骨橋蛋白對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)的影響

骨橋蛋白對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)的影響羅偉;張方杰;李宇晟;雷光華【摘要】BACKGROUND:Bothosteopontinandhyaluronicacidinvolveinthepathologicalprocessofosteoarthritis,resultingintheabnormalexpressionlevelsofvariouscytokinesandenzymes.However,therelationshipbetweenthehighexpressionofosteopontinandhyaluronicacidinchondrocytesremainsunclear.<br>OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofosteopontinontheexpressionofhyaluronicacidinhumankneeosteoarthriticchondrocytesinvitrobymodulatingthelevelofosteopontin.<br>METHODS:Chondrocytesfromhumankneeosteoarthriticcartilagewereculturedinvitro,andwerethendividedintothreegroups:blankcontrolgroupwithoutanytreatment;osteopontingroupandandpontinsiRNAgroupweretreatedwith1mg/LrecombinanthumanosteopontinandosteopontinsiRNA,respectively.Expressionlevelsofosteopontin,hyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAweredetectedbyreal-timePCR,andthelevelsofhyaluronicacidweremeasuredusingELISA.<br>RESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththeblankcontrolgroup,themRNAexpressionsofhyaluronicacidsynthase1,2and3wereremarkablyincreasedintheosteopontingroup,whilesiRNAmadethesignificantlyinhibitoryeffectsonthehyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAexpressions(P<0.05).Thelevelofhyaluronicacidinchondrocytesintheosteopontingroupwassignificantlyhigherthanthatintheothertwogroups(P<0.05).Ourresultssuggestthatosteopontininducesthesynthesisofhyaluronicacidinosteoarthriticchondrocytesthroughupregulatingthehyaluronicacidsynthasesexpressionlevels.%背景：在骨關(guān)節(jié)炎病程中，骨橋蛋白水平和透明質(zhì)酸水平的改變可以使一系列細(xì)胞因子和酶表水平改變，但是軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白高表達(dá)是否與透明質(zhì)酸高表達(dá)相關(guān)目前尚不楚。<br> 目的：通過(guò)調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的骨橋蛋白水平，觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)水平的影響。<br> 方法：從人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織標(biāo)本中獲取并體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)，骨橋蛋白干預(yù)組以1mg/L重組人骨橋蛋白干預(yù)，骨橋蛋白siRNA組以骨橋蛋白siRNA進(jìn)行干預(yù)。采用realtimePCR法檢測(cè)各組骨橋蛋白，透明質(zhì)酸合成酶1，透明質(zhì)酸合成酶2和透明質(zhì)酸合成酶3mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)透明質(zhì)酸水平。<br> 結(jié)果與結(jié)論：①與空白對(duì)照組相比，重組人骨橋蛋白干預(yù)組透明質(zhì)酸合成酶1，2，3表達(dá)升高，而骨橋蛋白siRNA干預(yù)組透明質(zhì)酸合成酶1，2，3表達(dá)下降，3組間透明質(zhì)酸合成酶1，2，3表達(dá)比較差異均有顯著性意義(P<0.05)；②重組人骨橋蛋白干預(yù)組軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組和骨橋蛋白siRNA干預(yù)組(P<0.05)。③結(jié)果說(shuō)明，提示骨橋蛋白可以通過(guò)刺激透明質(zhì)酸合成酶分泌進(jìn)而誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)?！酒诳Q】《中國(guó)組織工程研究》【年(卷),期】2016(020)042【總頁(yè)數(shù)】8頁(yè)(P6244-6251)【關(guān)鍵詞】組織構(gòu)建;軟骨細(xì)胞;骨橋蛋白;透明質(zhì)酸;透明質(zhì)酸酶;骨關(guān)節(jié)炎;國(guó)家自然科學(xué)基金【作者】羅偉;張方杰;李宇晟;雷光華【作者單位】中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科，湖南省長(zhǎng)沙市410008;中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科，湖南省長(zhǎng)沙市410008;中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科，湖南省長(zhǎng)沙市410008;中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科，湖南省長(zhǎng)沙市410008;中南大學(xué)骨科研究所，湖南省長(zhǎng)沙市410008【正文語(yǔ)種】中文R318引用本文：羅偉，張方杰，李宇晟，雷光華.骨橋蛋白對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20(42):6244-6251.文章快速閱讀：羅偉，男，1983年生，湖北省廣水市人，漢族，2009年北京大學(xué)畢業(yè)，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)外科，關(guān)節(jié)鏡，骨腫瘤的研究。(2016)42-06244-08稿件接受：2016-07-20文題釋義：骨橋蛋白：1979SengerRGD相似，人們將其命名為OPN。后來(lái)一些學(xué)者在不同的組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了骨橋蛋白，因此骨橋蛋白曾被稱為44kD骨酸蛋白，PP69、骨延蛋白1、尿蛋白、分泌的磷蛋白、骨唾液酸蛋白、44kD骨磷蛋白和2aR。自1986年來(lái)相繼克隆了大、小鼠骨橋蛋白，人骨橋蛋白，豬骨橋蛋白，牛骨橋蛋白，雞骨橋蛋白和兔骨橋蛋白cDNA。近年來(lái)，骨橋蛋白在早期細(xì)胞免疫應(yīng)答、肉芽腫炎癥、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的作用中倍受關(guān)注。反轉(zhuǎn)錄酶：是一種存在于部分RNA病毒中具有反轉(zhuǎn)錄活性、能以單鏈RNA作為DNADNADNA(cDNA)。反轉(zhuǎn)RT-PCRRNADNARNA背景：在骨關(guān)節(jié)炎病程中，骨橋蛋白水平和透明質(zhì)酸水平的改變可以使一系列細(xì)胞因子和酶表達(dá)水平改變，但是軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白高表達(dá)是否與透明質(zhì)酸高表達(dá)相關(guān)目前尚不清楚。胞透明質(zhì)酸表達(dá)水平的影響。方法：從人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織標(biāo)本中獲取并體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為 3組空白對(duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)，骨橋蛋白干預(yù)組以1mg/L重組人骨橋蛋白干預(yù)，骨橋蛋白siRNA組以骨橋蛋白siRNA進(jìn)行干預(yù)。采用realtimePCR法檢測(cè)各組骨橋蛋白，透明質(zhì)酸合成酶1，透明質(zhì)酸合成酶2和透明質(zhì)酸合成酶3mRNA表達(dá)ELISA法檢測(cè)透明質(zhì)酸水平。結(jié)果與結(jié)論：①與空白對(duì)照組相比，重組人骨橋蛋白干預(yù)組透明質(zhì)酸合成酶1，2，3表達(dá)升高，而骨橋蛋白siRNA干預(yù)組透明質(zhì)酸合成酶1，2，3表達(dá)下降，3組1，2，3P＜0.05siRNA組織構(gòu)建；軟骨細(xì)胞；骨橋蛋白；透明質(zhì)酸；透明質(zhì)酸酶；骨關(guān)節(jié)炎；國(guó)家自然科學(xué)基金主題詞：骨橋蛋白；軟骨細(xì)胞；透明質(zhì)酸；骨關(guān)節(jié)炎；組織工程國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81401838)；中南大學(xué)自由探索計(jì)劃(2012QNZT095)BACKGROUND:Bothosteopontinandhyaluronicacidinvolveinthepathologicalprocessofosteoarthritis,resultingintheabnormalexpressionlevelsofvariouscytokinesandenzymes.However,therelationshipbetweenthehighexpressionofosteopontinandhyaluronicacidinchondrocytesremainsunclear.OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofosteopontinontheexpressionofhyaluronicacidinhumankneeosteoarthriticchondrocytesinvitrobymodulatingthelevelofosteopontin.METHODS:Chondrocytesfromhumankneeosteoarthriticcartilagewereculturedinvitro,andwerethendividedintothreegroups:blankcontrolgroupwithoutanytreatment;osteopontingroupandandpontinsiRNAgroupweretreatedwith1mg/LrecombinanthumanosteopontinandosteopontinsiRNA,respectively.Expressionlevelsofosteopontin,hyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAweredetectedbyreal-timePCR,andthelevelsofhyaluronicacidweremeasuredusingELISA.RESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththeblankcontrolgroup,themRNAexpressionsofhyaluronicacidsynthase1,2and3wereremarkablyincreasedintheosteopontingroup,whilesiRNAmadethesignificantlyinhibitoryeffectsonthehyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAexpressions(P＜0.05).Thelevelofhyaluronicacidinchondrocytesintheosteopontingroupwassignificantlyhigherthanthatintheothertwogroups(P＜0.05).Ourresultssuggestthatosteopontininducesthesynthesisofhyaluronicacidinosteoarthriticchondrocytesthroughupregulatingthehyaluronicacidsynthasesexpressionlevels.Subjectheadings:Osteopontin;Chondrocytes;HyaluronicAcid;Osteoarthritis;TissueEngineeringFunding:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.81401838;theFreeExplorationProgramofCentralSouthUniversity,No.2012QNZT095Citethisarticle:LuoW,ZhangFJ,LiYS,LeiGH.Effectofosteopontinontheexpressionofhyaluronicacidinhumankneeosteoarthriticchondrocytes.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(42):6244-6251.LuoWei,M.D.,Attendingphysician,DepartmentofOrthopedics,XiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410008,HunanProvince,China透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)是一種高分子量的葡萄糖胺聚糖(GAG)，在機(jī)體泌合成的細(xì)胞外基質(zhì)組成，除了水之外，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原框架(主要是Ⅱ型膠原)、蛋白聚糖及透明質(zhì)酸。由大分子聚合物組成的透明質(zhì)酸，可連接軟本生物化學(xué)特性[1]。透明質(zhì)酸產(chǎn)量的調(diào)節(jié)主要依賴于透明質(zhì)酸合成酶的代謝。有31和透明質(zhì)酸合成酶2聚合形成大分子量透明質(zhì)酸，而透明質(zhì)酸合成酶3則生成低2免疫細(xì)胞的功能和炎性遞質(zhì)的表達(dá)[3]，組織中表達(dá)的透明質(zhì)酸的分子量和濃度發(fā)生改變，其作為炎性遞質(zhì)產(chǎn)生抗炎作用的功能也隨之發(fā)生改變[4-5]。骨橋蛋白是一類(lèi)小的整聯(lián)蛋白結(jié)合配體N端聯(lián)結(jié)糖蛋白(SIBLINGs)家族的一員，它廣泛存在于礦化組織的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外液、炎性區(qū)域中[6]。軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均可分泌骨橋蛋白。在胚胎骨骺生長(zhǎng)板中的肥大軟骨細(xì)胞和骨形成細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有骨橋蛋白存在，研究表明，骨橋蛋白參與了正常關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)生、修復(fù)以及代謝穩(wěn)態(tài)的維持過(guò)程，并都發(fā)揮了重要作用[7-8]。透明質(zhì)酸是關(guān)節(jié)滑液的主要成分之一，透明質(zhì)酸由關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞合成后即被釋放進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，積聚在軟骨和韌帶表面，在關(guān)節(jié)潤(rùn)滑和維持關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮主要作用[1，9]。研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量均發(fā)生了改變，且在疾病慢性低度炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用。透明質(zhì)酸可以通過(guò)降低腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素8等而在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用[10-11]。血清透明質(zhì)酸水平可作為放射學(xué)骨關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)標(biāo)志[12]。關(guān)節(jié)內(nèi)注射大分子透明質(zhì)酸已被臨床用于補(bǔ)充膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)黏彈性，并可延緩骨關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展[13mRNA[14]。骨橋蛋白可通過(guò)促進(jìn)雙水焦磷酸鈣在關(guān)節(jié)軟骨中沉著，形成病理性鈣沉積，從而引起骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨變性[15]；隨后，研究發(fā)現(xiàn)，在人膝骨關(guān)節(jié)炎患者的血漿、滑液和關(guān)節(jié)軟骨中骨橋蛋白水平上升并與關(guān)節(jié)破壞程度相關(guān)[16-17]?？墒芄菢虻鞍渍{(diào)控的金屬基質(zhì)蛋白酶13、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖等在骨關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程中也具有重要地位。然而，骨橋蛋白和透明質(zhì)酸的關(guān)系以及在人骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中，骨橋蛋白能否影響透明質(zhì)酸的表達(dá)仍不明確。實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的骨橋蛋白水平，觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸的表達(dá)水平的影響。設(shè)計(jì) 分組對(duì)比設(shè)計(jì)。時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2014年1至4月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。材料 共計(jì)7例骨關(guān)節(jié)炎軟骨標(biāo)本，均來(lái)自于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院住院患者人工表面膝關(guān)節(jié)置換中切除的軟骨。以上標(biāo)本的取材均先告知患者并征得同意。納入標(biāo)準(zhǔn) ①采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)制定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007版)》中的膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；②原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者，近6個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸或其他藥物注射治療，未口服治療骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)藥物；③年55-65歲。6實(shí)驗(yàn)方法人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng) 取膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中脛骨平臺(tái)側(cè)標(biāo)本，以用PBS漂洗干凈后，削取表面軟骨塊并剪碎成1mm×1mm大小，再裝至15mL離心管，每管中加入兩三倍組織體積量Ⅱ型膠原酶，充分混勻后置入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，12-16h后見(jiàn)軟骨組織大部分消融后取出。將離心管內(nèi)含軟骨組織混合液倒入60目濾網(wǎng)過(guò)濾，再將濾液以吸管轉(zhuǎn)移至15mL離心管并加入PBS至12mL，再以800r/min離心6min后取出離心管，棄上清液，取最下層渾濁液約3mL即為含軟骨細(xì)胞的濾液。在濾液中加入6-8mL體積分?jǐn)?shù)15%的FBS，DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含1%鏈霉素和青霉素)使軟骨細(xì)胞一般以1×108L-1細(xì)胞濃度分裝至25mm2培養(yǎng)瓶后放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱。以后3-5d更換1次培養(yǎng)基，每次用量3-5mL。80%時(shí)即可傳代。傳代5mLPBS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶-EDTA)1mL0.05%胰蛋白酶-EDTA并使之布滿瓶底，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中5min后取出，顯微鏡見(jiàn)細(xì)胞成圓形漂浮流動(dòng)時(shí)加入8-10mL含15%FBSDMEM/F12完全培養(yǎng)基(含1%鏈霉素和青霉素)，混勻后分裝至兩個(gè)25mm2培養(yǎng)瓶后放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中。siRNA骨橋蛋白特異性siRNA片段按照ReynoldsA[18]總結(jié)出理性設(shè)計(jì)有效siRNA的8條原則：①GC含量在30%-52%之間；②正義鏈15-19位至少有3個(gè)A或U；19A310U19GC；⑧13G。由上海InvitrogenSiRNA1。siRNARNase-freeH2O20μmol/L(lipo2000siRNA6nmol/LsiRNA-lipo20001500μL(v2，含15%FBSDMEM/F124-6hsiRNA-lipo200037℃，5%CO224h。倒置熒光顯微鏡中觀察帶熒光Anoligonucleotide(陰性對(duì)照)片段轉(zhuǎn)染效率。軟骨細(xì)胞骨橋蛋白siRNA轉(zhuǎn)染效率的鑒定和篩選 干預(yù)24h后，提取軟骨細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其A值，測(cè)算RNA濃度和總量。RNA純度為A260/A280=1.8-2.0由于A260為1的RNA溶液中約含有40mg/L。因此所提取的RNA濃度為(mg/L)=A260值×40mg/L×稀釋倍數(shù)。RNA總量(μg)=RNA濃度×總體積(mL)。RNA反轉(zhuǎn)錄制造cDNA，然后進(jìn)行RealtimeQPCR檢測(cè)骨橋蛋白mRNA表達(dá)。細(xì)胞活性檢測(cè)(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞活性。篩選轉(zhuǎn)染效率最高的一組應(yīng)用于下一步實(shí)驗(yàn)。分組干預(yù)實(shí)驗(yàn) 取第1代軟骨細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，先予以含1%FBSDMEM/F12培養(yǎng)24h，從而使細(xì)胞同步化出現(xiàn)在非活動(dòng)期和非增殖期。然后再繼續(xù)給予含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基孵育。每個(gè)樣本3份，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)，重組人骨橋蛋白干預(yù)組以1mg/L干24h，骨橋蛋白siRNA組以篩選出從骨橋蛋白siRNA進(jìn)行干預(yù)24h?？俁NA樣本制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照RNAsimpleTotalRNAKit總RNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行提取。瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA質(zhì)量；紫外分光光度儀測(cè)，A260/A280＞1.8，檢驗(yàn)總RNA純度并計(jì)算其濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA(RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit，F(xiàn)ermentas.)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。人骨橋蛋白、β-actin、透明1，2，3RealtimeQPCRInvitrogen2。RealtimeQPCR反應(yīng) 25μL反應(yīng)體系，操作步驟按照Maxima?SYBR?Green/ROXqPCRMasterMix(2X)，F(xiàn)ermentas.說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果以cDNA分別和3對(duì)引物進(jìn)行RealtimeQPCR反應(yīng)，獲得擴(kuò)增曲線、熔解曲線，依據(jù)Ct值計(jì)算2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=[樣本A(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)-樣本B(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)]，得出骨橋蛋白，透明質(zhì)酸合成酶1，透明質(zhì)酸合成酶2和透明質(zhì)酸合成酶3的mRNA相對(duì)水平。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá) 分析結(jié)果以Gelpro4.0版凝膠吸光度分軟件進(jìn)行分析，測(cè)其IOD(integratedopticaldensity)累積吸光度參考值。ELISA0，50，100，500，1000，2000ng/L)應(yīng)用固相夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)的透明質(zhì)酸檢測(cè)試實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品、生物素標(biāo)記物和酶標(biāo)記物與包被在微孔上的抗體一起溫育反應(yīng)使其充分結(jié)合在微孔壁上，若樣品中含有該因子的抗原則會(huì)形成抗體，抗原，抗體復(fù)合物。反應(yīng)過(guò)后沖洗掉未結(jié)合的部分，再加入底物反應(yīng)，底物在酶的作用下變?yōu)樗{(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為最終的黃色。通過(guò)讀取吸光度值來(lái)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上反算出待測(cè)樣品的濃度。主要觀察指標(biāo)①不同干預(yù)組間骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中目的基因骨橋蛋白，透1，2，3mRNA預(yù)組間骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中透明質(zhì)酸表達(dá)水平的差異。SPSS17.0Student-Newman-Keuls人膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)及骨橋蛋白siRNA轉(zhuǎn)染鑒定 ①原代骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞貼壁后，成團(tuán)生長(zhǎng)，以此為中心向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞多呈橢圓形短梭形或三角形(圖1A)；②抗Ⅱ型膠原抗體1∶1000染色(圖1B)；③熒光顯微鏡示大多數(shù)軟骨細(xì)胞已轉(zhuǎn)染siRNA(＞90%)(圖1C)；④MTT檢測(cè)示各組間細(xì)胞生存率差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)(圖1D)；⑤mRNA鑒定示mRNA完整(圖1E)；⑥RealtimePCRNC-siRNAsiRNAmRNAP＜0.05siRNA-11F)siRNA-1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及分析RealtimePCRβ-Actin1232A-ESmRNA1，2，3以及透明質(zhì)酸表達(dá)的差異與空白對(duì)照組相比，重組人骨橋蛋白干預(yù)組骨橋蛋白mRNA升高(3.53±0.17)倍，骨橋蛋白siRNA干預(yù)組骨橋蛋白mRNA水平降低(0.62±0.21)倍，3組之間差異有顯著性意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3A。與空白對(duì)照組相比，重組人骨橋蛋白干預(yù)組骨橋蛋白表達(dá)水平升高(1.68±0.23)倍，骨橋蛋白siRNA干預(yù)組骨橋蛋白表達(dá)水平降低(0.72±0.20)倍，3組之間差異有顯著性意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3B。1mRNA高(2.32±0.23)siRNA1mRNAP＜0.053C。2mRNA高(3.31±0.10)siRNA2mRNAP＜0.053D。3mRNA高(7.28±0.31)siRNA3mRNAP＜0.053E。與空白對(duì)照組(299.7±3.00)ng/L相比，重組人骨橋蛋白干預(yù)組透明質(zhì)酸表達(dá)水平升高(884.00±7.61)ng/L，骨橋蛋白siRNA干預(yù)組透明質(zhì)酸表達(dá)水平降低(207.02±4.07)ng/L，3組之間差異有顯著性意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3F。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，透明質(zhì)酸合成酶1mRNA，透明質(zhì)酸合成酶2mRNA及透明質(zhì)酸合成酶3mRNA都有表達(dá)，ELISA法顯示其中透明質(zhì)酸表達(dá)濃度(299.7±3.00)ng/L。軟骨細(xì)胞予1mg/L重組人骨橋蛋白干預(yù)24h后，其透明質(zhì)酸合成酶1mRNA，透明質(zhì)酸合成酶2mRNA及透明質(zhì)酸合成酶3mRNA表達(dá)水平分別升高(2.32±0.23)倍，(3.31±0.10)倍和(7.28±0.31)倍；透明質(zhì)酸表達(dá)濃度升高為(884.00±7.61)ng/L。軟骨細(xì)胞予骨橋蛋白siRNA干預(yù)24h后，其透明質(zhì)酸合成酶1mRNA，透明質(zhì)酸合成酶2mRNA及透明質(zhì)酸合成酶3mRNA表達(dá)水平分別降低為(0.51±0.05)倍，(0.59±0.02)倍和(0.37±0.06)倍；透明質(zhì)酸表達(dá)濃度降低為(207.02±4.07)ng/L。且3組之間差異有顯著性意義。的行為，也可直接與細(xì)胞發(fā)生作用從而影響細(xì)胞行為[1，9]，在關(guān)節(jié)潤(rùn)滑和維持關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮主要作用，參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要過(guò)程[1，10]。研究證實(shí)，人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，骨橋蛋白水平的變化可同時(shí)影響透明質(zhì)酸合成酶mRNAmRNA病理過(guò)程；在多種疾病中，骨橋蛋白與透明質(zhì)酸水平都存在一致性[19-20]；有研2不明確。3mRNA3mRNA12mRNA32N5C80%相同序列的中心細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，31105-106u，而透明質(zhì)酸合成酶2和透明質(zhì)酸合成酶3的產(chǎn)物分子量約為其2倍，22×106u[1]2織所必需的透明質(zhì)酸和維持正常軟骨基質(zhì)方面具有關(guān)鍵作用[2，22]。透明質(zhì)酸合32，22-23]，但是表達(dá)水2，而體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞則不一定可以表達(dá)透明質(zhì)酸合成1[223mRNA2mRNA實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白和透明質(zhì)酸均參與了骨關(guān)節(jié)炎一系列病理過(guò)程：在人膝骨關(guān)節(jié)炎患者的血漿，滑液和關(guān)節(jié)軟骨中骨橋蛋白水平上升并與關(guān)節(jié)破壞程度相關(guān)[16-17]?？墒芄菢虻鞍渍{(diào)控的金屬基質(zhì)蛋白酶13、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖等在骨關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程中也具有重要地位。透明質(zhì)酸可以通過(guò)降低腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素8等而在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用[10-11]。血清透明質(zhì)酸水平可作為放射學(xué)骨關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)標(biāo)志[12]。最近有研究發(fā)現(xiàn)滑膜成纖維細(xì)胞中，骨橋蛋白和透明質(zhì)酸共同參與了骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎的發(fā)病病理過(guò)程。然而，骨橋蛋白和透明質(zhì)酸研究證實(shí)，在人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，骨橋蛋白可以通過(guò)調(diào)控透明質(zhì)酸合成酶分泌進(jìn)而誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中透明質(zhì)酸的表達(dá)，初步揭示了骨橋蛋白和透明質(zhì)酸的共同作用參與了骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病病理過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白可以誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中透明質(zhì)酸的表達(dá)，目前，尚未見(jiàn)相關(guān)類(lèi)似研究報(bào)道。然而，有關(guān)兩者共同作用的具體機(jī)制并不清楚，亟需進(jìn)一步研究探索。結(jié)論：骨橋蛋白可以通過(guò)調(diào)控透明質(zhì)酸合成酶分泌進(jìn)而誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸表達(dá)。作者貢獻(xiàn)：第一作者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施和成文，通訊作者審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問(wèn)題：受試者對(duì)本研究有一定了解，并在自由意志下同意獲取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，對(duì)所提供標(biāo)本者無(wú)人身?yè)p害，并簽署術(shù)中無(wú)償提供軟骨組織知情同意書(shū)。研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。CNKI3文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對(duì)研究和撰寫(xiě)的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù))記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷(xiāo)毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。【相關(guān)文獻(xiàn)】Pavlovi?M,Adami?M,SchullerPetrovi?S.Theactualroleofhyaluronicacid-basedandcalciumhydroxylapatitesofttissuefillers:aguideforapracticingdermatologist.GItalDermatolVenereol.2012;147(3):295-314.NeumanMG,NanauRM,Oru?a-SanchezL,etal.Hyaluronicacidandwoundhealing.JPharmPharmSci.2015;18(1):53-60.NonakaT,KikuchiH,IkedaT,etal.Hyaluronicacidinhibitstheexpressionofu-PA,PAI-1,andu-PARinhumansynovialfibroblastsofosteoarthritisandrheumatoidarthritis.JRheumatol.2000;27(4):997-1004.CantorJO,NadkarniPP.Hyaluronan:theJekyllandHydemolecule.InflammAllergyDrugTargets.2006;5(4):257-260.SternR,AsariAA,SugaharaKN.Hyaluronanfragments:aninformation-richsystem.EurJCellBiol.2006;85(8):699-715.RittlingSR,SinghR.OsteopontininImmune-mediatedDiseases.JDentRes.2015;94(12):1638-1645.El-TananiMK.Roleofosteopontinincellularsignalingandmetastaticphenotype.FrontBiosci.2008;13:4276-4284.StandalT,BorsetM,SundanA.Roleofosteopontininadhesion,migration,cellsurvivalandboneremodeling.ExpOncol.2004;26(3):179-184.MiglioreA,ProcopioS.Effectivenessandutilityofhyaluronicacidinosteoarthritis.ClinCasesMinerBoneMetab.2015;12(1):31-33.HenrotinY,RamanR,RichetteP,etal.Consensusstatementonviscosupplementationwithhyaluronicacidforthemanagementofosteoarthritis.SeminArthritisRheum.2015;45(2):140-149.WangCT,LinYT,ChiangBL,etal.Highmolecularweighthyaluronicaciddown-regulatesthegeneexpressionofosteoarthritis-associatedcytokinesandenzymesinfibroblast-likesynoviocytesfrompatientswithearlyosteoarthritis.OsteoarthritisCartilage.2006;14(12):1237-1247.ElliottAL,KrausVB,LutaG,etal.Serumhyal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