聚合酶行引物 序列SUR1啟動(dòng)子FP 5′---GGCTTAAUTATTGCATTGCTACTTTGTGGTT----3 ′SUR1啟動(dòng)子RP 5′---GGTTTAAUCTTCTCTCTGTGCTTTGAGTTCTT---3 ′表一（A）SUR1啟動(dòng)子引物SUR1基因的組織定位引物 序列SUR1啟動(dòng)子fusionFP1 5’---ATCTGGUATTAACTTGAAACTTTCACACTTCT----3 ’SUR 啟 動(dòng) 子 fusion RP1 5 ’---ACCAGAUTTTCATTACTTTCATTTAAAGTTCG----3 ’SUR1 啟 動(dòng) 子 fusion FR2 5 ’---ATAGTCUAAAAATAGAAATTTGTTGACCAAG----3 ’SUR1啟動(dòng)子fusionRP2 5’---AGACTAUGGGTGCAAATGTTGTTTG----3 ’表一（B）SUR1啟動(dòng)子USERfusion 引物2.12DNA 純化根據(jù)廠家說明書用QIAquickPCR 純化工具對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行柱相純化，純化產(chǎn)物以原體系的三分之一的蒸餾水進(jìn)行洗脫。SUR1基因的組織定位2.13 純化的

PCR產(chǎn)物與預(yù)備載體的結(jié)合等體積的純化PCR產(chǎn)物連同等體積的帶有PacI/Nt.BbvCI 的預(yù)備載體pCambia3300 一起，于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行跑膠，通過條帶亮度分析相對(duì)濃度，決定混合配比3:3:3:1 。2.14 用USERTMenzymemix

處理一微升10TEbufferUSERTMenzymemix(1U/

【100mMTris-HCl,1mMEDTA(pH8.0)】、1U的μL)加到8μL預(yù)備載體和PCR純化產(chǎn)物的混合物，反應(yīng)在37℃的溫度下孵育20分鐘，接著在25℃的條件下反應(yīng)20分鐘，預(yù)備載體在反應(yīng)混合物中的量大概占 0.01pmol.2.15 轉(zhuǎn)化全部10μL的反應(yīng)混合物與50μL感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行熱激反應(yīng)2.16 質(zhì)粒的準(zhǔn)備與限制性分析依照廠家說明書，使用GenEluteTM 質(zhì)粒小量制備工具，4ml過夜培養(yǎng)，被純化的質(zhì)粒用50μL的水洗脫，在一個(gè)20μL包含1NEBBuffer2[50mMNaCl,10mMTris-HCl,10mMMgCl2,1mMdithiothreitol(pH7.9)] 和100μL/mlBSA的反應(yīng)體系中每?jī)晌⑸|(zhì)粒用10U的SpeI,37 ℃條件下切割2小時(shí)。在含有卡那霉素固體培養(yǎng)基中篩選，PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒，取陽性克隆菌落。載體示意圖如圖3SUR1基因的組織定位圖3：載體示意圖所構(gòu)建載體為二元載體，Basta 為在植物體中的篩選標(biāo)記，Kana為菌體中的篩選標(biāo)記。所連接的GUS基因用于后續(xù)組織定位之用。2.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌重組表達(dá)載體導(dǎo)人農(nóng)桿菌。用電轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2500kV／em；電容25F；電阻500Q。電擊3～5ms后，取出電擊杯，迅速加入800L的LB液體培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移至1．5mL的EP管中，在28℃震蕩培養(yǎng)3h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50 ／,g／mL)的LB平板中28℃培養(yǎng)24h ，即可長(zhǎng)出陽性克隆。陽性克隆的菌落PCR與酶切鑒定。隨機(jī)挑取單菌落，在裝有1mL的LB和1．5SUR1基因的組織定位mL的抗生素的離心管中28℃培養(yǎng)12h左右。取5OL培養(yǎng)物，煮沸5rain，5000r／rain離心2min，取1～2／,L上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)。選取菌落PCR驗(yàn)證后的菌液抽提質(zhì)粒，并用BstE1I和Bgl1I雙酶切后，電泳檢測(cè)。2.3 農(nóng)桿菌浸染法侵染擬南芥前期準(zhǔn)備：取150ml含相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基，接入2-3ml準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液，大搖過夜至培養(yǎng)基由紅色轉(zhuǎn)為黃色。將培養(yǎng)后的150ul農(nóng)桿菌菌液導(dǎo)入滅過菌的50ml離心管中，4℃，3000rmp離心15min棄上清，加入50ml1／2MS，將菌泥攪起。用于侵染的1／2MS 配方：（每150ml 菌液加50ml1 ／2MS 液）MS大量5ml蔗糖10g水95ml表面活性劑 20ulSUR1基因的組織定位常用1／2MS 配方（1L）：10X大量元素50ml100X微量元素5ml100X鐵鹽5ml蔗糖（1%）10g瓊脂粉8g擬南芥生長(zhǎng)土壤：腐殖土：蛭石=1:1 混勻，裝雙層袋子，高壓121℃滅菌40 分鐘注意：滅完菌后要加適量水將土和濕，不能太濕，然后土裝入缽里壓實(shí)，將缽放入裝有水的底盤中，一個(gè)小時(shí)左右缽中土壤浸濕后便能種苗。種子消毒：30%H2O2+85% 乙醇 1:4 混合取250 微升混合液加入種子種用槍頭吹打40S，放在濾紙上晾干，然后鋪在1SUR1基因的組織定位／2MS 平板上。4℃冰箱中放置春花1-5 天，一般新種子春花時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)。16\8光周期，待真葉長(zhǎng)出時(shí)，用鑷子將苗從平板移植到土壤中。后續(xù)操作種植健康的擬南芥直到開花。在種子種下后澆水蓋膜，蓋膜的目的是為了保持水分。移栽擬南芥后還需要蓋3到4天的膜。初次開花時(shí)將花蕾剪掉以促進(jìn)更多花枝的增生，修剪后越4至5天可使用，這樣優(yōu)化后的植物含有很多未成熟的花序并沒有很多受精的角果，以保證大多數(shù)植物被成功的轉(zhuǎn)化。準(zhǔn)備攜帶目的基因在雙元載體（雙元載體有兩套篩選引子，菌體中用一種，植物中用一種）里的農(nóng)桿菌菌株。養(yǎng)殖在一個(gè)大的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基帶有抗生素，以為篩選二元質(zhì)粒。搖床搖農(nóng)桿菌，用5%的蔗糖溶液（蔗糖溶液中加入表明活性劑，達(dá)到濃度0.05% ）混懸到OD600=0.8 （左右）把100ml 的5﹪的蔗糖懸浮的菌液倒入大皿內(nèi)，然后把擬南芥的花序浸入進(jìn)去侵染2分鐘，侵染的過程要轉(zhuǎn)動(dòng)缽子，（侵染之前一晚上最好給缽子里澆些水，以免第二天侵染后缽子里的土容易掉出來），侵染后用濾紙擦干。侵染后的擬南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆蓋，暗培養(yǎng)24小時(shí)后繼續(xù)光照。侵染后悉心照料，保持水分充足。一周后可再侵染一次，這是由于擬南芥的盛SUR1基因的組織定位花期較長(zhǎng)，一般要侵染2—3次。澆水松土正常養(yǎng)殖，種子成熟后停止?jié)菜?。角果自然開裂后收獲干燥的種子，獨(dú)立分裝備用。2.4Basta 篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥收獲后的干燥種子經(jīng)表面消毒，放于4℃冰箱，春化4天后，播種于培養(yǎng)土中，待長(zhǎng)出2片真葉后，噴灑1：1000 的Basta 除草劑進(jìn)行篩選。設(shè)計(jì)特性引物，采用RT_PcR方法對(duì)具有Basta 抗性的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1SUR1 啟動(dòng)子USERfusion 克隆結(jié)果（圖 4）2000bp,

SUR1啟動(dòng)子分割成三段的PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖，Marker從上至下依次為：2000、1000、750、500、250、100

均為SUR1基因的組織定位MSUR1啟動(dòng)子第一段MSUR1啟動(dòng)子第二段SUR1基因的組織定位MSUR1啟動(dòng)子第三段圖4：擴(kuò)增條帶顯示，SUR1啟動(dòng)子克隆第一段約800bp 左右，第二段越600bp左右，第三段越600bp 左右，三段合約2000bp ，所得片段與預(yù)期一致。3.2 啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物與載體的連接通過條帶亮度計(jì)算出連接體系總體系12ul1ul 4號(hào)酶切質(zhì)粒3ul SUR1 啟動(dòng)子第一段SUR1基因的組織定位3ul SUR1 啟動(dòng)子第二段3ul SUR1 啟動(dòng)子第三段1ul USERTMenzyme1ul 無菌水3.3 大腸桿菌中 SUR1啟動(dòng)子菌落 PCR檢測(cè)結(jié)果經(jīng)卡那霉素篩選，得到陽性克隆，對(duì)其進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。SUR1基因的組織定位M123圖5：Marker為2000bp,從上至下依次為：2000、1000、750、500、250、1001號(hào)為空白對(duì)照，2、3號(hào)為挑取的單菌落。3號(hào)菌落經(jīng)電泳結(jié)果顯示為假陽性。SUR1基因的組織定位SUR1啟動(dòng)子第一段 SUR1啟動(dòng)子第二段 SUR1啟動(dòng)子第三段SUR1啟動(dòng)子圖6：重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖為印證連接正確并成功導(dǎo)入大腸桿菌，SUR1啟動(dòng)子的第二段出于連接的中心，對(duì)SUR1啟動(dòng)子第二段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如未被導(dǎo)入或連接錯(cuò)誤能得不到與之前（圖5）一致的結(jié)果，所得結(jié)果約600bp ，與之前圖5結(jié)果一致，證明三段啟動(dòng)子均被轉(zhuǎn)入并連接正確。SUR1基因的組織定位對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明編碼序列與預(yù)期一致。3.4SUR1 啟動(dòng)子農(nóng)桿菌的 PCR檢測(cè)對(duì)上述測(cè)序過的大腸桿菌進(jìn)行提取質(zhì)粒，重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，挑取陽性菌落對(duì)其進(jìn)行菌落PCR凝膠電泳，擴(kuò)增SUR1啟動(dòng)子的第二段，原理同結(jié)果3.3。M 1 2圖7：M為Marker ，2000bp, 從上至下依次為：2000 、1000 、750、500、250、SUR1基因的組織定位1001 、2為挑取的單菌落結(jié)果表明大小約600bp ，與預(yù)期結(jié)果相符，證明重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。3.5Basta 篩選結(jié)果用濃度為1：1000 的Basta 除草劑噴灑四葉期的幼苗進(jìn)行篩選，未轉(zhuǎn)化成功的幼苗由于不含抗Basta 除草劑基因而枯萎變黃被殺死；成活的即為轉(zhuǎn)化成功的幼苗。(A) (B)圖8進(jìn)行Basta篩選之前A）為轉(zhuǎn)基因幼苗，（B）為野生型空白對(duì)照SUR1基因的組織定位（A） （B）圖9進(jìn)行Basta篩選之后A）為轉(zhuǎn)基因幼苗，（B）為野生型空白對(duì)照可以看出，（B）組野生型全部被Basta殺死，枯萎變黃，（A）組部分幼苗由于未被轉(zhuǎn)化成功，不含抗Basta基因，遂也被殺死，枯萎變黃。剩余有Basta 抗性即存活下去者即為被轉(zhuǎn)化成功的幼苗。討論：本研究利用了USERfusion 技術(shù)以擬南芥基因?yàn)榛蚰０蹇寺〕鯯UR1的啟SUR1基因的組織定位動(dòng)子基因，并選用pCambia3300 為載體，成功的將SUR1啟動(dòng)子構(gòu)建到CAMV35S 啟動(dòng)子的下游，通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌、農(nóng)桿菌侵染植物等步驟將下游連接GUS基因的SUR1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥中，對(duì)其進(jìn)行組織定位的研究。轉(zhuǎn)錄的起始，是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，影響基因表達(dá)的水平，一般認(rèn)為目的基因上游約2kb即包含目的基因啟動(dòng)子片段，由于所需克隆的片段較長(zhǎng)，本研究選用USERfusion技術(shù)來完成這段目的基因的克隆。USERfusion是一種快捷而高效的方法，可以同時(shí)對(duì)復(fù)雜的PCR產(chǎn)物進(jìn)行融合和克隆。由于本研究所涉及的SUR1啟動(dòng)子，所需克隆的基因長(zhǎng)度達(dá)2000bp ，對(duì)這種長(zhǎng)度的基因，傳統(tǒng)的PCR方法難以克隆出準(zhǔn)確的目的基因，并且酶的效率也會(huì)變低。但通過USERfusion 技術(shù)將片段分割成三部分同時(shí)分別克隆并在融合酶的作用下按原序列融合在一起。從而得到了較長(zhǎng)目的基因——SUR1啟動(dòng)子的克隆產(chǎn)物。USERfusion 是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的技術(shù)，用以一步完成合成和克隆多重PCR產(chǎn)物到載體之中