實驗三 牛乳中酪蛋白的制備與鑒定

1實驗三牛乳中酪蛋白的制備與鑒定溫馨提示：請將教室水浴鍋打開，溫度調(diào)至40℃。并將乙酸-乙酸鈉緩沖液（1瓶/室）放入水浴鍋內(nèi)，預熱至40℃。2（1）學習從牛乳中制備酪蛋白的方法。（2）了解從牛奶中制取酪蛋白的原理。（3）驗證蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)性質(zhì)。（4）學習和掌握蛋白質(zhì)雙縮脲反應(yīng)的原理和方法。一、實驗?zāi)康亩?、實驗原理牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點為4.8。利用等電點時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.8時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，乙醚除去脂類雜質(zhì)后便可得到純的酪蛋白。二、實驗原理兩分子尿素加熱到180℃左右時，生成雙縮脲并放出一分子氮，雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。

二、實驗原理蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)，因此該反應(yīng)可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。N端C端6三、儀器和試劑1、儀器：恒溫水浴鍋、低速離心機、電子天平、酒精燈等。2、試劑：

乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH4.6）、1%氫氧化鈉、10%乙酸、蒸餾水、無水乙醇、10%氯化鈉、0.5%碳酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、0.2%鹽酸、飽和氫氧化鈣、尿素、10%氫氧化鈉、1%硫酸銅。7四、實驗步驟1、酪蛋白的制備：（1）量取10mL牛奶置于25mL刻度試管中，水浴中加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入10mL預熱至40℃的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH4.6）。用精密試紙調(diào)pH值至4.8（可選擇1%氫氧化鈉或10%乙酸溶液進行調(diào)整）。40℃保溫10min，使沉淀完全。（2）將上述懸浮液冷卻至室溫。2000r/min離心5min，棄去上清液。8四、實驗步驟1、酪蛋白的制備：（3）往沉淀物中加入5mL蒸餾水，混勻后2000r/min離心5min，棄去上清液。（4）將洗凈的沉淀物加入3mL無水乙醇，混勻后2000r/min離心5min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品。（5）將沉淀物全部攤開在已稱過重的濾紙上，置于25℃烘箱中烘干。

（6）準確稱重，計算牛乳中酪蛋白含量（g/100mL）,并與理論含量為3.5g/100mL牛乳相比較，求出實際得率。9四、實驗步驟2、酪蛋白的溶解度鑒定：

取6支試管，分別加入蒸餾水、10%氯化鈉、0.5%碳酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣各1mL。于每管中加入少量酪蛋白，不斷搖蕩，觀察并記錄各管中酪蛋白的溶解度。10四、實驗步驟3、酪蛋白的顏色反應(yīng)（雙縮脲反應(yīng)）：取少量尿素結(jié)晶，放入干燥的試管，微火加熱使尿素熔化，熔化的尿素開始硬化時停止加熱，尿素放出氮，形成雙縮脲。冷卻后，加入1mL10％NaOH溶液，振蕩混勻，再加入數(shù)滴1％CuSO4溶液，振蕩，觀察實驗現(xiàn)象。（此步驟由教師演示。）

向另一支試管中加入少量酪蛋白溶液，加入2mL10％NaOH溶液，搖勻，再加入數(shù)滴1％CuSO4溶液，隨加隨搖，觀察實驗現(xiàn)象。111、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL×100%2、酪蛋白得率=測定含量/理論含量×100%3、酪蛋白溶于哪些溶液？4、酪蛋白的雙縮脲反應(yīng)分析。五、實驗結(jié)果、計算與分析

12酪蛋白+蒸餾水+數(shù)滴1%硫酸銅酪蛋白+10%氯化鈉+數(shù)滴1%硫酸銅酪蛋白+0.5%碳酸鈉+數(shù)滴1%硫酸銅酪蛋白+0.1mol/L氫氧化鈉+數(shù)滴1%硫酸銅酪蛋白+0.2%鹽酸+數(shù)滴1%硫酸銅酪蛋白+飽和氫氧化鈣+數(shù)滴1%硫酸銅酪蛋白+10%氫氧