第11章 DNA文庫的構(gòu)建和目標基因的篩選

上章要點回顧1、Maxam-Gilbert化學降解法2、Sanger雙脫氧鏈終止法第十一章

DNA文庫的構(gòu)建和目標基因的篩選基因文庫(genelibrary)：指某一生物分離的全部基因的集合。基因組DNA文庫：

指將是指某個生物的基因組DNA與適當?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。cDNA文庫：指某生物某一發(fā)育時期、某一組織或某種環(huán)境條件下所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與載體連接轉(zhuǎn)化受體細胞而形成的克隆的集合。噬菌斑菌落主要內(nèi)容第一節(jié)基因組DNA文庫的構(gòu)建第二節(jié)cDNA基因文庫的構(gòu)建第三節(jié)基因克隆的篩選策略第四節(jié)DNA文庫的保存

8第一節(jié)基因組DNA文庫的構(gòu)建一、基因組DNA文庫的類型1、質(zhì)粒文庫：容納片段小于10kb，以菌落的形式保存和篩選，一般用于對大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測序等。2、噬菌體文庫：一般用λ噬菌體載體，插入型容納片段小于7kb，適合于構(gòu)建cDNA文庫，置換型容納9-25kb，適合于構(gòu)建亞克隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。95、亞基因組文庫：文庫的對象只是基因組的一部分，可用染色體顯微切割、特定YAC富集等方法而產(chǎn)生，用于針對特定目標基因?qū)Υ笃挝膸斓纳钊胙芯俊?、人工染色體文庫：BAC、YAC、PAC等文庫，最大插入片段分別為300kb、1000kb和150kb，是大片段文庫，主要用于基因組測序和圖譜構(gòu)建。6、基因組文庫的發(fā)展：略3、粘粒文庫：一般用于直接構(gòu)建基因組文庫，最長插入片段比λ噬菌體文庫略長，達45kb左右。10二、文庫的代表性和隨機性為保證能從基因組文庫中篩選到某個特定的基因，基因組文庫必須有一定的代表性和隨機機。11代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。

代表性意味著文庫要有完備性，是指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率。它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：

N=ln(1–P)/ln(1–f)。P

：任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲

：克隆片段的平均大小/生物基因組的大小。例：假如重組片段大小為20kb，要使文庫包含該基因組任一片段的概率達到99%，則N(E.coli)=ln(1-0.99)/ln(1-20/4600)=1057N(人)=ln(1-0.99)/ln(1-20/(3×109))=6.9×105隨機性：

既表示構(gòu)建文庫時要從基因組DNA獲得隨機斷裂的片段，也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率。基因文庫的質(zhì)量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：

1、重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；

2、載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克??；

3、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序和染色全步查；

4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下進行亞克?。?/p>

5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增和篩選，文庫繁殖后失真度小。

1．基因組DNA文庫的載體制備載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點，一是純度高；二是去磷酸化好。三、基因組DNA文庫的構(gòu)建流程

2．高質(zhì)量大相對分子量基因組DNA的提取和部分酶切構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA相對分子質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的3～5倍。

3．外源DNA的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染

一般在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫時，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細胞和最佳的轉(zhuǎn)化條件或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白。5、文庫的質(zhì)量檢測克隆子數(shù)目要足夠多，覆蓋度要足夠高(4-6倍或更高)。覆蓋倍數(shù)=平均插入片段長度×

克隆數(shù)/基因組DNA的長度。

或：覆蓋倍數(shù)=所有探針篩選到的陽性克隆子數(shù)/總探針數(shù)。

另外，植物基因組文庫中葉綠體DNA的比例：小于5%。第二節(jié)cDNA基因文庫的構(gòu)建一、cDNA文庫的特征1、基因特異性：1）cDNA只含有對應(yīng)于成熟mRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。2）cDNA一般較短，平均長度1.5kb左右，多數(shù)為100bp至10kb。2、器官特異性3、代謝或發(fā)育特異性4、表達量不均勻性二、cDNA文庫的構(gòu)建步驟：

1、細胞總RNA的提取和mRNA分離；2、第一鏈cDNA合成；3、第二鏈cDNA合成；3、雙鏈cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖。cDNA文庫構(gòu)建流程圖1、RNA的分離

mRNA是構(gòu)建cDNA文庫的起始材料。由于mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫的一個重要步驟。通過降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴純化或直接提取mRNA。2、第一鏈cDNA的合成由mRNA到cDNA的過程稱為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。反轉(zhuǎn)錄酶：

AMV和Mo-MLV。合成DNA是需要引物引導：

oligo(dT)引物；隨機引物。2、第一鏈cDNA的合成

由mRNA到cDNA的過程稱為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。反轉(zhuǎn)錄酶：

AMV和Mo-MLV。合成DNA是需要引物引導：

oligo(dT)引物；隨機引物。3、第二鏈cDNA的合成

cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜交雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。自身引導合成法：置換合成法：引導合成法：引物-銜接頭合成法：

第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA

的3’-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補的cDNA

鏈。244、雙鏈cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖由于平端連接效率低，雙鏈cDNA

在和載體連接之前，要經(jīng)過一系列處理，如同聚物加尾、加接頭和分級分離?？俢DNA的分級分離：采用排阻層析柱，去除過大和過小的cDNA分子，保留500bp至8kb的總cDNA，以提高連接后文庫的質(zhì)量。25三、cDNA文庫的均一化處理1、基因組DNA飽和雜交法mRNA水平上，基因之間豐度差異極大?；蚪M水平，基因之間拷貝數(shù)差異不大。將隨機打斷的基因組總DNA片段標記為探針，與總cDNA單鏈飽和雜交，棄除未雜交的總cDNA，從cDNA-DNA雜交體上變性釋放除均一化后的總cDNA，轉(zhuǎn)化宿主。2、基于復(fù)性動力學(second-orderkinetics)原理的均一化處理濃度大的DNA復(fù)性所需時間短，濃度越小復(fù)性越遲?？刂茝?fù)性時間，使高豐度cDNA呈雙鏈狀態(tài)，低豐度cDNA呈單鏈狀態(tài)，利用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈cDNA分開，保留單鏈cDNA后轉(zhuǎn)化宿主。26四、扣除雜交cDNA文庫利用分子雜交原理，去除非差異表達基因的cDNA，保留差異表達的基因的cDNA用于制備文庫。tester:待測樣本的總cDNA。driver:表達譜背景一致但不含目的基因的總cDNA。tester與過量的driver雜交，去除二者共同表達的cDNA，保留差異表達基因。SSH原理2、mRNA-cDNA雜交：過量的驅(qū)動總mRNA（末端生物素標記）與總cDNA雜交，利用生物素磁珠法將公共表達基因去除。29五、全長cDNA文庫

cDNA不完整的原因：mRNA的降解、第二鏈合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶與mRNA模板的脫離(主要受mRNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)影響)。1、SMART全長cDNA文庫的構(gòu)建方法為Clontech公司的專利試劑盒原理，應(yīng)用廣泛，其獨特的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，RTase自動在反轉(zhuǎn)錄得到的全長cDNA第一鏈的3’末端加上oligo(dC)，利用具oligo(dG)的接頭引導第二鏈的合成。由于oligo(dC)比較短，因此較短的oligo(dG)容易介導合成假全長cDNA。SMART技術(shù)構(gòu)建全長cDNA文庫的原理312、Cap-Trapper法構(gòu)建全長cDNA文庫在mRNA的兩端均打上生物素標記，合成cDNA第一鏈時用dm5CTP代替dCTP，用RNaseⅠ消化單鏈RNA。3、TAP法構(gòu)建全長cDNA文庫

Invitrogen公司的試劑盒原理，首先利用堿性磷酸酶處理使非全長mRNA無效化。用煙草酸焦磷酸酶處理以移去全長mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，然后為脫帽后的全長mRNA的5’末端接上人工接頭，利用具oligo(dT)的人工接頭進行反轉(zhuǎn)錄，得到的全長cDNA第一鏈的兩端就打上了特別設(shè)計的人工接頭，可用PCR法對全長總cDNA進行放大，酶切后與載體連接。33六、其它cDNA文庫表達cDNA文庫：

用表達載體構(gòu)建全長cDNA文庫，文庫的每一個克隆子可以表達出蛋白，利用蛋白對克隆子進行篩選。雙雜交全長cDNA文庫：

將表達文庫與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，利用酵母作宿主，通過融合蛋白的酵母雙雜交對克隆子進行篩選，用于鑒定可與特定蛋白相互作用的基因，主要為轉(zhuǎn)錄因子。重組酶克隆策略的cDNA文庫：

將重組酶的特異識別序列attP1和attP2構(gòu)建到每個cDNA的兩端，在非消化情況下實現(xiàn)與載體的重組連接，避免了基因被切斷。34第三節(jié)基因克隆的篩選策略

大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成，從其中篩選分離出某一個特定基因并不是件簡單的事。一、表型篩選法一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以賦予宿主特定的表型，可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法等）直接篩選，宿主多為突變體。35二、雜交篩選和PCR篩選

1、雜交篩選362、PCR篩選法：將文庫貯存于多個96或384孔板中，首先通過PCR確定目標基因所在的特定PCR板(主混合池篩選)，然后通過PCR確定目標基因在特定PCR板上的特定行和列(行混合池篩選和列混合池篩選)，最后通過逐個克隆的PCR確定目標基因所對應(yīng)的克隆子。37三、免疫篩選首先制備和純化得到目標基因的抗體，然后利用抗體來篩選目標基因所在的表達文庫，得到目標基因所對應(yīng)的克隆子。方法有原位檢測和免疫沉淀檢測。1、原位檢測法濾膜（固定抗體）+2、免疫沉淀檢測法菌落沉淀