酶的定向分子進(jìn)化

酶的定向分子進(jìn)化酶的定向分子進(jìn)化簡介定向進(jìn)化常用方法易錯(cuò)PCR例子酶的定向分子進(jìn)化簡介酶分子的定向進(jìn)化是指不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對酶基因進(jìn)行改造，并定向篩選、獲得具有某些預(yù)期特征的進(jìn)化酶。主要包括：隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫、定向選擇。單一/一組基因多樣性文庫多樣性文庫篩選功能基因非功能基因目的基因反復(fù)進(jìn)行該進(jìn)化策略有以下三個(gè)顯著特征：A.進(jìn)化的每一關(guān)鍵步驟都受到嚴(yán)密控制B.可引入一個(gè)全新的功能，來執(zhí)行從不被生物體所要求的反應(yīng)，甚至為生物體策劃一個(gè)新的代謝途徑C.能從進(jìn)化結(jié)果中探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能不需要了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制設(shè)計(jì)難度小優(yōu)點(diǎn)變異量大周期短1.易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR是指通過改變PCR的反應(yīng)條件，如：調(diào)整反應(yīng)體系中4種dNTP的濃度、增加Mg+的濃度、加入Mn2+或使用低保真度的Taq酶等，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)配而引入多點(diǎn)突變，構(gòu)建突變庫，篩選出所需的突變體。該方法關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率，一般為每個(gè)基因2-5個(gè)堿基替換。另外，迭代錯(cuò)誤傾向PCR可使小的有益突變累積而產(chǎn)生大的提高。盡管這種方法已有不少成功的例子。但畢竟遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，屬于無性PCR進(jìn)化范疇。2.DNAshufflingDNAshuffling由美國Stemmer于1994年首次提出，該法是對一組基因群體（進(jìn)化上相關(guān)的DNA序列或曾篩選出的性能改進(jìn)序列）進(jìn)行重組創(chuàng)造新基因的方法。當(dāng)DNAshuffling用來重組一套進(jìn)化上相關(guān)的基因時(shí)，又被稱為familyshuffling，例如：shuffling4種頭孢菌素酶基因，酶活增加了270-540倍，而單基因shuffling只增加了8倍。3.StEP重組交錯(cuò)延伸重組（StEP）重組是一種簡化的DNAshuffling技術(shù)。其原理是在PCR樣反應(yīng)中，將含不同點(diǎn)突變的模板混合；隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性／延伸反應(yīng)，在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整反應(yīng)時(shí)間和溫度來控制。第一次退火、延伸第二次退火、延伸4.隨機(jī)引物體外重組法隨機(jī)引物體外重組法(RPR)是用一套隨機(jī)序列引物，產(chǎn)生互補(bǔ)于模板不同位置的短DNA片段庫由于堿基錯(cuò)配，這些短DNA片段也含有少量的點(diǎn)突變），然后進(jìn)行類似于DNAshuffling的全長基因裝配反應(yīng)，獲得多樣性文庫。與DNAshuffling相比，RPR具有以下優(yōu)點(diǎn)：a.可用單鏈DNA或mRNA為模板，且對模板量要求少。b.克服了DNAshuffling中DNase所具有的序列偏愛性，保證了子代全長基因中突變和交叉的隨機(jī)性。c.片段組裝體系與片段合成體系緩沖系統(tǒng)可兼容，組裝前無需純化操作。d.隨機(jī)引發(fā)DNA合成不受模板DNA長度的限制，便利了小肽的改造。5.過渡模板隨機(jī)嵌合生長過度模板隨機(jī)嵌合生長技術(shù)是與DNAshuffing概念上明顯不同，改進(jìn)的基因家族重組技術(shù)。它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯(cuò)延伸反應(yīng)，而是將隨機(jī)切割片段的基因段雜交到一個(gè)臨時(shí)DNA模版上進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接。6.漸增切割法產(chǎn)生雜化酶為了解決DNAshuffling對同源序列的依賴性，benkovic研究組建立了漸增切割法產(chǎn)生雜化酶及α-硫代磷酸核苷酸介導(dǎo)的ITCHY法。其原理：控制核酸外切酶Ⅲ的切割速度不大于10堿基/min，然后間隔很短的時(shí)間連續(xù)取樣終止反應(yīng)，最后將A組切割產(chǎn)物3’端和B組切割產(chǎn)物5’端融合產(chǎn)生雜合基因產(chǎn)物。α-硫代磷酸核苷酸介導(dǎo)法（ITCHY）：首先將待重組的兩基因串聯(lián)在同一載體上，然后通過PCR反應(yīng)或單鏈模板引伸反應(yīng)將α-硫代磷酸核苷酸隨機(jī)引入產(chǎn)物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下來的切割反應(yīng)會(huì)在此處隨機(jī)終止，連接切割產(chǎn)物即產(chǎn)生隨機(jī)交叉文庫3.易錯(cuò)PCR技術(shù)的應(yīng)用以“易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化擴(kuò)展青霉FS1884堿性脂肪酶（PEL）”為例子說明易錯(cuò)PCR在酶定向分子進(jìn)化中的應(yīng)用。質(zhì)粒的提取：活化含有質(zhì)粒pPIC3.5K的大腸桿菌E.coliJM109，接種至含有100μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，振蕩12-16h。培養(yǎng)好的菌液于室溫，8000rpm，離心10min收集細(xì)胞沉淀，提取質(zhì)粒。易錯(cuò)PCR獲取突變脂肪酶基因：以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pPIC3.5K-PEL重組質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物連續(xù)兩輪隨機(jī)突變脂肪酶基因PEL。第一輪易錯(cuò)PCR擴(kuò)增(100mL體系)見右圖。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1rain，共32個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸7min。電泳鑒定回收。稀釋第一次易錯(cuò)PCR回收的突變脂肪酶基因，并以其為模板，控制濃度在1μg/μL-10μg/μL范圍內(nèi)，以P1，P2為引物，進(jìn)行第二輪易錯(cuò)PCR。第二輪易錯(cuò)PCR的反應(yīng)體系參照第一輪，但反應(yīng)條件稍作變化：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸7min。1％瓊脂糖電泳確認(rèn)PCR結(jié)果后，再次使用回收膠，進(jìn)行突變脂肪酶基因的回收。3突變脂肪酶重組表達(dá)載體構(gòu)建：使用EcoRI、BamHI分別對突變脂肪酶基因、PIC3.5K質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。按照1：10的比例，將回收的突變脂肪酶基因片段和pPIC3.5K線性質(zhì)粒用T4DNALigase連接，構(gòu)建突變脂肪酶基因的重組表達(dá)載體。獲得脂肪酶基因隨機(jī)突變庫:將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌E.coliDH5α，確定轉(zhuǎn)化后平板長出單菌落，用含100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基將大腸桿菌菌落刮下，獲得脂肪酶基因突變庫，加入等體積的30％甘油混合，80℃保存。突變脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)：大量抽提突變脂肪酶重組表達(dá)載體pPIC3.5K-EP-PEL，并用SalⅠ酶，37℃酶切過夜。乙醇沉淀法回收線性化載體。采用電擊法將線性化載體轉(zhuǎn)化到新鮮制備的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。突變脂肪酶的初篩：電擊轉(zhuǎn)化后，將YMD板上長出的畢赤酵母單克隆，全部點(diǎn)印至YPOM固體平板上，并標(biāo)上序號(hào)。恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)，觀察每個(gè)茵落產(chǎn)水解圈情況。每個(gè)YPOM固體平板點(diǎn)印一個(gè)產(chǎn)野生型脂肪酶的菌落做對照。比較每個(gè)菌落水解圈大小。挑取并標(biāo)記產(chǎn)水解圈，且水解圈大于對照菌落的突變菌株，YPD液體培養(yǎng)基活化，并甘油保菌，用于下一步復(fù)篩。突變脂肪酶的復(fù)篩：YPD液體培養(yǎng)基活化后的酵母菌轉(zhuǎn)接至MGY液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增。當(dāng)菌液OD600達(dá)到2-6時(shí)，即可將菌體轉(zhuǎn)接MMY培養(yǎng)基。收集一定體積的MGY培養(yǎng)物，4℃，4000rpm，離心5min，去除MGY培養(yǎng)基，將菌體轉(zhuǎn)移到MMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶。稱取2.0g瓊脂，加入100mL0.05mol／LpH9.4緩沖液，微波爐溶解后，加入2mL橄欖油乳化液，