第11章 DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目標(biāo)基因的篩選

上章要點(diǎn)回顧1、Maxam-Gilbert化學(xué)降解法2、Sanger雙脫氧鏈終止法第十一章

DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目標(biāo)基因的篩選基因文庫(kù)(genelibrary)：指某一生物分離的全部基因的集合?；蚪MDNA文庫(kù)：

指將是指某個(gè)生物的基因組DNA與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過(guò)篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫(kù)。cDNA文庫(kù)：指某生物某一發(fā)育時(shí)期、某一組織或某種環(huán)境條件下所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與載體連接轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而形成的克隆的集合。噬菌斑菌落主要內(nèi)容第一節(jié)基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建第二節(jié)cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建第三節(jié)基因克隆的篩選策略第四節(jié)DNA文庫(kù)的保存

8第一節(jié)基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建一、基因組DNA文庫(kù)的類型1、質(zhì)粒文庫(kù)：容納片段小于10kb，以菌落的形式保存和篩選，一般用于對(duì)大片段文庫(kù)的亞克隆，用于鳥(niǎo)槍法測(cè)序等。2、噬菌體文庫(kù)：一般用λ噬菌體載體，插入型容納片段小于7kb，適合于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，置換型容納9-25kb，適合于構(gòu)建亞克隆文庫(kù)或直接構(gòu)建基因組文庫(kù)。95、亞基因組文庫(kù)：文庫(kù)的對(duì)象只是基因組的一部分，可用染色體顯微切割、特定YAC富集等方法而產(chǎn)生，用于針對(duì)特定目標(biāo)基因?qū)Υ笃挝膸?kù)的深入研究。4、人工染色體文庫(kù)：BAC、YAC、PAC等文庫(kù)，最大插入片段分別為300kb、1000kb和150kb，是大片段文庫(kù)，主要用于基因組測(cè)序和圖譜構(gòu)建。6、基因組文庫(kù)的發(fā)展：略3、粘粒文庫(kù)：一般用于直接構(gòu)建基因組文庫(kù)，最長(zhǎng)插入片段比λ噬菌體文庫(kù)略長(zhǎng)，達(dá)45kb左右。10二、文庫(kù)的代表性和隨機(jī)性為保證能從基因組文庫(kù)中篩選到某個(gè)特定的基因，基因組文庫(kù)必須有一定的代表性和隨機(jī)機(jī)。11代表性：指文庫(kù)中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來(lái)可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫(kù)中分離任何一段DNA。

代表性意味著文庫(kù)要有完備性，是指在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率。它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：

N=ln(1–P)/ln(1–f)。P

：任一基因被克隆（或存在于基因文庫(kù)中）的概率f

：克隆片段的平均大小/生物基因組的大小。例：假如重組片段大小為20kb，要使文庫(kù)包含該基因組任一片段的概率達(dá)到99%，則N(E.coli)=ln(1-0.99)/ln(1-20/4600)=1057N(人)=ln(1-0.99)/ln(1-20/(3×109))=6.9×105隨機(jī)性：

既表示構(gòu)建文庫(kù)時(shí)要從基因組DNA獲得隨機(jī)斷裂的片段，也表示構(gòu)建好的文庫(kù)中所有基因要有相等的篩選概率?；蛭膸?kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備下列條件：

1、重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大，以減輕篩選工作的壓力；

2、載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克??；

3、克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序和染色全步查；

4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下進(jìn)行亞克隆；

5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增和篩選，文庫(kù)繁殖后失真度小。

1．基因組DNA文庫(kù)的載體制備載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點(diǎn)，一是純度高；二是去磷酸化好。三、基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建流程

2．高質(zhì)量大相對(duì)分子量基因組DNA的提取和部分酶切構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫(kù)對(duì)DNA相對(duì)分子質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫(kù)最終平均插入片段長(zhǎng)度的3～5倍。

3．外源DNA的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染

一般在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫(kù)時(shí)，大量連接前都要先使用小體系連接來(lái)尋找最適的比例。在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過(guò)程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞和最佳的轉(zhuǎn)化條件或效價(jià)高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白。5、文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)克隆子數(shù)目要足夠多，覆蓋度要足夠高(4-6倍或更高)。覆蓋倍數(shù)=平均插入片段長(zhǎng)度×

克隆數(shù)/基因組DNA的長(zhǎng)度。

或：覆蓋倍數(shù)=所有探針篩選到的陽(yáng)性克隆子數(shù)/總探針數(shù)。

另外，植物基因組文庫(kù)中葉綠體DNA的比例：小于5%。第二節(jié)cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建一、cDNA文庫(kù)的特征1、基因特異性：1）cDNA只含有對(duì)應(yīng)于成熟mRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。2）cDNA一般較短，平均長(zhǎng)度1.5kb左右，多數(shù)為100bp至10kb。2、器官特異性3、代謝或發(fā)育特異性4、表達(dá)量不均勻性二、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建步驟：

1、細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；2、第一鏈cDNA合成；3、第二鏈cDNA合成；3、雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。cDNA文庫(kù)構(gòu)建流程圖1、RNA的分離

mRNA是構(gòu)建cDNA文庫(kù)的起始材料。由于mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一個(gè)重要步驟。通過(guò)降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴純化或直接提取mRNA。2、第一鏈cDNA的合成由mRNA到cDNA的過(guò)程稱為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。反轉(zhuǎn)錄酶：

AMV和Mo-MLV。合成DNA是需要引物引導(dǎo)：

oligo(dT)引物；隨機(jī)引物。2、第一鏈cDNA的合成

由mRNA到cDNA的過(guò)程稱為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。反轉(zhuǎn)錄酶：

AMV和Mo-MLV。合成DNA是需要引物引導(dǎo)：

oligo(dT)引物；隨機(jī)引物。3、第二鏈cDNA的合成

cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜交雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈cDNA的過(guò)程。自身引導(dǎo)合成法：置換合成法：引導(dǎo)合成法：引物-銜接頭合成法：

第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA

的3’-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的cDNA

鏈。244、雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖由于平端連接效率低，雙鏈cDNA

在和載體連接之前，要經(jīng)過(guò)一系列處理，如同聚物加尾、加接頭和分級(jí)分離?？俢DNA的分級(jí)分離：采用排阻層析柱，去除過(guò)大和過(guò)小的cDNA分子，保留500bp至8kb的總cDNA，以提高連接后文庫(kù)的質(zhì)量。25三、cDNA文庫(kù)的均一化處理1、基因組DNA飽和雜交法mRNA水平上，基因之間豐度差異極大?；蚪M水平，基因之間拷貝數(shù)差異不大。將隨機(jī)打斷的基因組總DNA片段標(biāo)記為探針，與總cDNA單鏈飽和雜交，棄除未雜交的總cDNA，從cDNA-DNA雜交體上變性釋放除均一化后的總cDNA，轉(zhuǎn)化宿主。2、基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)(second-orderkinetics)原理的均一化處理濃度大的DNA復(fù)性所需時(shí)間短，濃度越小復(fù)性越遲?？刂茝?fù)性時(shí)間，使高豐度cDNA呈雙鏈狀態(tài)，低豐度cDNA呈單鏈狀態(tài)，利用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈cDNA分開(kāi)，保留單鏈cDNA后轉(zhuǎn)化宿主。26四、扣除雜交cDNA文庫(kù)利用分子雜交原理，去除非差異表達(dá)基因的cDNA，保留差異表達(dá)的基因的cDNA用于制備文庫(kù)。tester:待測(cè)樣本的總cDNA。driver:表達(dá)譜背景一致但不含目的基因的總cDNA。tester與過(guò)量的driver雜交，去除二者共同表達(dá)的cDNA，保留差異表達(dá)基因。SSH原理2、mRNA-cDNA雜交：過(guò)量的驅(qū)動(dòng)總mRNA（末端生物素標(biāo)記）與總cDNA雜交，利用生物素磁珠法將公共表達(dá)基因去除。29五、全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)

cDNA不完整的原因：mRNA的降解、第二鏈合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶與mRNA模板的脫離(主要受mRNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)影響)。1、SMART全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法為Clontech公司的專利試劑盒原理，應(yīng)用廣泛，其獨(dú)特的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，RTase自動(dòng)在反轉(zhuǎn)錄得到的全長(zhǎng)cDNA第一鏈的3’末端加上oligo(dC)，利用具oligo(dG)的接頭引導(dǎo)第二鏈的合成。由于oligo(dC)比較短，因此較短的oligo(dG)容易介導(dǎo)合成假全長(zhǎng)cDNA。SMART技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的原理312、Cap-Trapper法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)在mRNA的兩端均打上生物素標(biāo)記，合成cDNA第一鏈時(shí)用dm5CTP代替dCTP，用RNaseⅠ消化單鏈RNA。3、TAP法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)

Invitrogen公司的試劑盒原理，首先利用堿性磷酸酶處理使非全長(zhǎng)mRNA無(wú)效化。用煙草酸焦磷酸酶處理以移去全長(zhǎng)mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，然后為脫帽后的全長(zhǎng)mRNA的5’末端接上人工接頭，利用具oligo(dT)的人工接頭進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的全長(zhǎng)cDNA第一鏈的兩端就打上了特別設(shè)計(jì)的人工接頭，可用PCR法對(duì)全長(zhǎng)總cDNA進(jìn)行放大，酶切后與載體連接。33六、其它c(diǎn)DNA文庫(kù)表達(dá)cDNA文庫(kù)：

用表達(dá)載體構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，文庫(kù)的每一個(gè)克隆子可以表達(dá)出蛋白，利用蛋白對(duì)克隆子進(jìn)行篩選。雙雜交全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)：

將表達(dá)文庫(kù)與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，利用酵母作宿主，通過(guò)融合蛋白的酵母雙雜交對(duì)克隆子進(jìn)行篩選，用于鑒定可與特定蛋白相互作用的基因，主要為轉(zhuǎn)錄因子。重組酶克隆策略的cDNA文庫(kù)：

將重組酶的特異識(shí)別序列attP1和attP2構(gòu)建到每個(gè)cDNA的兩端，在非消化情況下實(shí)現(xiàn)與載體的重組連接，避免了基因被切斷。34第三節(jié)基因克隆的篩選策略

大型基因組文庫(kù)一般由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成，從其中篩選分離出某一個(gè)特定基因并不是件簡(jiǎn)單的事。一、表型篩選法一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以賦予宿主特定的表型，可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法等）直接篩選，宿主多為突變體。35二、雜交篩選和PCR篩選

1、雜交篩選362、PCR篩選法：將文庫(kù)貯存于多個(gè)96或384孔板中，首先通過(guò)PCR確定目標(biāo)基因所在的特定PCR板(主混合池篩選)，然后通過(guò)PCR確定目標(biāo)基因在特定PCR板上的特定行和列(行混合池篩選和列混合池篩選)，最后通過(guò)逐個(gè)克隆的PCR確定目標(biāo)基因所對(duì)應(yīng)的克隆子。37三、免疫篩選首先制備和純化得到目標(biāo)基因的抗體，然后利用抗體來(lái)篩選目標(biāo)基因所在的表達(dá)文庫(kù)，得到目標(biāo)基因所對(duì)應(yīng)的克隆子。方法有原位檢測(cè)和免疫沉淀檢測(cè)。1、原位檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+2、免疫沉淀檢測(cè)法菌落沉淀