核酸檢測技術(shù)及其在國內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用

核酸檢測技術(shù)及其在國內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用輸血相關(guān)傳染病的預(yù)防和掌握已經(jīng)成為全社會關(guān)注的焦點,技術(shù)的引進是進一步提高血液安全性的重要一環(huán)。本文就病原體核酸檢測技術(shù)(nucleicacidtesting,NAT)及其在國內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用狀況和結(jié)果作一介紹,并對該方法在我國推廣和應(yīng)用的必要性和可行性作初步探討。NAT酶免檢測(EIA)技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于血液篩檢,該方法的靈敏度和特異性也HBV、HCVHIV1∶66000、1∶1030001∶676000[1]。這些危急的主要緣由是:病毒感染者“窗口期”獻血,病毒變異,是指從感染病原開頭,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原存在為止的這一段HBsAg、抗-HIV、抗-HCV45-56ｄ22ｄ72ｄ[4,5],故美國90%以上輸血傳播HIVHBV75HCV[6]原或抗體血清學檢測不能有效地保障血液安全。NATNATHBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短9d(縮短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%[5,]NAT31504HCVRNANAT性疾病[9]。因此,NAT的引入可使輸血傳播疾病的危急性降到最低[10]。NAT1985年具有劃時代意義的聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction,PCR)PCRNAT[11這些技術(shù)靈敏度和特異性或高或低,操作或簡潔或簡單,適合在各PCRTMAPCRDNA特異性和快速簡便等優(yōu)勢得到了廣泛的應(yīng)用。通過簡潔的技術(shù)改進和聯(lián)合,涌現(xiàn)RNAPCR(RTPCR)、敏感性和特PCR)PCR、檢PCR(PCRELISA)、PCR酸探針雜交技術(shù)(PCRSSOP)PCRPCR目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、DNAPCR參加濃度的內(nèi)標或外標,便能進展定量檢測。由于該方法實現(xiàn)了反響體系的全封閉和操作的全自動,不僅削減了污染,還提高了效率。雖然國內(nèi)很多生物技術(shù)企業(yè)已經(jīng)利用熒光PCRNAT止正式通過美國FDA2RocheCOBASAmpliHIV1/HCV,FDA50copies/ml>95%PCR20copies/ml般都很難滿足95%檢出低病毒載量標本的要求。信任不斷提高檢測靈敏度,早日研發(fā)并注冊成功我國自己的NAT血液篩檢用試劑也是國內(nèi)生物技術(shù)企業(yè)的進展目標。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增方法包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增系統(tǒng)(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列依靠擴增系統(tǒng)(nucleicacidｓsequencebased amplification,。TMA是一種利用Money鼠白血病病毒〔MMLV〕逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反響系統(tǒng),主要擴增原理為:目標序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,以引物為引導(dǎo)進展逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,轉(zhuǎn)錄出成千上萬個目標RNA序列,這些RNA又可以作為模板進展下一個循環(huán),整個是一個自催化過程。NASBA的原理與TMA相像,只是在核酸提取和擴增產(chǎn)物檢測的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強,靈敏度高,反響條件簡潔,擴增效率高,無需特地的擴增儀器,且因整個反響在1個試管中進展,也削減了污染。NATDNAsignalamplificationassay,bDNA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)、連接酶鏈技術(shù)(ligasechainreaction,LCR)和鏈置換擴增(stranddisplacementamplification,SDA)等。這些技術(shù)或由于自身緣由,或由于剛研發(fā)出來尚未進入bDNA1995年左右推出,其信號放大是通過堿性磷酸酶(AP)標記的探針雜交結(jié)合到一個樹枝狀核酸枝狀體上而實現(xiàn)的。bDNADNAbDNA待測核酸,其檢測靈敏度遠遠低于PCR,故該項技術(shù)實際上不適合用于血液篩檢,bDNAHBVHCVNAT在國內(nèi)外血液篩檢中的應(yīng)用開展NAT檢測的國家及所用的技術(shù)NAT在國外特別是一些興旺國家和地區(qū)已普遍應(yīng)用于血液篩檢[1例如,日本是世界HBV、HCV、HIVNAT[1]加坡、中NAT1997起就開頭NAT2023NATFDANAT1：國家或地區(qū)技術(shù)混合檢測／單檢?Germany(1997國家或地區(qū)技術(shù)混合檢測／單檢?Germany(1997?PCR?Pool1999〕?Netherlands(1997〕?PCR?Pool?U.K.英國(2023〕?PCR?Pool?Switzerland?PCR?Pool?Japan日本(1997年１月起對原料?PCR?Pool漿；1999〕?PCR?pool?Canada?TMA/PCR?pool/IDT?韓國〔20231〕?USA(19993〕?TMA?IDTNewZealandTMApool/IDTAustraliaTMAIDTSingaporeTMAIDTPortugalTMA/PCRPool/IDTFrance(2023〕TMA/PCRPoolSpainTMA/PCRPoolItalyTMApoolHongKongTMA/PCRPool?臺灣〔2023〕?TMA/PCR?Pool各國承受的技術(shù)各不一樣〔參見表1。日本使用的方法為羅氏公司與日本NATＴＭNPX〔PCRHBV,HCVHIVChironTMATMA(ABC)系統(tǒng)則使用羅氏COBASAmpliScreen;荷蘭及局部歐洲國家將荷蘭阿克蘇公司推出的NucliesensCOBASAmpliScreen擴增體系結(jié)合起QiagenScreen進展評估,目的是尋求一種最適合的NAT技術(shù),既保障血液安全,又能保證血液的準時供給,還要做到省時省力。NAT的血液安全水平已經(jīng)大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏檢概率仍舊2。1/34.8HIV-1NAT+1/34.8HIV-1NAT+6160121751/266.9國家試劑檢測方式NAT單獨陽性檢出狀況文獻美國ChironProcleixChiron: 16人1999.03-2023.03:14TMAHIV-1/HCVassay;Roche Cobas發(fā)光檢測；Roche：24人份HCVNAT+：170/39,721,4041/23萬；HIV-1NAT+12/37,164,054AmpliScreenHIV-1 and HCV混 合 ，PCR-ELISA1/310萬tests日本 Multiplex1999711999.7–2023.4：文 獻HBV/HCV/HIV-1日-20231月HBVNAT+15,16reagent(Roche31日，500人：26／25609771/9.8與日本共同研制)份；HCVNAT+202321：9／25609771/28.450人份HIV-1NAT+：0／256.1混樣;2023.2.1–2023.12.31：合格血液檢測HBVNAT+308160121751/5.2HCVNAT+46／16012175,ChironProcleix2個點單人份，2023.06.07-2023.11.14：17利亞TMA HIV-1/HCV316人份，及個人assay;TMA, 化學發(fā)萬；交 流光檢測；HIV-1 NAT+1/4,489,5504〔1/449.04,489,55018〕中歐HCVPCR:RocheCobasAmplicon;96人份混合HCVNAT+：6/360萬，1/60萬；HIVNAT+：2/360萬，1/180萬19HIVPCR:自己研PCR法國ChironProcleix單檢，或8人2023.07-2023.12：20TMAHIV-1/HCV；16人份,HCVNAT+：3/6141/205或RocheCobas不考慮血清學HIVNAT+：2/6141/307Nuclisens核酸提取儀坡ChironProcleixTMA HIV-1/HCVassay;單人份檢測2023.10-2023.10:HCVNAT+：4／304,715,即萬；1/7.6個人溝通〔21〕萬韓國ChironProcleix16人份2023.06.14-2023.12.03個人交TMAassay;HIV-1/HCV估：單采獻漿者24599，獻血者15597:流〔22〕HCVNAT+：1/40196；HIVNAT1/40196；2023.01.01南非ChironProcleix單人份199923TMAHIV-1/HCVHIVNAT+:2/197091/1.0assay;HCVNAT＋:0/19709AmpliscreenHIV-1AmpliscreenHIV-1andHCV結(jié)合theOrganon我國核酸篩查技術(shù)應(yīng)用的問題很難掌握。有關(guān)我國獻血者及原料漿中NAT34。3NAT檢測爭論的狀況單位深圳保安區(qū)中心血站廈門血液

試劑美 國BiotronicsTechHBV,HCVAmpliSensor試劑盒自行設(shè)計引

檢測方式2015000rpm離心濃縮，半自動熒光定量PCR50人份混合，

NATHCVNAT+:1/8805(ALT390U/L)；HBVNAT+:抗-HBc陽性中：5/495(1％)HCVNAT+:2/10000,即

文獻2425中心物，HCVNucliSensExtractorNASBA技ECL檢測1／5000江蘇省血液中心HCV試劑盒RNA單人份，PCR,電泳HCVNAT+:／37526上海血液美國Chiron8人份或24人份混HCVNAT+:0／103539;7中心ProcleixHIV-1/HCV光檢測HIVNAT+:0／103539;北京血液匹 基2426000gHCVNAT+:0/34373;27中心HCV/HIV-1熒光PCR檢測試劑Roche提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/34373多單位參與的國際合作深圳血液中心沈陽血液中心

美國ChironProcleixHIV/HCVRocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV匹基HCV熒光PCR測試劑

16自動混樣；TMA化學發(fā)光檢測24人份混合，STAR2023自動混樣;RocheMPLC自動提取核酸；RocheCOBASAmplicor擴增和檢測2426000gRoche提取柱，熒光PCR

HCVNAT+：2/802591個ALT254IU/ml)HIVNAT+：0/80259HCVNAT+:0/16512;HIVNAT+:0/16512;HBVNAT+:8/16512,即1/2064HCVNAT+:0/8.3

2829人溝通(深圳2023年５月)陽血液中心，李劍平博士，20236中山中心單人份，PCR,電泳HCVNAT+:30血站及蕪77/28098(1/365)湖中心血正業(yè)HCVPCR站表4 國內(nèi)原料漿開展NAT檢測爭論狀況單位試劑檢測方式NAT文獻中國藥品匹基HCV/HIV-12426000gHCVNAT+:0/19196;31生物制品檢定所熒光PCR核酸檢測試劑離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/19196上海萊士血制品匹 基HBV/HCV/HIV-1熒光PCR核酸檢測試劑48離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHBVNAT+:1/1401718(1/140HCVNAT+:31/1401718(1/4.532HIVNAT+:3/1250007(1/41.7中國藥品生物制品檢定所

ChironProcleixHCV/HIV-1Assay

16人份混合，TMA技HCVNAT+:1/10032; 個人溝通〔檢術(shù)；化學發(fā)光檢測 HIVNAT+:0/10032 定所白堅石20231〕我國核酸篩查技術(shù)應(yīng)用工作小結(jié)：NATNATHCV NAT+檢出率結(jié)果差異很大，從1/365〔國產(chǎn)試劑,電泳〕～1/4.0NATHCVNAT+:1/1.0～1/4.5NAT+：1/41.7；HBVNAT+：1/140〔48。必需重視核酸檢測的質(zhì)量掌握體系：留意避開穿插污染：檢測方法：傳統(tǒng)的電泳檢測為開放式，不適合；嚴格的核酸檢測試驗室設(shè)置和治理。留意試劑質(zhì)量：為適應(yīng)血液混樣檢測對靈敏度的要求，一些國產(chǎn)血篩試〔如匹基〕在考察期間不錯。但仍有待完善，表現(xiàn)在：波動??；國產(chǎn)試劑批間差異問題；特異性問題。因此存在假陰性問題。國產(chǎn)試劑尚在起步階段，尚不能實現(xiàn)自動化，沒有配套軟件。標本留樣和處理：也是核酸檢測質(zhì)量掌握體系中的重要環(huán)節(jié)，否則在檢NAT血液核酸篩查進展趨勢NATNAT