液相色譜概述與基本原理

液相色譜概述與基本原理主要內(nèi)容色譜概述色譜法的定義與分類色譜法的分離原理色譜法中基本術(shù)語液相色譜法的分類及其分離原理定性定量計算概述色譜法的起源：俄國植物學家茨維特（Tswett）1901年發(fā)現(xiàn)利用吸附原理分離植物色素（a）加入樣品溶液（b）加入洗脫液概述色譜法的發(fā)展史：1903年發(fā)表文章1906年Tswett創(chuàng)立“chromatography”-“色譜法”新名詞1907年在德國生物會議上第一次向世界公開展示顯現(xiàn)彩色環(huán)帶的柱管1931年奧地利化學家R庫恩（RKuhn）分離出三種胡蘿卜素異構(gòu)體1935年adamsandholmes發(fā)明里苯酚-甲醛型離子交換樹脂，進一步發(fā)明了離子色譜1938年izmailov發(fā)明了薄層色譜1941年martinandsynge發(fā)明了液-液分配色譜概述色譜法的發(fā)展史：1944年consden,gordonandmartin發(fā)明了紙色譜1952年martinandsynge發(fā)明了氣-液分配色譜1954年ray發(fā)明了熱導檢測器1957年martinandgolay發(fā)明了毛細管色譜1959年porathandflodin發(fā)明了凝膠色譜1960年液相色譜技術(shù)完善色譜法的定義與分類色譜法的定義：色譜或色譜法也稱之為色層發(fā)或?qū)游龇?，是一種物理化學分析方法，它利用混合物中各物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差別，當溶質(zhì)在兩相間相對移動時，各物質(zhì)在兩相間進行多次分配，從而使各組分得到分離。將色譜分離技術(shù)應用于分析化學，成為色譜分析。色譜法的定義與分類色譜法的分類：按物理狀態(tài)分類根據(jù)流動相的物態(tài)：氣相色譜（GC）和液相色譜（LC）根據(jù)固定相的物態(tài)分：氣-固色譜、氣-液色譜、液-固色譜、液-液色譜按照使用的形式分類柱色譜、紙色譜、薄層色譜按照分離機理分吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜按照使用領域分類分析用色譜、制備色譜、流程色譜色譜法的定義與分類色譜法的特點（三高、一快、一廣）：分離效率高應用范圍廣分析速度快樣品用量小靈敏度高（適用于微量和痕量分析）分離和測定一次完成易于自動化色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）：高效液相色譜法是二十世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型的分離分析技術(shù)，目前已經(jīng)成為應用非常廣范的化學分離分析的重要手段，它是在經(jīng)典液相色譜的基礎上引入了氣相色譜理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏的檢測器，因而具備流速快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好的了解高效液相色譜儀的特點，我們從以下兩個方面進行比較。色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與經(jīng)典液相色譜法：高效液相色譜法比起經(jīng)典的液相色譜法的最大的優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分.色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與經(jīng)典液相色譜法：經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相柱效低（H↑，n↓）分析周期長無法在線檢測HPLC：分離和分析柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相柱效高（H↓，n↑）分析時間大大縮短可以在線檢測色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與氣相色譜法：氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與氣相色譜法：氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作?？傊咝б合嗌V法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與氣相色譜法：相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與氣相色譜法：1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測，占有機物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子，和離子型樣品均可檢測，用途廣泛，占有機物的80%色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與氣相色譜法：2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性色譜法的定義與分類高效液相色譜法（HPLC）與氣相色譜法：3．操作條件差別GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┥V法的原理基本理論熱力學理論：塔板理論-平衡理論動力學理論：速率理論-vander方程色譜法的原理塔板理論：把色譜柱假想成一個分餾塔，由許多彼此獨立的塔板組成，每一塔板的柱長為塔板高度（H）；在每一塔板內(nèi)，一部分空間由固定相占據(jù)，另一部分由流動相占據(jù)，流動相占據(jù)的空間稱為板體積（△V）；在每一塔板上，物質(zhì)在流動相和固定相之間立即建立起分配平衡。色譜法的原理塔板理論方程：

該分配過程符合二項式分配定理(mS+mM)n展開式的系數(shù)項。由此可得，流出曲線方程同樣根據(jù)流出曲線方程和二項式定理，可得到塔板理論方程，即H=L/n色譜法的原理塔板理論方程：

若扣除死時間（體積）的影響，得到有效塔板數(shù)（n’）和有效塔板高度(H’)：

它們比理論塔板數(shù)及高度，能更有效地反映色譜分離好壞與塔板數(shù)和塔板高度之間的對應關(guān)系。一般說來，色譜柱的理論塔板數(shù)越大，表示組分在色譜柱中達到分配平衡的次數(shù)越多，越有利于分離

色譜法的原理速率理論：注：色譜峰的總擴張等于各獨立因素對擴張影響之和；色譜柱的總板高等于各獨立因素對板高貢獻之和，減少A、B/U、CU、三項的值，可以降低理論塔板高度，減少色譜峰的擴張，提高柱效。1渦流擴散項因為顆粒形狀＆大小引起的2縱向擴散項（分子擴散）由濃度梯度引起的自由擴散3傳質(zhì)阻力項流動相和固定相之間的質(zhì)量交換色譜法的原理渦流擴散：渦流擴散項：多徑性引起擴張色譜法的原理渦流擴散：渦流擴散項（A）：根據(jù)上述公式，λ是和色譜柱中載體顆粒大小及分布、填充均勻情況有關(guān)的常數(shù)，粒度適中，粒度分布窄，λ值就小，所以A就小，柱效就高；dp是載體顆粒的平均直徑，dp越小，A值越小，并且λ和dp之間要協(xié)調(diào)。色譜法的原理縱向擴散：色譜法的原理傳質(zhì)阻力：色譜法的原理速率理論方程：色譜法中基本術(shù)語液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：色譜圖：各組分的濃度隨流出時間而分布的曲線稱為色譜曲線，常稱為色譜曲線圖或色譜圖。色譜法中基本術(shù)語液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：基線：沒有樣品進入檢測器時，記錄儀記錄的是一條直線，這條直線稱為基線。噪音：基線發(fā)生細小波動的現(xiàn)象?；€是在實驗操作條件下，反映檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化的曲線。色譜峰高、色譜峰寬、半寬峰高（H）：指色譜峰最高點到基線的距離。峰寬（W）：在流出曲線拐點處做切線，分別于基線上相交兩點，此兩點間的距離叫峰寬。半寬（W1/2）：峰高一半處的色譜峰的寬度。由于色譜峰頂呈圓弧型，色譜峰的半峰寬并不等于峰寬的一半。色譜法中基本術(shù)語液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：保留值：表示被測組分從進樣到色譜柱后濃度出現(xiàn)最大值時所需要的時間，叫做保留值。死時間（tm）：不被固定相吸收或吸附的物質(zhì)通過色譜柱的時間死體積（vm）：色譜柱中不被固定相占據(jù)的空間及進樣系統(tǒng)管道和檢測系統(tǒng)的中體積，等于死時間乘以流動相的流速。保留時間（tr）：是被測組分從進樣開始到色譜峰出現(xiàn)濃度最大的時間。等于組分在流動相中停留的時間+在固定相中停留的時間。調(diào)整保留時間（t’r）：保留時間減去死時間，實際上是組分在固定相中所滯留的時間。色譜法中基本術(shù)語液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：保留值：表示被測組分從進樣到色譜柱后濃度出現(xiàn)最大值時所需要的時間，叫做保留值。相對保留值：在一定色譜條件下被測化合物和標準化合物調(diào)整保留時間之比：r’i,s=t’R(i)/t’R(s)

說明：r’i,s值越大，

色譜法中基本術(shù)語液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：容量因子（K’）：是在平衡狀態(tài)下組分在固定相與流動相中質(zhì)量之比，即K’=t’R/tM色譜柱的柱效率和分離度理論塔板數(shù)（n）：色譜柱的柱效率可以用理論塔板數(shù)（n）或理論塔板高度（H）來表示注：保留時間越長，Y或Y1/2越小，色譜峰越窄，理論塔板數(shù)越多組分在兩相間達到分配平衡的次數(shù)越多，分離能力越強，柱效就越高。色譜法中基本術(shù)語液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：色譜柱的柱效率和分離度分離度（R）：又稱分辨率是把柱效率和溶劑效率結(jié)合在一起的參數(shù)，是表示色譜柱在一定的色譜條件下對混合物綜合分離能力的指標分離度、柱效率、容量因子之間的關(guān)系：液相色譜法的分類及其分離原理液相色譜中常用的術(shù)語和參數(shù)：液-固色譜法液-液色譜法離子交換色譜凝膠色譜液相色譜法的分類及其分離原理液-固色譜法（液-固吸附色譜法）各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心，利用吸附劑對不同成分之間吸附能力的差異而實現(xiàn)分離，固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質(zhì)在固定相中的吸附作用的不同進行分配的。液-固吸附色譜法的作用機制吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，其表面存在著分散的吸附中心點。流動相中的溶質(zhì)分子（X）被流動相S帶入色譜柱后，在隨載液流動的過程中，發(fā)生如下的交換反應：

X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）

+nS（液相）其作用機制是溶質(zhì)分子

X（液相）和溶劑分子S（液相）對吸附劑表面的競爭吸附。液相色譜法的分類及其分離原理液-固色譜法（液-固吸附色譜法）吸附反應的平衡常數(shù)是K與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)。K值較?。喝軇┓肿拥奈搅軓姡晃降娜苜|(zhì)分子很少，先流出色譜柱。K值較大：表示該組分的分子的吸附能力較強，后流出色譜柱。發(fā)生在吸附劑表面的吸附-解吸附平衡，就是液-固色譜分離的基礎。液相色譜法的分類及其分離原理液-固色譜法（液-固吸附色譜法）a：吸附劑m：流動相Xm：流動相中的組分分子Xa：固定相中的組分分子Ym：流動相分子Ya：固定相中的溶劑分子吸附色譜圖示意液相色譜法的分類及其分離原理液-固色譜法（液-固吸附色譜法）液-固色譜法中的吸附劑和流動相常用的液-固色譜法中的吸附機：薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。注：對于固定相而言，非極性分子與極性吸附劑（氧化鋁、氧化銅）之間的作用力很弱，分配比K較小，保留時間較短，但是極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強，分配比K較大，保留時間較長。對吸附劑的要求：有較大的表面積和足夠的吸附能力；對不同化學成分有不同的吸附能力，可以較好的把混合物分開；與流動相、溶劑及樣品中的化合物不起反應；在所有的流動相和溶劑中不溶解；顆粒均勻，操作過程中不宜碎裂。液相色譜法的分類及其分離原理液-固色譜法（液-固吸附色譜法）流動相：溶劑純度要高；試樣要能溶于流動相中，且不同物質(zhì)的K值不同；流動相的黏度要小；流動相不能影響試樣的檢測。常用的流動相有：甲醇、乙醚、乙腈、乙酸乙酯、吡啶。流動相的洗脫能力主要由其極性決定，極性強的流動相分子占據(jù)極性中心的能力強，洗脫能力就強，流動相的選擇要依據(jù)樣品的極性、吸附劑的活性而定。液-固色譜法的應用常用于分離極性不同的化合物、含有不同類型或不同官能團的有機化合物或有機化合物不同的異構(gòu)體。但液-固色譜法不宜用于分離同系物因為液-固色譜法對不同相對分子量的同系物的選擇性不高。液相色譜法的分類及其分離原理液-液色譜法（液-液分配色譜法）將液體固定液均勻涂漬在惰性物質(zhì)表面（擔體）作為固定相。液-液分配色譜法的作用機制溶質(zhì)在兩相間進行分配時，主要是利用被分離物質(zhì)在固定相和流動相中的溶解度差造成的分配系數(shù)的差別而被分離，在固定液中溶解度較小的組分很難進入固定相，在色譜柱中遷移速度較快。在固定液中溶解度較大的組分容易進入固相，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達到分離的目的。液-液色譜法與液-液萃取法的分離原理相似，均服從分配定律

K=C固/C液注：K與組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫有關(guān)。K值大的組分，保留時間長，后流出色譜柱。液相色譜法的分類及其分離原理液-液色譜法（液-液分配色譜法）

液-液分配色譜示意圖液相色譜法的分類及其分離原理液-液色譜法（液-液分配色譜法）正向色譜和反相色譜正相分配色譜是用極性物質(zhì)做固定相，非極性溶劑（苯、正己烷）做流動相。反相分配色譜是用非極性物質(zhì)做固定相，極性溶劑（水、甲醇、乙腈）做流動相。注：正相色譜是固定相的極性大于流動相的極性，主要分離極性樣品，極性弱的組分先被洗脫，極性強的組分后被洗脫；而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極性，主要用于分離非極性和中等極性的化合物。液相色譜法的分類及其分離原理液-液色譜法（液-液分配色譜法）液－液分配色譜法的固定相常用的固定液為有機溶液，如極性的Ｂ、Ｂ氧二丙氰（ＯＤＰＮ），非極性的十八烷（ＯＤＳ）和異二十烷（ＳＱ）。注：涂漬的固定液容易被流動相沖走。采用化學鍵和固定相可以避免上述缺點，使固定液和擔體之間形成化學鍵，如在硅膠表面進行硅烷化反應。形成ＳＩ－Ｏ－ＳＩ－Ｃ型鍵，把固定液的分子結(jié)合到擔體表面圖示：液相色譜法的分類及其分離原理液-液色譜法（液-液分配色譜法）液－液分配色譜法的固定相圖示：注：化學鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質(zhì)速度快，無固定液的流失。固定液上可結(jié)合不同的官能團，改善分離效能，固定液不溶于流動相，有利于進行梯度洗脫。液相色譜法的分類及其分離原理液-液色譜法（液-液分配色譜法）液－液分配色譜法的應用液－液分配色譜法既能分離極性化合物又能分離非極性化合物，如烷烴、烯烴、芳環(huán)、稠環(huán)、染料、甾類化合物等，化合物中取代基中的種類和數(shù)目不同或化合物的相對分子量不同，均可用液－液分配色譜法進行分離。液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法原理：離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進行可逆交換，由于被測離子在交換劑上具有不同的親和力而被分離。離子交換色譜法的作用機制聚合物的骨架上連接著活性基團，如：－ＳＯ３－、－Ｎ（ＣＨ３）３＋等為了保證離子交換樹脂的電中性，活性基團上帶有電荷數(shù)相同但正、負相反的離子Ｘ，稱為反離子。液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法活性基團上的反離子可以與流動相中具有相同電荷的被測離子發(fā)生交換離子交換色譜的分配過程是交換與洗脫的過程，當交換達到平衡時：

K值越大，保留時間越長液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法m：流動相R：離子交換劑1：固定離子2：可交換離子陽離子交換樹脂示意圖液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法固定相和溶劑：固定相是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。固定相有兩種類型：多孔型樹脂與薄殼型樹脂多孔型樹脂：極小的球形離子交換樹脂，能分離復雜樣品，進樣量較大，缺點是機械強度不高，不能耐受高壓。薄殼型離子交換樹脂：在玻璃微球上涂以薄層的離子交換樹脂，這種樹脂柱效高，當流動相成分發(fā)生變化時，不會膨脹或壓縮，缺點是柱容量小，進樣量不宜太多。液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法影響保留行為的因素溶質(zhì)離子的價態(tài)和水合半徑，價態(tài)高，K值大；同價離子，水合離子半徑增大，K值小。常見陽離子在交換樹脂上的交換順序是：Fe3+＞AL3+＞Ba2+≥Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+≥Cu2+≥Co2+≥Mg2+≥Zn2+≥Mn2+＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+≥NH4+＞Na+＞H+＞Li+常見陰離子在交換樹脂上的交換順序是：檸檬酸根＞PO43-＞SO42-＞I-＞NO3-＞SCN-＞CL-＞HCO3-＞CH3COO-＞OH-＞F-液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法影響保留行為的因素離子交換劑的交聯(lián)度與交換容量：在一定的范圍內(nèi)，樹脂的交聯(lián)度越大，交換容量越大，則組分的保留時間越長。流動相的組成和pH值：交換能力強的離子組成的流動相具有較強的洗脫能力，強離子交換樹脂的交換容量不隨流動相的pH變化，調(diào)節(jié)pH值得作用主要是控制弱電解質(zhì)的解離。液相色譜法的分類及其分離原理離子交換色譜法離子交換色譜法的應用主要用來分離離子或可解離的化合物，凡是在流動相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換法進行分離。廣泛應用于：無機離子，有機化合物和生物離子（氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等）液相色譜法的分類及其分離原理凝膠色譜法（空間排阻色譜法）凝膠是一種多孔性的高分子聚合物，表面布滿孔隙，能被流動相浸潤，吸附性很小凝膠色譜法的分離機制是根據(jù)分子的體積大小和形狀不同而達到分離目的的。凝膠色譜法的作用機制：體積大于凝膠孔隙的分子，由于不能進入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱。小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來隨載液流動，后流出色譜柱。中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介于上述兩種情況之間。液相色譜法的分類及其分離原理凝膠色譜法（空間排阻色譜法）凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進行分離的一種色譜分析的方法液相色譜法的分類及其分離原理凝膠色譜法（空間排阻色譜法）凝膠色譜法的固定相和流動相：固定相是多孔凝膠，選擇時使試樣的分子量落入排斥極限和全滲透點之間。平均孔徑：凝膠孔徑的大小排斥極限：不能滲透進入任何凝膠孔徑的物質(zhì)的分子量。流動相：對流動相的溶解性好，且能潤濕凝膠；溶劑的黏度要低，否則會限制分子擴散影響分離效果；一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性的試樣選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機溶劑。液相色譜法的分類及其分離原理凝膠色譜法（空間排阻色譜法）凝膠色譜法的應用特點保留時間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分子量大的化合物，相對分子量在400-8*105的任何類型的化合物。保留時間段，色譜峰窄，容易檢測。固定相遇溶質(zhì)分子的作利用力極弱，趨于零，柱的壽命長。不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上才能得到分離。液相色譜法的分類及其分離原理高效液相色譜法的選擇運用范圍高效液相色譜法是常溫下進行分離與分析，不會導致被測物質(zhì)的分解，其流動相是液體，所以只要試樣能夠制備成溶液，原則上都可以用液相法進行分離和分析，如離子型化合物，不穩(wěn)定的天然化合物以及氨基酸、蛋白質(zhì)等到分子化合物均可以用高效液相法得到好的分離效果。液相色譜法的分類及其分離原理高效液相色譜法的選擇選擇的依據(jù)定性定量計算色譜定性、定量計算色譜定性的鑒定方法：利用純物質(zhì)定性的方法利用保留值定性，通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。注：不適用于不同儀器上色譜圖數(shù)據(jù)之間的比較。利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化，如果混合后峰高而半峰寬并不相應增加，則表示兩物質(zhì)很可能是同一物質(zhì)。利用雙柱法測定：不同物質(zhì)有可能在同一色譜柱上具有相同的保留，所以應該采用兩根或多根性質(zhì)不同的色譜柱進行分離，觀察未知物和標準試樣的保留值是否重合。定性定量計算色譜定性、定量計算色譜定性的鑒定方法：利用文獻的保留值定性采用相對保留值定性：相對保留值至于固定液和柱溫有關(guān)，所以只要保證這兩項與文獻一致即可，色譜手冊中均列有各物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來定性鑒定。根據(jù)保留指數(shù)定性是一種重現(xiàn)性好的定性方式，有稱kowats指數(shù)，只要保證所選固定相與柱溫與文獻一致。定性定量計算色譜定性、定量計算色譜量分析方法：在一定的操作條件下，分析組分i的質(zhì)量mi及其濃度與檢測器的相應信號（色譜圖上表現(xiàn)為峰面積Ai或峰高Hi）成正比。即mi=fi*Ai這就是色譜定量分析的依據(jù)由此可見在定量分析中需要：準確測量峰面積Ai或峰高Hi；準確求出比例常數(shù)fi（稱為定量校正因子）；正確選用定量計算方法，將測定組分的峰面積轉(zhuǎn)換成質(zhì)量。峰面積的測量：通過軟件，選擇合適的積分條件