RNA測(cè)序：進(jìn)展、挑戰(zhàn)、機(jī)遇

RNA測(cè)序：進(jìn)展、挑戰(zhàn)和機(jī)遇摘要：在大規(guī)模并行的cDNA測(cè)序或RNA測(cè)序最初應(yīng)用的幾年中，定性和定量轉(zhuǎn)錄有了許多進(jìn)步。近日，幾種RNA測(cè)序方法的發(fā)展對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄給出了一個(gè)更完整的描述。這些進(jìn)展包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)映射的改進(jìn)，特異鏈的具體測(cè)定，融合基因檢測(cè)，小分子RNA的特性和選擇性剪接事件的檢測(cè)。目前的發(fā)展在應(yīng)用RNA測(cè)序方面尤其是RNA的直接測(cè)序及從少量細(xì)胞材料中進(jìn)行RNA的定量分析方面做更近一步的改進(jìn)。在過(guò)去的10年，我們統(tǒng)計(jì)鑒別了從簡(jiǎn)單模式生物到人這些物種的包含DNA修飾和RNA的定性、定量變化這些動(dòng)態(tài)的基因組位點(diǎn)的特性。通過(guò)使用各種基因組測(cè)定包含廣泛的基因組研究引起了他的發(fā)展?，F(xiàn)在我們有了一種新的鑒別復(fù)雜轉(zhuǎn)錄體的方法來(lái)命名一些先前大量不知的編碼和不編碼的RNA種類，尤其是sRNA包含microRNAs,與啟動(dòng)子相關(guān)的RNAs和新發(fā)現(xiàn)的反義與3'端相關(guān)的RNA。最初的轉(zhuǎn)錄研究大量依賴于以芯片技術(shù)為基礎(chǔ)并為全目錄提供有限能力和定量不同的RNA分子的雜交，在表達(dá)上超過(guò)了一個(gè)很寬的水平。高通量的下一代DNA測(cè)序技術(shù)（NGS）的介紹使通過(guò)cDNA的大量測(cè)序進(jìn)行RNA的分析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)生了變革。這種發(fā)展除去了由包含檢測(cè)有限動(dòng)態(tài)范圍在內(nèi)的芯片技術(shù)的許多挑戰(zhàn)。為RNA測(cè)序所建立的NGS平臺(tái)在商業(yè)上被4個(gè)公司購(gòu)買——Illumina,Roche454,HelicosBioSciencesandLifeTechnologies，一些新的技術(shù)則被其他公司所發(fā)展。RNA測(cè)序像基因組研究一樣，NGS公司打算以最低的成本不斷地提高測(cè)序性能這個(gè)平臺(tái)，給出一些像側(cè)通量、閱讀長(zhǎng)度、錯(cuò)誤率、完成成對(duì)堿基閱讀的能力等這些重要的測(cè)序性能。一些研究RNA測(cè)序的新方法提供了越來(lái)越多的更全的有關(guān)真核和原核生物在定性和定量方面轉(zhuǎn)錄生物學(xué)的信息。在這我們討論關(guān)于更廣泛理解轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)方法、正義和反義轉(zhuǎn)錄目錄、提高選擇性剪接的檢測(cè)、基因融合轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)的進(jìn)展，這些在癌癥研究上變得越來(lái)越重要，它所占的比率在幾年之前是無(wú)法想象的。近期方法的發(fā)展也允許之前選擇特殊的RNA分子進(jìn)行RNA測(cè)序，允許轉(zhuǎn)錄組學(xué)有更多的聚焦目標(biāo)。在本文中，我們提供了一些方法的概述，接觸所允許的生物洞察力的類型并集中在他們自己的技術(shù)上。我們提供了不同方法間的比較，為了能夠提供各種應(yīng)用并討論現(xiàn)今的一些缺陷和未來(lái)發(fā)展的潛能。通過(guò)討論兩種新的RNA測(cè)序技術(shù)直接RNA測(cè)序（DRS）和可靠的分鐘RNA測(cè)序方法，我們推斷：他們?cè)跈M向研究和RNA測(cè)序的臨床應(yīng)用方面起著重要的作用。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)圖譜在核苷酸分辨率上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)圖譜（TSSs）對(duì)定義RNA的產(chǎn)物和辨認(rèn)鄰近的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng)子方面是必須的。第一個(gè)高通量的TSS圖譜方法是帽的基因表達(dá)分析（CAGE）方法，他是由最初的Sanger測(cè)序發(fā)展來(lái)的，這是與從帶有完整5‘末端的RNA克隆cDNA產(chǎn)物有關(guān)的測(cè)序。盡管有用，但這個(gè)技術(shù)需要輸入大量的RNA并且每個(gè)TSS只產(chǎn)生很短（20個(gè)核苷酸）的閱讀。這種限制引起了NGS平臺(tái)的CAGE方法的調(diào)節(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了TSS在基因組周圍分布的復(fù)雜性及周圍獨(dú)特的啟動(dòng)子。與CAGE結(jié)合在一起的RNA測(cè)序技術(shù)包括深度CAGE、PEAT、nanoCAGEandCAGEscan，這些共同解決了以CAGE策略為基礎(chǔ)的Sanger測(cè)序的許多技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，通過(guò)使用放大技術(shù)nanoCAGE現(xiàn)在能從10ng的總RNA量做出TSS圖。其次，PEAT的兼容性和雙末端測(cè)序的CAGEscan允許檢測(cè)TSSs下游區(qū)的連通性并促進(jìn)TSSs識(shí)別特殊的轉(zhuǎn)錄。此外，雙末端測(cè)序部分緩和了校正重復(fù)區(qū)單個(gè)短小的閱讀的難度，并允許重復(fù)部分的子集在RNA測(cè)序時(shí)至少有局部的特性。然而，以NGS為基礎(chǔ)的方法有許多說(shuō)明。其中之一就是沒(méi)有目的的檢測(cè)一些擴(kuò)增和其他的操作步驟是否使用，這些已實(shí)施的操作步驟歪曲了對(duì)每個(gè)TSS出現(xiàn)頻率的管抽查結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中的Spike可能對(duì)處理這些問(wèn)題是有用。此外，在cDNA合成和擴(kuò)增協(xié)議發(fā)展之中遇到了多重困難。例如研究者觀察人為制品如引物二聚體,這就控制了測(cè)序的數(shù)據(jù)并減少有效的覆蓋，促進(jìn)SemisuppressivePCR的使用來(lái)減少引物二聚體的頻率。因此，盡管這些方法在定性方面是有用，但提高和建立他們?cè)诙糠矫娴哪芰赡苄枰渌陌l(fā)展。常規(guī)的以RNA為基礎(chǔ)的依賴于cDNA合成或雜交的TSS圖譜方法有一些局限性，這種方法的效率局限于RNA的序列和結(jié)構(gòu)。此外，以RNA為基礎(chǔ)的TSS圖譜對(duì)于像microRNA這種被描述為在高水平上一般的但又自身缺乏迅速降解能力的短暫的轉(zhuǎn)錄是一個(gè)挑戰(zhàn)。這些限制部分再結(jié)合其他方法限制會(huì)被緩和，，如以染色質(zhì)為基礎(chǔ)的TSS預(yù)測(cè)，他是依賴于組蛋白修飾的有效轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)。近來(lái)一些在后轉(zhuǎn)錄加工出現(xiàn)的像5'帽子結(jié)構(gòu)的RNA片段的建議對(duì)整合是有用的。因此，單獨(dú)依賴于CAGE數(shù)據(jù)的TSS圖譜可能會(huì)引起轉(zhuǎn)錄起始事件從RNA加工事件中分離出去的難題。特異鏈的RNA測(cè)序一系列物種轉(zhuǎn)錄組的研究顯示了反義轉(zhuǎn)錄事件的普遍存在。盡管這些事件曾經(jīng)被考慮用來(lái)體現(xiàn)生物技術(shù)，但現(xiàn)在反義轉(zhuǎn)錄的功能是清楚的，并在正常的生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)下起各種作用。因此有一個(gè)關(guān)于轉(zhuǎn)錄組屬性的更深的描述正義鏈和反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的發(fā)展。標(biāo)準(zhǔn)的RNA測(cè)序方法一般需要雙鏈cDNA的合成來(lái)消除RNA鏈的信息。此外，在合成cDNA第一條鏈期間，依靠依賴DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的DNA聚合酶（DDDP）這種反轉(zhuǎn)錄酶的活性產(chǎn)生了人工制造的cDNA的第二條鏈。這能混淆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)的分辨率。放線菌素D作為抑制反轉(zhuǎn)錄酶DDDP活性的物質(zhì)，它的抑制程度會(huì)受影響但并沒(méi)被完全檢測(cè)出。為克服這些難題，發(fā)展了一些轉(zhuǎn)錄鏈特異性的分析策略。這些策略形成了依賴3個(gè)方法之一的特異鏈的信息。第一個(gè)方法包含了RNA尾部或cDNA分子第一條鏈預(yù)定方向上的連接器的結(jié)扎，已知方向上的連接器被作為獲取RNA鏈信息的參考點(diǎn)。第二個(gè)方法是直接對(duì)cDNA的第一條鏈進(jìn)行測(cè)序。最后第三種方法是在cDNA合成的第二條鏈產(chǎn)物或RNA上選擇化學(xué)標(biāo)記。這些策略已經(jīng)為我們了解轉(zhuǎn)錄，包括RNAs轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)圖譜和識(shí)別RNAs相關(guān)的啟動(dòng)子方面開(kāi)始做出貢獻(xiàn)。近期使用釀酒酵母的基因組作為這些策略間進(jìn)行性能比較的一個(gè)參考進(jìn)行了研究，研究者發(fā)現(xiàn)了這些關(guān)于鏈的特異性的水平、平均覆蓋率、庫(kù)的復(fù)雜性等方法之間的不同之處。然而更深的有關(guān)各種方法人工制品和偏差的特異性的對(duì)比研究是缺失的，所以對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行處理的科學(xué)家應(yīng)該意識(shí)到這些問(wèn)題。首先，給出了逆轉(zhuǎn)錄酶在合成cDNA的第一鏈期間形成第二鏈產(chǎn)物的傾向，搞不清楚的是這個(gè)依賴于cDNA第一鏈產(chǎn)物測(cè)序的方法是否完全有鏈的特異性。這些方法通過(guò)鏈的特異性定量閱讀比率報(bào)道了已知反義鏈的方向，好的有附注的基因、與有義鏈方向圖譜相關(guān)的閱讀。調(diào)查顯示一小部分的閱讀是為了定位反義方向；所以這些鏈可能不完全是特異性的鏈。此外，cDNA產(chǎn)物包含第一、第二兩條鏈，不能恰當(dāng)對(duì)參考序列進(jìn)行定位。對(duì)基因組正義和反義的轉(zhuǎn)錄給出了不完全的注釋，甚至在像釀酒酵母這樣較好的研究物種中，也要小心的評(píng)價(jià)這些方法的鏈特異性的真實(shí)程度。理論上，應(yīng)履行以定義化學(xué)合成RNA序列所進(jìn)行的評(píng)估。2.結(jié)扎傾向于有序列的偏好。依賴于結(jié)扎的這一方法需要忍受不同表現(xiàn)性的偏差。在轉(zhuǎn)錄組屬性和核糖體屬性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了偏好的例子，看到了與準(zhǔn)備使用3‘端多聚腺嘌吟酶的庫(kù)相比使用結(jié)扎的庫(kù)不均勻的覆蓋率。3.,內(nèi)部解決或表面擴(kuò)大步驟包含許多額外的附加品介紹方法，例如，以GC形式和復(fù)制體的閱讀。檢查這些影響顯示復(fù)制體閱讀部分的標(biāo)準(zhǔn)范圍為6.1%--94.1%和特異鏈RNA測(cè)序策略的啟迪。RNA模板對(duì)GC的存在有一定的偏見(jiàn)，所以擁有中度的GC含量。期望許多局限能通過(guò)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展或已有測(cè)序技術(shù)的改變和提高得到解決。選擇性剪接模式的特征給出選擇性剪接模式發(fā)展的重要性和已知15%-60%引起突變影響剪接的疾病，他是完整剪接事件的關(guān)鍵目錄和理解如何選擇對(duì)細(xì)胞分化和人類疾病發(fā)展有益的剪接模式。最初使用RNA測(cè)序方法進(jìn)行剪接位點(diǎn)圖譜的研究受到閱讀長(zhǎng)度的限制，阻止了可靠的2個(gè)獨(dú)立部分編碼順序基因組的定位。因此，最初的RNA測(cè)序交替剪接的研究使用了計(jì)算機(jī)來(lái)彌補(bǔ)這一限制。用于定位的參考序列是基因外顯子間所有可能剪接點(diǎn)的人工序列。這些方法改變了我們有關(guān)人為剪接的觀點(diǎn)，如在超過(guò)95%人為外顯子基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)了每個(gè)110000個(gè)新型剪接位點(diǎn)的選擇性結(jié)合。通過(guò)計(jì)算每個(gè)外顯子閱讀圖譜的數(shù)量和每個(gè)剪接點(diǎn)的生成，決定每個(gè)接點(diǎn)剪接效率和不同亞型量化的水平。改進(jìn)現(xiàn)今的測(cè)序技術(shù)能增加閱讀的長(zhǎng)度，更好的閱讀圖譜來(lái)結(jié)合外顯子。這些提高來(lái)源于閱讀區(qū)的分塊，來(lái)定位基因組各自的區(qū)塊。此外，發(fā)展雙末端閱讀方法能從轉(zhuǎn)錄的預(yù)計(jì)閱讀間距離兩點(diǎn)上獲得測(cè)序信息?，F(xiàn)在在不需要先前轉(zhuǎn)錄信息的基礎(chǔ)上能檢測(cè)剪接模式。檢測(cè)剪接模式和轉(zhuǎn)錄連通性和基因組方式需要獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄序列，這些在未來(lái)可能產(chǎn)生新興技術(shù)?；蛉诤蠙z測(cè)與計(jì)算機(jī)分析相結(jié)合的RNA測(cè)序類似于上面所描述的結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)，他也能用來(lái)識(shí)別有病組織中的基因融合現(xiàn)象，尤其是在對(duì)癌癥的研究特別重要。利用單個(gè)閱讀和雙末端閱讀策略檢測(cè)易位和基因組重排從而分析基因組DNA。然而，RNA測(cè)序通過(guò)識(shí)別產(chǎn)生異常的RNA物種能變得更好，因此有一種更高的功能或生物成因或疾病設(shè)置的可能性。此外，基因組DNA方法不能識(shí)別由于非基因組因子，如轉(zhuǎn)移剪接、臨近轉(zhuǎn)錄物間通讀所引起的融合現(xiàn)象。雙末端RNA測(cè)序?qū)θ诤系淖R(shí)別有特別的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗峁┪镔|(zhì)上增長(zhǎng)的覆蓋率。這種方法致使腫瘤學(xué)上重要的發(fā)現(xiàn)，并為調(diào)整治療提供潛在的可能性。對(duì)融合檢測(cè)這些挑戰(zhàn)通常是平行比較這些選擇性剪接檢測(cè)。此外，RNA測(cè)序分析不能檢測(cè)包括擁有編碼序列的其他基因的啟動(dòng)子融合現(xiàn)象。此外，RNA包含嵌合的cDNA人工制品的測(cè)序數(shù)據(jù)在逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增期間產(chǎn)生模板開(kāi)關(guān)。在基因融合識(shí)別中可能導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)，當(dāng)有足夠的通量和測(cè)序性能的RNA長(zhǎng)閱讀測(cè)序技術(shù)變得有效時(shí)，這些不同可能會(huì)部分得到緩和。RNA定向測(cè)序方法盡管依靠生產(chǎn)量和成本的降低使NGC能力得到了發(fā)展，支出為獲得足夠的序列覆蓋率是必須的，臨床應(yīng)用的潛能是被禁止的。應(yīng)用程序包括低風(fēng)度轉(zhuǎn)錄的描述和基因型的測(cè)定，例如，轉(zhuǎn)錄的等位基因在表達(dá)上是不同的。在這些情景，轉(zhuǎn)錄部分越豐富越好，測(cè)序的總成本達(dá)到最少，樣品數(shù)達(dá)到最多。豐富的目標(biāo)策略起初是基因組DNA重新排序所發(fā)展起來(lái)的。許多技術(shù)用來(lái)捕獲基因組DNA的外顯子，給出引起疾病的大部分的突變來(lái)分離編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄組。含polyA的RNA物種測(cè)序提供了一種在不適用豐富策略的條件下對(duì)外顯子測(cè)序的自然途徑。適合mRNA測(cè)序的數(shù)據(jù)用來(lái)識(shí)別核苷酸的變化的潛能近來(lái)在一些研究中得到了證實(shí)。然而，這些研究也強(qiáng)調(diào)了很多挑戰(zhàn)-例如高序列深度需要充分的覆蓋低豐度的轉(zhuǎn)錄。少量的cDNA應(yīng)用的基因組DNA的修飾允許目標(biāo)RNA測(cè)序方法的發(fā)展。定向RNA測(cè)序方法被用于檢測(cè)融合轉(zhuǎn)錄，特異等位基因的表達(dá)，突變和用于轉(zhuǎn)錄的RNA的編輯。定向RNA測(cè)序策略與其他方法相比，現(xiàn)今由于額外的探針或微陣列的準(zhǔn)備和目標(biāo)選擇這些步驟需要較長(zhǎng)的樣品準(zhǔn)備步驟和高的RNA和cDNA輸入量。此外，捕獲效率通常因依賴雜交效率的目標(biāo)區(qū)和其他因子有所不同。過(guò)程的簡(jiǎn)化和捕獲效率的提高是為了得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小RNA性能的分析NGS技術(shù)在sRNA的發(fā)現(xiàn)和特性描述上的影響是特別顯著的。這些研究被其他人廣泛評(píng)論，所以我們不用深入討論這一主題，只需給出完整的簡(jiǎn)單概要。使用焦磷酸測(cè)序初期的sRNA，后來(lái)其他高通量NGS平臺(tái)的使用引起了基因組的調(diào)查和數(shù)目增長(zhǎng)的sRNA的發(fā)現(xiàn)。因?yàn)镹GS樣品的準(zhǔn)備策略是長(zhǎng)的RNA（＞200核苷酸），對(duì)sRNA是不合適的，如隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄，發(fā)展了修飾準(zhǔn)備策略。現(xiàn)今研究sRNA的RNA測(cè)序方法的一個(gè)重要限制是他們沒(méi)有能力提供一個(gè)轉(zhuǎn)錄絕對(duì)量的觀念。他近來(lái)變得清晰，盡管以NGS為基礎(chǔ)的sRNA剪接方法對(duì)不同的表達(dá)分析是有用的，獲得每個(gè)sRNA的閱讀數(shù)量不是找出他實(shí)際豐度所必須的。這一差異看起來(lái)是由于在樣品準(zhǔn)備和測(cè)序期間的偏差引起的。新興技術(shù)能否提高sRNA定量測(cè)定讓人拭目以待。直接RNA測(cè)序cDNA的合成和其他RNA操作限制了一些RNA測(cè)序方法的應(yīng)用。上文提到的，許多現(xiàn)今的RNA方法依賴于cDNA的合成和后來(lái)的操作步驟，這替代了一些應(yīng)用方法的局限。例如，我們所討論的產(chǎn)生人工的cDNA的第二鏈對(duì)特異鏈RNA測(cè)序是困難的。特異鏈庫(kù)準(zhǔn)備禁止這一問(wèn)題，但是方法是使用RNA-RNA連接和建設(shè)。cDNA合成的其他限制是模板開(kāi)關(guān)。在反轉(zhuǎn)錄期間，合成的初期的cDNA有時(shí)會(huì)從RNA中分離出來(lái)，再退火至RNA序列特異性對(duì)初始模板的延伸，產(chǎn)生人工嵌合的cDNA。模板開(kāi)關(guān)能在外顯子-內(nèi)含子界限的識(shí)別和嵌合轉(zhuǎn)錄上產(chǎn)生問(wèn)題。反轉(zhuǎn)錄也能利用獨(dú)立的引物合成cDNA,這一反應(yīng)被認(rèn)為是由于RNA第二結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的自動(dòng)吸引。這引起了cDNA自由合成的產(chǎn)生。此外，反轉(zhuǎn)錄酶與其他酶相比有低的保真度，這源于他們?nèi)狈πＵ龣C(jī)制。從RNA至cDNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率受實(shí)驗(yàn)條件的影響。除他們需要cDNA合成外，現(xiàn)今的RNA測(cè)序方法遇到了其他難題。首先,RNA測(cè)序信號(hào)通過(guò)轉(zhuǎn)錄變得不均勻覆蓋，這就可能在不同步中如隨機(jī)引物設(shè)置、cDNA合成、連接、擴(kuò)增、測(cè)序，引起偏差。第二，統(tǒng)一使用RNA測(cè)序策略由于多重破碎和RNA或cDNA尺寸選擇步驟引起了轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度的偏差。這一偏差導(dǎo)致了下游分析的合并。第三，RNA測(cè)序的定量轉(zhuǎn)錄需要考慮（由于測(cè)序錯(cuò)誤率、重復(fù)單兀、不完整基因組序列和轉(zhuǎn)錄精確）不確定的閱讀圖譜和每個(gè)轉(zhuǎn)錄閱讀圖譜的正?；?。盡管轉(zhuǎn)錄方法的提高和生物信息學(xué)的發(fā)展允許轉(zhuǎn)錄組從頭合成的結(jié)構(gòu)，存在的方法通常不足以檢測(cè)確定的轉(zhuǎn)錄或覆蓋他們?nèi)康拈L(zhǎng)度。與有關(guān)轉(zhuǎn)錄不確定的界限和長(zhǎng)度，因?yàn)橄襁x擇性剪接多聚A位點(diǎn)和啟動(dòng)子的使用，正?；L(zhǎng)度的需要是對(duì)對(duì)定量擴(kuò)增的一個(gè)潛在的錯(cuò)誤源。第四，RNA測(cè)序策略包含豐富的多聚AmRNA.轉(zhuǎn)錄的多聚A通常在轉(zhuǎn)錄降解步發(fā)生，因此豐富的polyA利用RNA轉(zhuǎn)錄聚合酶I豐富了RNA降解產(chǎn)物和各種RNA。直接RNA測(cè)序。現(xiàn)今RNA測(cè)序方法的局限至少通過(guò)RNA分析技術(shù)，包括本質(zhì)上改變了RNA特性描述DRS方法部分得到了緩和。DRS如今需要對(duì)單個(gè)分子的功能進(jìn)行測(cè)序，如在不需cDNA轉(zhuǎn)換下直接擴(kuò)增RNA分子。盡管依賴于RNA的RNA聚合酶是存在的，然而他們適應(yīng)擴(kuò)增的下一代測(cè)序技術(shù)目前是未知的。第一個(gè)巨大并行的DRS方法是利用Heticos單分子測(cè)序平臺(tái)發(fā)展起來(lái)的。他依賴于幾種RNA模板3'端多聚A與單個(gè)通道多聚dT序列相雜交合成序列。這一方法能從總RNA或細(xì)胞裂解物中選擇polyA。測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于上游的polyA位點(diǎn)區(qū)。因此，策略提供了一方法來(lái)獲得基因表達(dá)文件和帽子多聚A位點(diǎn)。缺乏天然polyA尾巴的RNA物種能在體外利用DRS合成polyA。DRS方法的發(fā)展對(duì)象模板開(kāi)關(guān)和合成第二鏈這些cDNA合成的人造品是自由的。提供潛在的應(yīng)用如測(cè)量特異鏈的轉(zhuǎn)錄的提高。此外，依靠應(yīng)用和涉及相對(duì)單一樣品的DRS只需要輸入飛克或attomole水平的RNA。DRS型技術(shù)可能應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)是挑戰(zhàn)了以cDNA為基礎(chǔ)的方法，如生產(chǎn)亞微克水平的RNA，樣本檔案或少量的RNA物種不能輕易轉(zhuǎn)換成cDNA。與需要不同策略來(lái)分析短、長(zhǎng)RNA物種的cDNA方法不同，DRS樣本的準(zhǔn)備涉及到多聚腺苷酸在RNA物種上的應(yīng)用，允許短或長(zhǎng)的RNA在單一試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。DRS在未來(lái)也許能通過(guò)授權(quán)整合目標(biāo)的選擇和測(cè)序步驟中把RNA測(cè)序作為目標(biāo)。這些整合在只有核酸碎片時(shí)降低樣品準(zhǔn)備步驟，通過(guò)輸入必須核酸數(shù)量來(lái)把成本降至最低。對(duì)于DRS的重要的一個(gè)挑戰(zhàn)是產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)水平的閱讀量，通過(guò)改變化學(xué)序列和捕獲模板步驟需要許多RNA應(yīng)用，尤其是定量應(yīng)用，并進(jìn)一步減少錯(cuò)誤率和輸入RNA量。DRS也沒(méi)有解決在上文提到的RNA測(cè)序的所有限制，包括如捕獲polyARNA降解酶產(chǎn)物的問(wèn)題。因此，雙末端方法和DRS和長(zhǎng)閱讀的組合在上文討論的對(duì)不同的應(yīng)用是必須的。包含識(shí)別RNA物種5‘和3'端的研究。少量RNA樣品的設(shè)置生物學(xué)樣本（如組織和體內(nèi)液體）通常是不均勻的，是多種細(xì)胞類型的復(fù)雜的混合物。尤其是在細(xì)胞特殊的選擇和研究中是必須的，但實(shí)現(xiàn)這一工作確是不明確的?，F(xiàn)在幾種像流式細(xì)胞儀（EACS）、液晶顯示模塊（LCM）、系列稀釋、專業(yè)流體裝置和顯微操作工具允許選擇特殊的細(xì)胞類型。此外，從少量的細(xì)胞中分離高質(zhì)量的RNA的方法是有效的。全球分鐘RNA定量裝置與高通量少量樣品RNA方法的不相容性主要限制了可靠性。這些方法的缺失降低了在分辨率、干細(xì)胞生物學(xué)、宏基因組學(xué)、植物生物學(xué)這些區(qū)域的發(fā)展速度。在癌癥和其他疾病的研究中強(qiáng)烈感覺(jué)到了這種局限，例如得到的病原組織通常受到量的限制；分子設(shè)置研究和用于臨床和分子診斷學(xué)間的技術(shù)的轉(zhuǎn)變都是被忽略的。利用大量RNA的輸入進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的策略提供了廣泛的、無(wú)偏見(jiàn)的觀念，因此在很寬的區(qū)域有很大的發(fā)展空間。少量RNA的方法。低量RNA樣品利用全球微陣列和序列技術(shù)的分析需要1個(gè)或更多的擴(kuò)增步驟來(lái)獲得足夠的用于后續(xù)檢測(cè)的核苷酸材料。從早期1990s,幾種為低量RNA的應(yīng)用的核苷酸擴(kuò)增的策略得到了發(fā)展，如連接介導(dǎo)PCR,低重置擴(kuò)增（MDA），單信號(hào)等溫?cái)U(kuò)增和體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的線性擴(kuò)增。這些理想的擴(kuò)增方法提供了精確的幾乎無(wú)錯(cuò)誤的可再生的序列，產(chǎn)生高水平擴(kuò)增來(lái)提供所需定量的核苷酸，從大量物種中提取的核苷酸保護(hù)原樣品中獨(dú)特的RNA分子。通過(guò)測(cè)量微陣列來(lái)進(jìn)行研究，來(lái)分辨擴(kuò)增變異性和差異，尤其是中和低豐度的轉(zhuǎn)錄，更進(jìn)一步降低輸入RNA的量。低量RNA測(cè)序是相對(duì)較新的。近期報(bào)告的mRNA測(cè)序方法依賴于PCR擴(kuò)增步驟，能用于單個(gè)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄屬性的測(cè)定。然而，如此低量RNA測(cè)序方法的再現(xiàn)性可能對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增的偏差有消極的影響，引起一些RNA物種的消失和其他的優(yōu)先擴(kuò)增。例如重復(fù)閱讀和定量能力的降低導(dǎo)致了這些結(jié)果的出現(xiàn)。新興技術(shù)?，F(xiàn)在新型的一系列雜交和測(cè)序方法，可能允許從分鐘細(xì)胞量上得到的可靠的轉(zhuǎn)錄組配置。在測(cè)序方面，nanoCAGE現(xiàn)允許TSS圖譜通過(guò)不同的擴(kuò)增策略總共使用10ng的RNA。擴(kuò)增RNA序列的方法近期因需要輸入RNA量的降低而得到了發(fā)展。一種包含至少約500pgRNA的cDNA第一鏈產(chǎn)物的序列的方法，引發(fā)實(shí)現(xiàn)了oligo-dT或隨機(jī)引物的變化。其他的包含使用poly（dT）引物在序列表面從細(xì)胞裂解液中選擇polyA的方法，允許可產(chǎn)生的從約100細(xì)胞中的基因表達(dá)，消除RNA隔離所引起的RNA的缺失，這對(duì)減少輸入細(xì)胞數(shù)量方面尤其重要。像上面描述的，DRS消除了cDNA合成階段，僅需要包含polyA尾部或體外RNA多聚腺苷酸的馬克級(jí)的RNA分子。他也使微流體能力與單細(xì)胞DRS的應(yīng)用連到一起成為一種可能。提供少量的R