第13章2-細(xì)胞增殖及其調(diào)控

CELLCYCLE第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控

細(xì)胞周期周而復(fù)始地進(jìn)行著，這種周期性的重復(fù)過(guò)程受到嚴(yán)格地控制，使得不同的細(xì)胞周期事件在空間和時(shí)間上相互協(xié)調(diào)。（一）研究背景1.MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用

1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母細(xì)胞，提出了成熟卵母細(xì)胞中存在一種促成熟因子（maturationpromotingfactor，MPF）。Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela細(xì)胞為材料，發(fā)現(xiàn)M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即促細(xì)胞分裂因子(mitosis-promotingfactor，MPF)。3M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開(kāi)始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說(shuō)明DNA復(fù)制已完成。甚至不同類的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說(shuō)明M期細(xì)胞具有促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子(maturationpromotingfactor，MPF)。染色體超前凝集（PCC）細(xì)胞融合與PCC(Prematurechromosomalcondense)2.cdc基因

LelandHartwell、PaulNurse分別以不同的酵母為實(shí)驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)了許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。

如何發(fā)現(xiàn)的？進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：P34cdc2與P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有當(dāng)其與有關(guān)蛋白結(jié)合后，其激酶活性才能夠表現(xiàn)出來(lái)。例如：P34cdc2必須與另一種蛋白P56cdc13結(jié)合后才具有激酶活性。

6

3.cyclin

1983年TimothyHunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過(guò)程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開(kāi)始合成，G2/M時(shí)達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，在下一個(gè)周期中又重復(fù)這一消長(zhǎng)現(xiàn)象，故命名為周期素或周期蛋白(cyclin)。隨后cyclin很快被分離和克隆出來(lái)，證明其廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中，而且在功能上存在互補(bǔ)性。74.MPF－P34cdc2－Cyclin？？

1988年M.J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由34KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。

1990PaulNurse進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明P34實(shí)際上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，對(duì)于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。從而將細(xì)胞周期三個(gè)領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。8MPF=P34cdc2(CDK1)+CyclinB（催化亞單位）（調(diào)節(jié)亞單位）MPF的生化成分：含有兩個(gè)亞單位MPF

=Cdc2+cyclin（催化亞單位+調(diào)節(jié)亞單位）11TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2001"fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecell

cycle"LelandHartwell

TimothyHunt

PaulNurse

12（二）細(xì)胞周期的檢驗(yàn)點(diǎn)1989年，Hartwell通過(guò)構(gòu)建酵母細(xì)胞突變模型證實(shí)了細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）的存在，并首次提出檢驗(yàn)點(diǎn)的概念。細(xì)胞周期的運(yùn)行，是在一系列檢驗(yàn)點(diǎn)的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的，它保證前一個(gè)事件完成之后，才啟動(dòng)下一個(gè)事件，檢查點(diǎn)是細(xì)胞的錯(cuò)誤監(jiān)測(cè)機(jī)制。13主要檢驗(yàn)點(diǎn)包括：G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱R點(diǎn)(restrictionpoint)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？

S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？14G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括：所有DNA都正確復(fù)制了嗎？DNA是否有損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：所有染色體都排列在紡錘體上了嗎？任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接到紡錘體上，都會(huì)抑制APC活性，引起細(xì)胞周期中斷。1517（三）細(xì)胞周期蛋白cyclin的種類繁多，目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動(dòng)物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動(dòng)物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分別參與細(xì)胞周期中不同時(shí)相的調(diào)節(jié)。分為G1型、G1/S型S型和M型4類。18人類細(xì)胞周期蛋白線性結(jié)構(gòu)示意圖實(shí)心方框代表“cyclinbox”，方框代表“destructionbox”圓形框代表PEST序列19

cyclinbox：各類周期蛋白均含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白盒(cyclinbox)，介導(dǎo)周期蛋白與CDK(cyclin–dependentkinase)結(jié)合。Cyclin也含有降解盒（destructionbox）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－絲氨酸－蘇氨酸）序列，它可以通過(guò)定時(shí)降解或恒定地迅速周轉(zhuǎn)來(lái)調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的水平，起著CDK的調(diào)節(jié)亞基的作用。20

G1期

細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，G1期cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄。21CyclinD與CDK結(jié)合使Rb釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F23

G1/

S期

cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。向細(xì)胞內(nèi)注射CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期，說(shuō)明細(xì)胞進(jìn)入S期需要CyclinE的參與。

S期

將CyclinA的抗體注射到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細(xì)胞的DNA合成，推測(cè)CyclinA是DNA復(fù)制所必需的。24

G2/M期

cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件。25

M期

在分裂中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)一種未知的途徑，激活后期促進(jìn)因子APC(anaphasepromotingcomplex)，負(fù)責(zé)將泛素連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期。26哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中各時(shí)相不同cyclin的作用27（四）CDK及其調(diào)控

CDK即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin–dependentkinase,CDK)，控制著細(xì)胞周期各期之間的順序轉(zhuǎn)換。CDK是一組相關(guān)聯(lián)的Ser/Thr蛋白激酶。不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。酵母中細(xì)胞周期的進(jìn)程主要由單一的CDK（P34cdc2/cdc28）所控制。多細(xì)胞生物中，細(xì)胞周期各期之間的轉(zhuǎn)換需要不同的CDK。30脊椎動(dòng)物的CDKCDK結(jié)合的相應(yīng)cyclin作用的細(xì)胞周期CDK1CDK2

CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7CyclinA,BCyclinACyclinD1,D2,D3CyclinE

CyclinD1,D2,D3P35*,CyclinD1,D2,D3CyclinD1CyclinH,P36*G2/M轉(zhuǎn)換；M早期S期G1期G1/S轉(zhuǎn)換G1期G0/G1轉(zhuǎn)換、G1期神經(jīng)纖維的磷酸化、G1期G0/G1轉(zhuǎn)換活化CDK*P35，P36的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞周期蛋白無(wú)相似性31

1．Cyclin的結(jié)合是CDK激活的第一步CDK活性的最初調(diào)節(jié)者是cyclin亞單位。Cyclin與相應(yīng)的CDK結(jié)合后，引起CDK空間構(gòu)象改變，暴露其催化亞基。各種細(xì)胞周期蛋白程序化的合成和降解保證各對(duì)應(yīng)CDK適時(shí)的活化，維持細(xì)胞周期的正確時(shí)序。細(xì)胞周期各時(shí)相MPF、P34、P56的變化332．CDK的磷酸化與去磷酸化

以P34cdc2(CDK1)為例，如果對(duì)P34cdc2磷酸化作用位點(diǎn)不同，則對(duì)該酶的活性分別產(chǎn)生正向和負(fù)向的控制。完整的P34cdc2-cyclin復(fù)合物需要磷酸化才能被激活，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。35

P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin復(fù)合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，Myt1是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15脫磷酸化的蛋白磷酸酶為雙特異性磷酸酶Cdc25蛋白。36P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKsactivitingkinase）應(yīng)答Thr161的磷酸化，這是另一種蛋白激酶CDK7-CyclinH復(fù)合物。當(dāng)磷酸酶-1將此位點(diǎn)的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。373．CDK抑制劑的作用

除了磷酸化／去磷酸化可以調(diào)節(jié)MPF活性外，另有一類CDK抑制因子（CDCkinaseinhibitor,CKI）可與CDK結(jié)合抑制其活性。38（1）Ink4(Inhibitorofcdk4)：如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，專一地與CDK4、CDK6結(jié)合，阻止CDK和cyclinD的結(jié)合。使細(xì)胞周期不能從G1期的調(diào)控點(diǎn)進(jìn)入到下一個(gè)時(shí)相。39（2）Cip/Kip：包括P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能與多種cyclin-CDK復(fù)合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–CDK4結(jié)合，抑制cyclin-CDK復(fù)合物的蛋白激酶活性，使一些細(xì)胞增殖所需要的蛋白質(zhì)磷酸化受阻，細(xì)胞停留在G1期。40

此外P21cip1還可與DNA聚合酶δ亞單位PCNA(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)相互作用，抑制DNA復(fù)制，但不影響DNA修復(fù)。41CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化

CDK1的調(diào)節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase

在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)一種未知的途徑，激活后期蛋白復(fù)合體-APC，將遍在蛋白連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期·APC介導(dǎo)選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結(jié)合

(通過(guò)泛素依賴性途徑降解)·APC主要介導(dǎo)兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動(dòng)；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開(kāi)始去凝集，核膜重建。