生化分離實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)

過(guò)氧化氫酶的分離純化鑒定過(guò)氧化氫酶又稱觸酶，是一類廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟，植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶。過(guò)氧化氫酶專一分解過(guò)氧化氫，溶于水，幾乎不溶于乙醇，氯仿，乙醚。過(guò)氧化氫酶是在生物演化過(guò)程中建立起來(lái)的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，其生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解，防止脫脂過(guò)氧化。迄今為止，過(guò)氧化氫酶已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)，食品業(yè)，乳制品業(yè)，紙漿和造紙業(yè)，以及農(nóng)業(yè)環(huán)保產(chǎn)業(yè)中有應(yīng)用價(jià)值的酶之一。實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)原理勻漿使細(xì)胞破碎，讓細(xì)胞中的蛋白質(zhì)釋放。用重金屬鹽沉淀，高速離心使產(chǎn)物與雜蛋白分離。凝膠柱利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別分離出所需的蛋白質(zhì)。再用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量不同移動(dòng)速度也不同，檢驗(yàn)得到蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。最后用Folin-酚試劑法測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。實(shí)驗(yàn)步驟1.粗酶的提取2.初步分離純化3.進(jìn)一步分離純化4.過(guò)氧化氫酶鑒定粗酶的提取將10克的豬肝用剪刀剪碎，以料水質(zhì)量比1:5的比例加水研磨，在高速勻漿機(jī)的作用下將其打成肝糜，用高速離心機(jī)12000rpm下離心15min，取上清液，即為粗酶液。初步分離純化在粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，配制為30%的溶液，用玻璃棒攪拌15min。再在高速離心機(jī)中12000rpm下離心15min，取上清液。將得到上清液放入鹽析袋中鹽析過(guò)夜。將鹽析袋置于攪拌子勻速攪拌的裝有蒸餾水的大燒杯中鹽析。鹽析時(shí)間為一夜。（使之鹽析充分）鹽析袋使用前需檢漏。進(jìn)一步分離純化由于鹽析后的溶液中仍含有大量的雜蛋白，為防止雜蛋白堵塞S200凝膠柱，進(jìn)樣前先進(jìn)行一次抽濾。將抽濾所得液體進(jìn)樣到S200凝膠柱中分離，設(shè)流速為1ml/min,壓力為0.5帕。收集峰上的溶液。抽濾設(shè)備S200凝膠柱出峰位置圖（藍(lán)線）0.00mlMethodRun2013-10-29,9:55:42,Method:,Result:c:\...\prime\ManualRuns(prime)\ManualRun0.RES0.00mlBaseTime{}0.00mlPause0.02013-10-29,9:55:42(Manual)0.00mlError:62CheckthattubepositionisOK0.00mlConcentration0%B0.00mlContinue2013-10-29,9:55:45(Manual)0.00mlFlow2.0ml/min11.72mlPause0.02013-10-29,10:01:37(Manual)11.72mlFlow0.0ml/min11.72mlContinue2013-10-29,10:01:51(Manual)11.72mlFlow2.0ml/min17.96mlPause0.02013-10-29,10:04:58(Manual)17.96mlFlow0.0ml/min17.97mlContinue2013-10-29,10:05:20(Manual)17.97mlFlow2.0ml/min116.74mlFractionsize3.0ml222.89mlFractionOff過(guò)氧化氫酶的鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：制膠，將粗酶，硫酸銨沉淀后的酶液，凝膠柱分離后的溶液分別與溴酚藍(lán)以1:1比例混合沸水加熱5min制成樣品。將3個(gè)樣品及mark加樣至凝膠中，跑電泳，染色，脫色后觀察。

垂直板電泳裝置加樣樣品遷移方向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜144002500045000662001160009號(hào)峰上液體4號(hào)峰上液體3號(hào)峰上液體標(biāo)準(zhǔn)蛋白mark其它峰未跑出條帶條帶順序：過(guò)氧化氫酶經(jīng)查資料得其相對(duì)分子量為57000KDFolin-酚試劑法測(cè)蛋白質(zhì)濃度：標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于500nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。分光光度計(jì)蛋白質(zhì)濃度（ug/ml）03.857.6915.3823.0830.7738.46吸光度00.0380.0750.1060.1820.2580.308經(jīng)過(guò)電泳得出的條帶我們可以看出過(guò)氧化氫酶酶可能存在于3,4,9號(hào)峰中，所以我們?nèi)〈置福?號(hào)峰、4號(hào)峰、9號(hào)峰的酶液做蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。A粗酶=1.499經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照粗酶187.075ug/mlA3=0.174計(jì)算得蛋白質(zhì)濃3號(hào)峰21.45ug/mlA4=0.185