版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
基因組測序人類基因組計劃HumanGenomeProjectTheHumanGenome23chromosomes3,2x109basepairs(3,200,000,000)<5%mRNA(30,000genes)<3%translatedintoprotein>90%unknownfunctionExon1Exon2Etein-codingregion............geneStrategies:randomshotgun(HUGO)wholegenomeshotgun(Celera)RandomShotgun:Genomiclibraryproductionwholegenome:3,200,000kbpartiallydigestedDNA:sizing:100-500kbBAClibrariesAdaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenterMappingpieces:100-500kbMappingMARKERSMARKERS:
sequencetaggedsites(STS)
restrictionsitepattern
knowngenes...MappingofBAC/YACClonesmappedBACclone:100-500kbshearedDNA:1.0-2.0kbsequencingtemplates:randomreads(0.6-1kb)Adaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenterRandomShotgun:Sequencing(randomphase)Celera:WholeGenomeShotgunSequencingwholegenome:3,200,000kbshearedDNA:1.0-2.0kbsequencingtemplatesAdaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenterrandomreads(0.6-1kb)ShotgunSequencing:Assembly(both)=Consensus(sequence)gaplowbasequalitysinglestrandedregionmis-assembly(inverted)Adaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenter?draftquality“ShotgunSequencing:Finishing(both)ThefinalGoalHighAccuracySequence:<1error/10,000basesAdaptedfrom: BaylorCollegeofMedicine- HumanGenomeSequencingCenter?finishedquality“DNA測序原理MilestonesofDNASequencing1953Watson,Crick,Franklin molecularstructureofDNA1976 Maxam,Gilbert DNAsequencingviachemicaldegradation1977 Sanger DNAsequencingviachaintermination1986 Hood;Ansorge automatedDNAsequencingwith
‘dyeprimer’
1989 Murray ‘cyclesequencing’withTaqpolymerase1991 NEN-DuPONT ‘dyeterminator’sequencing1999 ABI/MD
96wellcapillarysequencerHowDNASequenceIsDetermined?PolyacrylamideGelElectrophoresisATC32PAT32PA32PTAGCTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32PDNAfragmentshavingadifferenceofonenucleotidecanbeseparatedongelelectrophoresisButthesebandscan’ttellustheidentityoftheterminalnucleotidesIfthosebandwiththesameterminalnucleotidecanbegrouped,thenitispossibletoreadthewholesequence雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法流式細胞儀測序法大規(guī)模平行實測法、
DNA芯片法經(jīng)典方法新技術(shù)方法Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam
和Gilbert,1977)Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger和Coulson1977)DNA測序方法:生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸,每組寡核苷酸都有固定的起點,但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等,因此上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物,這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下,對各組寡核苷酸進行電泳分析,只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道上,即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。
方法概述:核酸序列分析的經(jīng)典方法:化學(xué)法:
化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)酶法:DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)Sanger'sMethod:Maxam-Gilbert'sMethod:HowtoObtainDNAFragments32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGA32PSpecificReactiontoG
ATCGSTOPATerminatedKeepongoingBiosyntheticmethodChemicalmethodTemplateorNon-radioactive(invisible)32PA,T,C,GAAnalogueDestroy→CleavageDestroy→CleavageATCGATCGATProducingvariousfragmentsJuangRH(2004)BCbasics化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理:基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1種或2種堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性,精確地控制反應(yīng)強度,使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中,不同分子在不同位點斷裂,從而獲得一系列大小不同的DNA片段,將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前,用同位素標記DNA的5′末端,用4組不同的特異反應(yīng),就可以使末端標記的DNA分子切成不同長度的片段,其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜。反應(yīng)的關(guān)鍵:使DNA的4種核苷酸中,只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng);堿基的特異性修飾;被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移;失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。常用的專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾,并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯,甲酸和肼。
4組特異的反應(yīng)如下:(1)G反應(yīng)用硫酸二甲酯使鳥嘌呤上的N7原子甲基化,加熱引起甲基化鳥嘌呤脫落,多核苷酸鏈可在該處斷裂。(2)G+A反應(yīng)用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化,從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定,再用哌啶使鍵斷裂。(3)T+C反應(yīng)用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂,再用哌啶除去堿基。(4)C反應(yīng)當(dāng)有鹽存在時,只有C與肼反應(yīng),并被哌啶除去。哌啶促使修飾堿基脫落,并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂。
DNA的化學(xué)測序示意圖Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10—200bp的測序材料,用堿性磷酸化酶處理該片段,消除5′末端上的磷酸,在5′OH端標記32P,用多核苷酸磷酸激酶催化,標記片段變性為單鏈,化學(xué)試劑在特定堿基位置降解單鏈DNA,產(chǎn)生一組長度不等的DNA片段,
反應(yīng)試劑G反應(yīng):硫酸二甲酯G+A反應(yīng):甲酸T+C反應(yīng):肼C反應(yīng):NaCl+肼化學(xué)試劑在特定堿基位置降解單鏈DNA,產(chǎn)生一組長度不等的DNA片段,經(jīng)電泳和放射性自顯影后,從4個反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀,待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出。Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法不需要進行酶催化反應(yīng),因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差;對未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測序;化學(xué)降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G,C含量較高的DNA片段,以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。測定的長度短(如裂解位點的統(tǒng)計學(xué)分布等等)Advantages:Disadvantages:Sanger的酶降解測序法(鏈終止法)這項技術(shù)的關(guān)鍵是在DNA的聚合過程中依賴特殊反應(yīng)底物(2′3′—雙脫氧核苷三磷酸ddNTP)的特異性終止進行DNA測序。DNAreplication:biochemistryOCNpurineorpyrimidinePOOOHPOOOHPOOOHHOPOOOHOOCNpurineorpyrimidineOH5’3’2',3'ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中,但由于沒有3'羥基,它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈,因此,正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。TheSangermethodrequiresMultiplecopiesofsinglestrandedtemplateDNAAsuitableprimer(asmallpieceofDNAthatcanpairwiththetemplateDNAtoactasastartingpointforreplication)DNApolymerase(anenzymethatcopiesDNA,addingnewnucleotidestothe3’endofthetemplateA‘pool’ofnormalnucleotidesAsmallproportionofdideoxynucleotideslabeledinsomeway(radioactivelyorwithfluorescentdyes)ThetemplateDNApiecesarereplicated,incorporatingnormalnucleotides,butoccasionallyandatrandom
dideoxy(DD)nucleotidesaretakenup.ThisstopsreplicationonthatpieceofDNATheresultisamixofDNAlengths,eachendingwithaparticularlabeledDDnucleotide.Becausethedifferentlengths‘travel’atdifferentratesduringelectrophoresis,theirordercanbedetermined.酶法序列分析的原理
酶反應(yīng):DNA聚合酶(Klenow)電泳方向模板CCGGTAGCAACT3′5′GG5′3′標記引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNAtemplateisdenaturedtosinglestrands.DNAprimer(with3’endnearsequenceofinterest)isannealedtothetemplateDNAandextendedwithDNApolymerase.Fourreactionsaresetup,eachcontaining:DNAtemplatePrimerannealedtotemplateDNADNApolymerasedNTPS(dATP,dTTP,dCTP,anddGTP)Next,adifferentradio-labeleddideoxynucleotide(ddATP,ddTTP,ddCTP,orddGTP)isaddedtoeachofthefourreactiontubesat1/100ththeconcentrationofnormaldNTPs.ddNTPspossessa3’-Hinsteadof3’-OH,competeinthereactionwithnormaldNTPS,andproducenophosphodiesterbond.ManualDideoxyDNAsequencing-Howitworks:Whenevertheradio-labeledddNTPsareincorporatedinthechain,DNAsynthesisterminates.EachofthefourreactionmixturesproducesapopulationofDNAmoleculeswithDNAchainsterminatingatallpossiblepositions.Extensionproductsineachofthefourreactionmixutesalsoendwithadifferentradio-labeledddNTP(dependingonthebase).Next,eachreactionmixtureiselectrophoresedinaseparatelane(4lanes)athighvoltageonapolyacrylamidegel.Electrophoresisat70°C(2h).FixgelinHAc,drygel(1h).Autoradiography(24-48h).PatternofbandsineachofthefourlanesisvisualizedonX-rayfilm.Locationof“bands”ineachofthefourlanesindicatethesizeofthefragmentterminatingwitharespectiveradio-labeledddNTP.DNAsequenceisdeducedfromthepatternofbandsinthe4lanes.取代放射性同位素的方法地高辛,生物素:用地高辛,生物素代替發(fā)射性同位素示蹤測序反應(yīng)產(chǎn)物,最后用酶顯色反應(yīng)顯示出測序結(jié)果.銀染方法:
把生成DNA分子核苷酸堿基順序的方法與一種超敏感的銀染方法相結(jié)合。這一新的技術(shù)組合使電泳分離的序列片段不依賴于儀器就直接可見。這種無放射性的系統(tǒng)包括通過用酶促雙氧鏈終止反應(yīng)形成一系列DNA序列片段,凝膠電泳分離這些片段,并把凝膠浸入超敏感的銀染溶液中,觀察引物延伸產(chǎn)物的銀染條帶,從而確定DNA分子的序列。熒光標記物ddGTPddATPddTTPddCTP引物標記法測序(DyePrimer)一個樣本,4個反應(yīng)。4個反應(yīng)中引物序列相同,但分別標記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP反應(yīng)結(jié)束后,將4管反應(yīng)液混合,經(jīng)乙醇沉淀后上樣Advantagesofprimer-labels:cleanerDisadvantages:expensivetomanufacturefourreactionslimitedtocertainregions,customoligosorlimitedtoclonedinsertsbehind‘universal’primingsites.Solution:fluorescentdyeterminators(upgrade,seconditeration)終止法測序(DyeTerminator)一個樣本,1個反應(yīng)。反應(yīng)中包含分別帶4色熒光標記的ddNTP(終止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP測序反應(yīng)結(jié)束后,采用乙醇沉淀法進行純化,除去過量的ddNTP后上樣。DideoxyDNAsequencingwastimeconsuming,radioactive,andthroughputwaslow,typically~300bpperrun.AutomatedDNAsequencingemploysthesamegeneralprocedure,butusesddNTPslabeledwithfluorescentdyes.Combine4dyesinonereactiontubeandelectrophoresinonelaneonapolyacrylamidegelorcapillarycontainingpolyacrylamide.UVlaserdetectsdyesandreadsthesequence.Sequencedataisdisplayedascoloredpeaks(chromatograms)thatcorrespondtothepositionofeachnucleotideinthesequence.Throughputishigh,upto1,200bpperreactionand96reactionsevery3hourswithcapillarysequencers.MostautomatedDNAsequencerscanloadroboticallyandoperatearoundtheclockforweekswithminimallabor.AutomatedDye-TerminatorDNASequencing:Advantagesofprimer-Terminator:--performedinasingletubeandtheresultingfragmentstobeloadedinasinglewell,resultingingreatersamplecapacityper“l(fā)ane”.Disadvantages:
--lesscleanerAmountoffluorescentDNAproducedislowandthusalargeamountoftemplateisrequiredtoproducegoodfluorescentsignals.Solution:CyclesequencingCyclesequencingSequenase(T7)polymerasehasbeenawidelyusedenzymeforDNAsequencingwithradioactivenucleotidesbecauseofitshighprocessivityandlowerrorrate.HoweverusingthistypeofenzymeforfluorescentDNAsequencingisnotoptimalbecausetheamountoffluorescentDNAproducedislowandthusalargeamountoftemplateisrequiredtoproducegoodfluorescentsignals.TheenzymecurrentlyingeneraluseforautomatedfluorescentDNAsequencingisavariantofTaqDNApolymerase.ThethermostabilityofTaqpolymeraseallowsthesequencingreactionstobecarriedoutlikePCRreactions,andthereactionsarecalled"cyclesequencing"reactions.Theadvantageofusingthethermostable
TaqpolymeraseovertheuseofSequenaseisthatmultipleroundsofsequencingcanbeperformedwithouttheneedtoaddfreshenzyme.PolymeraseChainReaction95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°CCyclesequencingreactionsareanalogoustoPCRsexceptonlyasingleprimerisusedandonlysinglestrandedproductsaregenerated.CycleSequencing95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°C95°C50-65°C72°CCyclesequencingThisallowstheuseofmuchlesstemplateDNA,Modifications(pointmutationsaffectingaminoacidresiduesinorneartheactivesite)totheTaqDNApolymerasehaveenabledittoincorporatethefluorescentdye-labeledterminatorsmoreevenlyandefficiently,resultinginveryevenpeakheightsoverasequenceread.AttemptshavebeenmadetodeveloppolymeraseswhichhavesomeoftheadvantageouspropertiesofSequenasebutarethermostablelikeTaq.Cyclesequencing測序技術(shù)進展
同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳
多色熒光標記毛細管電泳
單色熒光標記平板電泳同位素標記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA
TTGCATTGTC
TGCATTGT
C
TDNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸,然后進行Sanger測序反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳(平板電泳或毛細管電泳)分離后,通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光,檢測器采集熒光信號,并依此確定DNA堿基的排列順序。
DNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機旋光鏡/棱鏡組件DNA序列分析自動化:用熒光劑標記DNA引物或ddNTP,帶有這種熒光劑標記的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進行測序反應(yīng),跑DNA凝膠后用計算機檢測。CapillaryelectrophoresisAdvantagescapillaryLongerreadsMorereliable98-99%AutomatedsequencingreactionsAutomatedsampleapplicationNogelneedstobemadeAutomaticprocessingofresults大規(guī)模DNA測序的趨勢——自動化DNA測序?qū)崿F(xiàn)規(guī)?;闹匾獥l件是自動化和機械化。目前,DNA制備、克隆文庫組建及篩選、DNA測序分析、數(shù)據(jù)的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆群順序排定等過程均已平行發(fā)展,自動化操作緊隨其后。隨著DNA測序不斷由半自動化向自動化過渡,原始數(shù)據(jù)積累將不成問題,關(guān)鍵是把全基因的散測序組裝起來,以實現(xiàn)DNA測序的完整性。
未來的測序技術(shù)新型的電離技術(shù)如電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光吸收技術(shù)使利用質(zhì)譜法分析大片段DNA成為可能。其中四極離子捕獲效果更好。Fourier轉(zhuǎn)型質(zhì)譜或飛行時間質(zhì)譜可進行極為敏感的DNA測序。一、質(zhì)譜法(massspectrometry)雜交測序法是一種創(chuàng)新性的DNA測序技術(shù),主要是采用一系列n-mer長的所有可能的寡核苷酸與未知DN
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2023年監(jiān)護病房項目籌資方案
- 救生員勞務(wù)外包合同(2篇)
- 2024年地下車庫停車位使用權(quán)轉(zhuǎn)讓合同協(xié)議書3篇
- 2024年度租賃房屋物業(yè)管理服務(wù)合同3篇
- 2024年度酒店員工培訓(xùn)與職業(yè)發(fā)展合同范本3篇
- 2025酒店用品采購合同
- 2024年甲乙雙方關(guān)于新一代移動應(yīng)用開發(fā)與推廣的合同
- 2025中英文演出合同范本
- 2024年水電安裝預(yù)埋與建筑電氣設(shè)備維護合同3篇
- 2025房地產(chǎn)營銷策劃及銷售代理工作架構(gòu)和獨家代理合同書上
- 山東省濟南市2023-2024學(xué)年高一上學(xué)期1月期末考試 物理 含答案
- 成人重癥患者人工氣道濕化護理專家共識 解讀
- 機器學(xué)習(xí)(山東聯(lián)盟)智慧樹知到期末考試答案章節(jié)答案2024年山東財經(jīng)大學(xué)
- 科研設(shè)計及研究生論文撰寫智慧樹知到期末考試答案章節(jié)答案2024年浙江中醫(yī)藥大學(xué)
- 商業(yè)倫理與企業(yè)社會責(zé)任(山東財經(jīng)大學(xué))智慧樹知到期末考試答案章節(jié)答案2024年山東財經(jīng)大學(xué)
- 2024年輔警招聘考試試題庫及完整答案(全優(yōu))
- 美國史智慧樹知到期末考試答案2024年
- 2024年江蘇省普通高中學(xué)業(yè)水平測試小高考生物、地理、歷史、政治試卷及答案(綜合版)
- 屋頂分布式光伏項目安全文明施工控制措施
- 水泥保證供應(yīng)實施方案及服務(wù)承諾書
- 2022機要密碼工作總結(jié)機要室工作總結(jié).doc
評論
0/150
提交評論