第十五章色譜法導(dǎo)論2015s

第十五章色譜法導(dǎo)論Chromatography

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學(xué)色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力的不同而達到分離目的?！?5.1概述

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學(xué)ts1、色譜法的由來：1903年：茨維特（俄）分離植物色素；植物葉子萃取物充有碳酸鈣的玻璃管加入石油醚色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。一、色譜法簡介

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學(xué)Tsweet的實驗

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學(xué)2、基本術(shù)語：固定相：填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相（固體或液體）。流動相：自上而下運動的一相（一般是氣體、液體或超臨界流體）。色譜柱：裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）。

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學(xué)3、色譜分離原理利用不同物質(zhì)在流動相和固定相中具有不同的分配系數(shù)，當流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生相互作用，這些組分在兩相間進行反復(fù)多次分配，原來微小的分配差異產(chǎn)生了很明顯的分離效果，不同組分在固定相中滯留時間長短不同，從而依先后順序流出色譜柱。

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學(xué)二、色譜法的分類：1、按兩相物理狀態(tài)分類按流動相分按固定相分氣相色譜（GC）液相色譜（LC）超臨界流體色譜（SFC）氣固色譜（GSC）氣液色譜（GLC）液固色譜（LSC）液液色譜（LLC）

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學(xué)2、按固定相的形式分類按固定相在支持體中的形狀分柱色譜平板色譜紙色譜薄層色譜毛細管柱色譜法填充柱色譜法

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學(xué)3、按分離過程的化學(xué)原理分類吸附色譜法：利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法。分配色譜法：利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法。離子交換色譜法：利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法。凝膠色譜法親和色譜法

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學(xué)三、色譜法的特點1.分離效率高2.靈敏度高3.分析速度快4.應(yīng)用范圍廣5.被分離組分的定性較為困難

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學(xué)§15.2色譜基本概念一、色譜分離過程混合物樣品（A+B）→色譜柱中分離→檢測器→記錄下來。組分從色譜柱流出時，各個組分在檢測器上所產(chǎn)生的信號隨時間變化，所形成的曲線叫色譜圖。記錄了各個組分流出色譜柱的情況，又叫色譜流出曲線

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學(xué)二、色譜常用術(shù)語

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學(xué)1、色譜流出曲線和色譜峰：由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。

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學(xué)2、基線—在實驗操作條件下，色譜柱中只有流動相通過（沒有組分流出時）的曲線叫基線。穩(wěn)定情況下：一條水平直線?；€上下波動稱為噪音。

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學(xué)3、色譜峰的高度h峰高h—色譜峰最高點與基線之間的距離，可用mm，mV，mA表示。峰的高低與組分濃度有關(guān)，峰越高越窄越好。h

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學(xué)σ4.色譜峰的寬度標準偏差σ——峰高0.607倍處的色譜峰寬的一半。

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學(xué)峰底寬Wb——色譜峰兩側(cè)拐點所作切線在基線上的距離Wb=4σ

半峰寬W1/2——峰高一半處色譜峰的寬度

W1/2

=2.354σW1/2

=0.589Wb

Wb

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學(xué)5.色譜峰面積A——色譜峰與峰底所圍的面積。對于對稱的色譜峰A=1.065hW1/2

對于非對稱的色譜峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2

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學(xué)6.色譜保留值——定性的依據(jù)t0（1）死時間t0——不被固定相吸附或溶解的組分流經(jīng)色譜柱所需的時間。從進樣開始到柱后出現(xiàn)峰最大值所需的時間。氣相色譜—惰性氣體（空氣、甲烷等）流出色譜柱所需的時間。

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學(xué)(2)保留時間tR———組分流經(jīng)色譜柱時所需時間。進樣開始到柱后出現(xiàn)最大值時所需的時間。操作條件不變時，一種組分對應(yīng)有一個tR定值。

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學(xué)（3）調(diào)整保留時間t’R扣除了死時間的保留時間。t’R=tR-t0t’R體現(xiàn)的是組分在柱中被吸附或溶解的實際時間。t’R

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學(xué)保留值用體積表示：（4）死體積V0—不被固定相滯留的組分流經(jīng)色譜柱所消耗的流動相體積稱死體積，色譜柱中載氣所占的體積。

V0=t0F0F0為柱后出口處流動相的體積流速mL/min

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學(xué)（5）保留體積VR

—組分從進樣開始到色譜柱后出現(xiàn)最大值時所需流動相體積，組分通過色譜柱時所需流動相體積。VR=tRF0（6）調(diào)整保留體積V’R—扣除了死體積的保留體積，真實的將待測組分從固定相中攜帶出柱子所需的流動相體積。V’R=t’RF0V0、t0與被測組分無關(guān)，因而V’R、t’R更合理地反映了物質(zhì)在柱中的保留情況。

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學(xué)（7）相對保留值γ2，1或γi,s—在相同操作條件下，組分2或組分i對另一參比組分1或s調(diào)整保留值之比

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學(xué)（8）保留指數(shù)：是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)規(guī)定正構(gòu)烷烴保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100，如正己烷、正庚烷的保留指數(shù)分別為600和700。被測物質(zhì)的保留指數(shù)Ix可采用兩個相鄰正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)進行測定將碳數(shù)為n和n+1的正構(gòu)烷烴加到被測物質(zhì)x中進行色譜分析，測得它們的保留值

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學(xué)保留指數(shù)計算方法n）tR(n+1)

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學(xué)由色譜流出曲線，可以看出：(i)根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；(ii)根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；(iii)根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；(iv)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評價色譜柱分離效能的依據(jù)；(v)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。

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學(xué)7、分配系數(shù)K在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相間達到分配平衡時的濃度比值，用K表示。8、分配比k

在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達到平衡時的質(zhì)量比，稱為分配比，也稱容量因子，用k表示。

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學(xué)分配系數(shù)和分配比之間的關(guān)系

分配系數(shù)K：與柱中固定相和流動相的體積無關(guān)，而取決于組分及兩相的性質(zhì)，并隨柱溫、柱壓變化而變化。分配比k：決定于組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)，隨柱溫、柱壓的變化而變化，還與流動相及固定相的體積有關(guān)。

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學(xué)理論上可以推導(dǎo)出：β稱為相比

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學(xué)9、保留值與分配系數(shù)、分配比之間的關(guān)系根據(jù)物料平衡原理，可推導(dǎo)出保留體積與熱力學(xué)平衡常數(shù)K之間的關(guān)系：

色譜基本保留方程

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學(xué)兩個組分怎樣才算達到完全分離？首先

兩組分的色譜峰之間的距離必須相差足夠大其次

峰必須窄下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。溶質(zhì)A和B在沿柱移動時不同位置處的濃度輪廓濃度沿柱移動距離LAABB§15.3色譜理論基礎(chǔ)

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學(xué)一、塔板理論——平衡理論

在50年代，色譜技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經(jīng)驗理論－塔板理論用于色譜分析法。

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學(xué)把色譜柱比作一個精餾塔，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標。對一個色譜柱來說，若色譜柱長度L固定，每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度。

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學(xué)塔板理論假設(shè)：1.色譜往內(nèi)徑和校內(nèi)填科填充均勻，在柱內(nèi)一小段高度內(nèi)組分分配瞬間達平衡（H→理論塔板高度）。2．載氣非連續(xù)而是間歇式（脈動式）進入色譜柱，每次進氣一個塔板體積。3．樣品和載氣均加在第0號塔板上，且縱向分子擴散可以忽略（沿柱方向的縱向擴散）4．分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)

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學(xué)1.理論板數(shù)和理論塔板高度的計算色譜柱長：L理論塔板高度H

：使組分在柱內(nèi)兩相間達到一次分配平衡所需要的柱長理論塔板數(shù)n

：組分流過色譜柱時，在兩相間進行平衡分配的總次數(shù)，則三者的關(guān)系為：n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。

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學(xué)2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度保留時間包含死時間，在死時間內(nèi)不參與分配，即：組分在tM時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：n有效與H有效扣除了死時間，更能真實地反應(yīng)柱效

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學(xué)3、塔板理論的優(yōu)缺點成功之處：解釋了色譜流出曲線的形狀，并提出了計算和評價柱效能高低的參數(shù)（n，H）。局限性：塔板理論只能定性的給出理論塔板數(shù)和塔板高度的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它的應(yīng)用。

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學(xué)二、速率理論:色譜過程動力學(xué)理論吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對GC、LC都適用。㈠速率理論方程式：H=A+B/u+Cu式中u為流動相的線速度；A、B、C為常數(shù)，分別代表渦流擴散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)及傳質(zhì)阻力項系數(shù)。

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學(xué)1.渦流擴散項A

A=2λdp

（1）影響因素：①λ：填充物的不規(guī)則程度。λ↓，A↓。②dP：填充物的平均顆粒直徑。dP

↓，A↓。（2）減小A的方法：①填充色譜柱時要均勻、緊密；②使用適當細度、顆粒均勻的填充物。

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學(xué)2.分子擴散項B/u以GC為例：

B/u=2γDg/u（1）影響因素：①γ：彎曲因子，填充物對分子擴散的障礙因素，γ↓，B↓，(B/u)↓。②Dg：組分在流動相中的擴散系數(shù)。Dg↓，B↓，(B/u)↓。影響Dg的因素：與載氣分子量的平方根成反比；隨T柱↓而↓，隨P柱↑而↓。

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學(xué)③流動相的流速：u↑，(B/u)↓。（2）減小(B/u)的方法：①選用合適分子量的載氣；②增大流動相的流速；③選擇合適的柱溫、柱壓。3、傳質(zhì)阻力項(Cu)：以GLC為例：Cu=(Cg+C1)u（1）氣相傳質(zhì)阻力Cg：試樣從氣相到達氣液兩相界面上受到的阻力。

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學(xué)①dP：dP

↓，Cg↓。②Dg：Dg↑，Cg↓。（M載↓，柱溫↑，柱壓↓。）

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學(xué)2、液相傳質(zhì)阻力系數(shù)

C1：試樣從氣液兩相界面到達液相內(nèi)部過程中受到的阻力。

①液膜厚度df：df↓，Cl↓。②Dl：組分在液相中的擴散系數(shù)。Dl↑，

Cl

↓。3、流動相的流速：u↓，(Cu)↓。

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學(xué)4、消除傳質(zhì)阻力項的方法：（1）采用粒度小的均勻填充物；（2）采用合適分子量的氣體作載氣；（3）降低固定相的液膜厚度；（4）增大組分在液相中的擴散系數(shù)；（5）選擇合適的柱溫柱壓；（6）選擇合適流速的載氣。

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學(xué)㈡速率理論方程式的具體形式及其討論：1、表達式：對于GLC：2、提高柱效能的方法（或降低板高的方法、增大理論塔板數(shù)的方法，影響色譜峰變寬的因素）（自己總結(jié)）

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學(xué)3、載氣線速度對H的影響：（1）影響：矛盾u↑，(B/u)↓，(Cu)↑u↓，(B/u)↑，(Cu)↓必須找到Hmin對應(yīng)的uopt。（2）Hmin和uopt：uHuopt

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學(xué)uHuopt

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學(xué)（3）討論：較低線速時，分子擴散項起主要作用；較高線速時，傳質(zhì)阻力項起主要作用；u較小時，選用M較大的載氣，較低的柱溫和較高的柱壓；u較大時，選用M較小的載氣，較高的柱溫和較低的柱壓。

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學(xué)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。各種因素相互制約：增大載氣線速度，會使分子擴散項的影響減小，柱效能隨之增加，但同時傳質(zhì)阻力項的影響會增大，柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的影響，只有選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。

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學(xué)三、色譜基本分離方程（一）分離度Ｒ——色譜柱的總分離效能指標

定義：相鄰兩個峰的保留值之差與兩峰寬度平均值之比式中：分子反映了溶質(zhì)在兩相中分配行為對分離的影響，是色譜分離的熱力學(xué)因素。分母反映了動態(tài)過程溶質(zhì)區(qū)帶的擴寬對分離的影響，是色譜分離的動力學(xué)因素。結(jié)論：兩溶質(zhì)保留時間相差越大，色譜峰越窄，分離越好。

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學(xué)

兩個峰tR

相差越大，W越窄，Ｒ值越大，說明柱分離較能高。Ｒ＜１.0兩峰有部分重疊。Ｒ＝１.0兩組分能分開，分離程度達98%。Ｒ≥１.5兩個組分能完全分開（＞99.7%）

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學(xué)（二）色譜基本分離方程式 設(shè)兩相鄰峰的峰寬相等，即w1=w2，則

又

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學(xué)稱為柱效項；稱為柱選擇項；相對保留因子

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學(xué)與柱效的關(guān)系（柱效因子）R∝n1/2增加柱長減小塔板高度限制：L過長，保留時間延長，分析時間延長，色譜峰擴展。使用性能優(yōu)良的色譜柱，并選擇最佳分離條件

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學(xué)例1在一根1m長的填充柱上，空氣的保留時間為5s，苯和環(huán)己烷的保留時間分別為45s和49s，環(huán)己烷色譜峰的Wb為5s。欲得到R=1.2的分離度，則有效理論塔板數(shù)應(yīng)為多少？需要的柱長應(yīng)為多少？

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學(xué)例2：

在一根3m長的色譜柱上，分析某試樣時，得到物質(zhì)A和B的調(diào)整保留時間分別為13和16min，后者的峰底寬為1min，計算：(1)該色譜柱的有效理論塔板數(shù)；

(2)A、B兩組分的相對保留值；

(3)達到完全分離時需要的有效理論塔板數(shù)為多少？此時應(yīng)使用多長的色譜柱？

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學(xué)§15.4色譜定性定量分析一、試樣的預(yù)處理化學(xué)衍生化通過合適的化學(xué)反應(yīng)，改變組分的色譜分離性質(zhì)，以及利用生成特殊衍生物改進組分的分離或增強檢測器響應(yīng)的方法。裂解色譜技術(shù)將一些難揮發(fā)的固體試樣在裂解器中裂解成低分子碎片后，再進行色譜分析的技術(shù)。分離與富集分離一些不適合氣相色譜直接分析的組分；對低含量組分進行預(yù)富集，以滿足檢測器靈敏度的要求。還有蒸餾、萃取、吸附和冷凍等方法。

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學(xué)二、定性分析定性分析的任務(wù)是確定色譜圖上各個峰代表什么物質(zhì)。

1.利用保留值與已知物對照定性（1）利用保留時間定性在相同色譜條件下，將標準物和樣品分別進樣，兩者保留值相同，可能為同一物質(zhì)。此方法要求操作條件穩(wěn)定、一致，必須嚴格控制操作條件，尤其是流速。

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學(xué)

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學(xué)（2）利用峰高增量定性

若樣品復(fù)雜，流出峰距離太近，或操作條件不易控制，可將已知物加到樣品中，混合進樣，若被測組分峰高增加了，則可能含該已知物。（3）利用雙色譜系統(tǒng)定性通過改變色譜條件來改變分離選擇性，使不同物質(zhì)顯示不同保留值。例：選用極性差別較大的兩種不同固定液來制備色譜柱，不同物質(zhì)具有不同保留值

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學(xué)2.根據(jù)文獻保留值數(shù)據(jù)定性（1）用相對保留值：r

i,s

用組分i對標準物s的相對保留值作為定性指標。只與兩組分的分配系數(shù)有關(guān)，不受操作條件的影響siis''RRttr=可選苯、正已烷、環(huán)已烷作標準物，手冊上列出許多r

i,s樣品、標準物——色譜柱，求得r

i,s，與手冊上對比。只要固定相性質(zhì)與柱溫確定，r

i,s

是個定值

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學(xué)（2）保留指數(shù)定性法：是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)規(guī)定正構(gòu)烷烴保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100，如正己烷、正庚烷的保留指數(shù)分別為600和700。被測物質(zhì)的保留指數(shù)Ix可采用兩個相鄰正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)進行測定將碳數(shù)為n和n+1的正構(gòu)烷烴加到被測物質(zhì)x中進行色譜分析，測得它們的保留值

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學(xué)保留指數(shù)計算方法利用上式求出未知物的保留指數(shù)與文獻值對照n）tR(n+1)

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學(xué)3、利用選擇性檢測器定性利用檢測器定性，只能確定是哪一類化合物：如若在火焰光度檢測器上有響應(yīng)，則組分為有機化合物；若在電子俘獲檢測器上有響應(yīng)，則組分中含鹵素、氧、氟等電負性強的原子或基團；若在硫磷檢測器上有響應(yīng)，則組分中含硫或磷。4、利用與其他儀器聯(lián)用定性目前聯(lián)用最成功的是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜-傅里葉紅外光譜聯(lián)用儀。

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學(xué)三、定量分析

氣相色譜定量分析是根據(jù)檢測器對溶質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)信號與溶質(zhì)的量成正比的原理，通過色譜圖上的峰面積或峰高，計算樣品中溶質(zhì)的含量。mi=fi

Aimi=fihi

mi—被測組分i的質(zhì)量，fi—比例系數(shù)Ai、hi—被測組分的峰面積及峰高

對稱峰：A=1.06×h×W1/2

不對稱峰：A=h(W0.15＋W0.85)/21、峰面積測量

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學(xué)2、定量校正因子

色譜定量分析是基于組分的量與峰面積成正比關(guān)系。由于同一檢測器對不同物質(zhì)具有不同的響應(yīng)值，即不同物質(zhì)檢測器的靈敏度不同，相同的峰面積并不意味著有相等的量。(1)絕對校正因子fi

：單位峰面積對應(yīng)組分的質(zhì)量。fi=mi/Ai

絕對校正因子受操作條件影響較大，要嚴格控制色譜條件，不易準確測定，沒有統(tǒng)一標準，無法直接引用，定量分析中采用相對較正因子。

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學(xué)⑵相對校正因子

用一個標準，把所有組分的A較正到標準物的A上，在同一標準上進行比較計算，如熱導(dǎo)池檢測器常用苯作標準。相對定量校正因子fi′定義：樣品中各組分的定量校正因子與標準物的定量校正因子之比。校正因子有質(zhì)量校正因子、摩爾校正因子、體積校正因子三種表示方法，最常見的為質(zhì)