一份豬鏈球菌病的病例報(bào)告

豬鏈球菌病的病例報(bào)告發(fā)病情況2014年1月20日，天氣寒冷，陰雨，氣溫降低到2°C。某豬場(chǎng)斷奶仔豬和育肥豬突然出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽、關(guān)節(jié)腫大、跛行等,體重多為35~55kg,該場(chǎng)獸醫(yī)技術(shù)人員給病豬投喂阿莫西林、青霉素460萬IU+鏈霉素1g頭,連續(xù)3d,癥狀未見明顯好轉(zhuǎn)，到25日齡時(shí)，共發(fā)病仔豬23頭，育肥豬8頭，死亡6頭，死亡率19.35%。經(jīng)詢問畜主了解到該場(chǎng)注射了豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病、豬瘟和口蹄疫疫苗，未注射其他疫苗。臨床癥狀豬鏈球菌病的類型豬鏈球菌病是一類病，臨床常見的有四種類型，分別為化膿型、全身敗血型、腦膜炎型和關(guān)節(jié)炎型。（1）化膿型鏈球菌化膿型鏈球菌是由E群鏈球菌感染引起，感染豬多表現(xiàn)全身組織器官的化膿，本類菌感染后一般在局部定植，免疫系統(tǒng)識(shí)別后，白細(xì)胞會(huì)通過趨化性向感染部位游走，特別是嗜中性白細(xì)胞，能將病原菌很快吞噬，同時(shí)自身也死亡裂解，化作膿細(xì)胞，引發(fā)膿腫。初期多見于下頜和咽喉部位的淋巴結(jié)，后期隨著病原的遷移會(huì)引發(fā)其他部位的膿腫。（2） 敗血型鏈球菌敗血型鏈球菌以C群獸疫鏈球菌發(fā)病最多，感染豬后會(huì)在感染部位先行增殖，數(shù)量達(dá)到一定程度后會(huì)隨血流到達(dá)全身，形成全身感染，之后不斷分泌毒素，毒素入血后對(duì)血細(xì)胞造成破壞作用，引發(fā)全身性貧血，同時(shí)病灶不斷擴(kuò)散，造成全身組織器官的病變。病豬表現(xiàn)突然發(fā)病，體溫上升到41?42C范圍內(nèi)，全身衰弱，精神萎靡，采食量下降，皮膚發(fā)紫伴有出血點(diǎn)，可視黏膜發(fā)紺，部分豬腹瀉，有的病豬表現(xiàn)呼吸急促，呈現(xiàn)腹式呼吸，黏液性鼻漏，常臥地不起，死亡率較高。（3） 腦膜炎型鏈球菌腦膜炎型鏈球菌感染通常由C群鏈球菌引起，多發(fā)于2月齡以內(nèi)的仔豬，鏈球菌能損傷血腦屏障，對(duì)腦組織神經(jīng)細(xì)胞造成破壞。病豬體溫升高，一般在40?42.5C，神經(jīng)癥狀明顯，全身顫抖，共濟(jì)失調(diào)，原地轉(zhuǎn)圈或倒走，有的嘴里出現(xiàn)不自主磨牙，猛力拍打背部病豬可蛙跳，后期出現(xiàn)四肢麻痹，無法行走，側(cè)躺于地，四肢作游泳樣動(dòng)作，最終死亡。（4）關(guān)節(jié)炎型鏈球菌 關(guān)節(jié)炎型鏈球菌對(duì)關(guān)節(jié)部位有特殊的親嗜性，特別是肘關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)，能對(duì)關(guān)節(jié)滑膜造成損害，并引發(fā)黏液分泌的減少，初期表現(xiàn)行走姿勢(shì)改變，跛行，后期關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)劇烈，局部腫大，行走困難，影響采食和飲水，體質(zhì)越來越弱，在豬群中的地位也越來越低，易受其他豬的攻擊，最終衰竭而死。臨床診斷病豬表現(xiàn)復(fù)雜，多種類型都并存。病豬精神沉郁，食欲廢絕，發(fā)燒、體溫在41C以上，怕冷，眼結(jié)膜潮紅，眼瞼水腫，流淚，鼻腔內(nèi)流出黏性和膿性分泌物.呼吸困難，皮膚發(fā)紅，耳朵、腹部、后肢內(nèi)側(cè)等處有紅色斑點(diǎn).有5頭病豬關(guān)節(jié)腫大，跛行，3頭豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，盲目轉(zhuǎn)圈，四肢運(yùn)動(dòng)失調(diào)，肌肉震顫，頭往后仰。有3頭豬后期并發(fā)腦炎癥狀，頸部強(qiáng)直、角弓反張，坐臥或癱臥姿態(tài)。有4頭豬類便拉稀，灰白色。病理變化剖檢病豬3頭，淋巴結(jié)腫大、充血，特別是頜下、咽部、頸部淋巴結(jié)病變明顯，關(guān)節(jié)可見淡黃色化膿性滲出物;漿膜有漿液性炎癥變化，腦膜炎病豬病變?yōu)槟X膜充血、出血，腦膜程度不同地有彌散性出血點(diǎn);心內(nèi)膜紅腫，心包積液:脾腫大，脾包膜上有纖維素沉著，表面和邊緣有梗死灶:肝瘀血腫大，膽汁黏稠，肺部充血腫脹，膨隆有大量出血點(diǎn)，并有膿樣小結(jié)節(jié)，間質(zhì)性肺炎，支氣管纖維素性炎癥，氣管內(nèi)有黏液性分泌物。實(shí)驗(yàn)室診斷根據(jù)流行特點(diǎn)、臨床診斷和病理剖解，以及以往流行病史，初步確定為鏈球菌。為進(jìn)一步確診，采集肺、心、肝、血液等病料，染色鏡檢，可見單個(gè)、成對(duì)、長(zhǎng)串鏈狀的革蘭氏陽性球菌，并進(jìn)行了細(xì)菌分離、培養(yǎng)鑒定和生化試驗(yàn)。為有針對(duì)性選擇藥物、進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。4.1染色鏡檢根據(jù)不同的病型采取不同的病料。敗血型病豬，無菌操作采集新鮮的病死豬的心、肝、脾、腎和肺等病料，1-2厘米見方大小，放入干凈自封袋或容器內(nèi)，無泄漏包裝，盡快冷藏運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。淋巴結(jié)膿腫型病豬，可用無菌注射器吸取未破潰的淋巴結(jié)膿腫內(nèi)的膿汁。腦膜炎型病豬，無菌采取腦脊髓液及少量腦組織。實(shí)驗(yàn)室診斷可用采集的病料直接涂片染色鏡檢，即用病豬的組織或血液或膿汁直接涂片，姬姆薩染色鏡檢：心血涂片可見單個(gè)或成對(duì)的圓或橢圓形球菌，有的形成短鏈,有的形成長(zhǎng)鏈。肝、脾或腦組織等臟器組織的觸片中，鏡檢可見以單球菌與雙球菌居多，短鏈較少。姬姆薩染色：涂片或觸片置于空氣中自然干燥后，滴數(shù)滴姬姆薩染色液于片上，經(jīng)1-2分鐘后，再加與染液等量的蒸餾水，使與染液混勻，5分鐘后用水沖洗，自然干燥后鏡檢。細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌采取疑似鏈球菌病死豬肝、腎或關(guān)節(jié)囊液（關(guān)節(jié)炎型）或化膿組織分別在鮮血瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng),37°C培養(yǎng)24小時(shí)。涂片，經(jīng)革蘭染色后鏡檢，可見紫色短鏈球形或卵圓型細(xì)菌，單個(gè)或成對(duì)排列，無芽孢，有的有莢膜。革蘭染色（1）涂片:在載玻片上滴一滴生理鹽水，然后左手拿平板右手持接種環(huán)，挑取當(dāng)個(gè)菌落涂片。（2）干燥:涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定:常用高溫進(jìn)行固定。即手持載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在燈的火焰外側(cè)快速來回移動(dòng)3~4次，共約3~4秒。要求玻片溫度不超過60C,以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷后染色。（4）染色：a.初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。b.媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。c.脫色：將載玻片上的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20-30秒，立即用水沖凈酒精。d.復(fù)染：用番紅液染1-2分鐘，水洗。e.鏡檢：干燥后，置油鏡觀察。生化鑒定以無菌操作將分離菌于生化糖發(fā)酵管做穿刺接種，37°C培養(yǎng)24~28h后觀察結(jié)果。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、水楊苷、精氨酸試驗(yàn)陽性，甘露醇、阿拉伯糖、菊糖、木糖、山梨糖、鼠李糖、肌醇、6.5%氯化鈉、淀粉、甘油試驗(yàn)陰性。與鏈球菌的生化特性相符，說明該分離菌為鏈球菌。ELISA法（1） 采樣方法采用前腔靜脈采血，采血部位位于左右兩側(cè)的頸靜脈與腋靜脈至第1對(duì)肋骨間的胸骨柄匯合處。首先對(duì)豬采血部位進(jìn)行剪毛，用5%碘酒消毒后再用75%的酒精消毒，待皮膚干燥后采血，整個(gè)采血過程均為無菌操作，采用未添加抗凝劑的普通采血管進(jìn)行采集。（2） 血清樣品制備對(duì)于采集好的血液，在環(huán)境溫度較高的采樣地區(qū)，靜置于室溫6?8h；在環(huán)境溫度較低的采樣地區(qū)，于37C培養(yǎng)6?8ho待血清析出后再于3000r/min離心5?10min,無菌操作將血清分離分裝于1.5mL已滅菌的離心管內(nèi)，-20C保存待檢。（3） 血清ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)準(zhǔn)備。分別將待檢血清和檢測(cè)試劑盒從冰箱內(nèi)取出置于室溫預(yù)熱待血清完全溶化后，用混樣儀將血清充分混合均勻。洗滌液和稀釋液按照檢測(cè)試劑盒說明書要求配好備用。加樣。根據(jù)樣本數(shù)量，取所需板條。每板設(shè)陰、陽性各2孔，分別加入陰、陽性對(duì)照血清100ML。其余孔加入99pL樣本稀釋液，設(shè)2孔為空白對(duì)照，加入已滅菌的超純水；其它為樣品孔加入1pL樣品。溫育。加樣后，蓋板膜，豬鏈球菌病檢測(cè)反應(yīng)板置于37C溫育30min。洗板。甩去孔內(nèi)液體，按照說明書要求設(shè)定好程序進(jìn)行洗滌。加酶。洗滌完成后，拍干凈孔內(nèi)剩余液體，每孔加酶標(biāo)記物100pL。溫育。檢測(cè)反應(yīng)板置于37C溫育30min。洗板。甩去孔內(nèi)液體，按照說明書要求設(shè)定好程序進(jìn)行洗滌。顯色。每孔加顯色劑A、B各50pL,振蕩混勻，檢測(cè)反應(yīng)板置于37C避光反應(yīng)15min。終止。顯色完成后，每孔加終止液50pL，充分振蕩混勻，終止后即讀數(shù)。讀數(shù)。豬鏈球菌病抗體檢測(cè)反應(yīng)板于450nm/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，讀取各孔吸光度值(OD值)。2.4結(jié)果判定根據(jù)試劑盒說明書判斷標(biāo)準(zhǔn)要求,當(dāng)樣品OD值±0.35時(shí)判為陽性，樣品OD值＜0.3時(shí)判為陰性，當(dāng)0.3W0D值V0.35時(shí)為可疑。溶血試驗(yàn)將菌落接種于5%兔鮮血平板，37°C培養(yǎng)24h后觀察。a溶血:細(xì)菌在血平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落周圍形成的狹小(l~2mm)、草綠色溶血環(huán)。a溶血環(huán)中的紅細(xì)胞未完全溶解?？尚纬蒩溶血環(huán)的細(xì)菌如甲型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌。B溶血:細(xì)菌在血平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落周圍形成的寬大(2~4mm)、界限分明、完全透明的溶血環(huán)。B溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解?？尚纬葿溶血環(huán)的細(xì)菌如乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等。Y溶血:就是不溶血。溶血試驗(yàn)可以進(jìn)一步確定鏈球菌的致病性強(qiáng)弱。4.6藥敏試驗(yàn)[1]將分離菌株大量接種于鮮血瓊脂平板上，用滅菌的鑷子夾取直徑為6mm浸有下列藥物的干燥濾紙片分別貼于平皿培養(yǎng)基的表面,各紙片中心相距約24mm,紙片距平皿邊緣約15mm,置37C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，分別測(cè)定抑菌環(huán)大小。判定標(biāo)準(zhǔn)為抑菌環(huán)直徑在15mm以上為高度敏感、10~15mm為中度敏感、10mm以下為低度敏感，無抑菌環(huán)為不敏感。PCR鑒定[2]DNA的提取從鮮血瓊脂平板上挑取鏈球菌單菌落接種于含5%新生牛血清的THB培養(yǎng)基，37'C搖床培養(yǎng)18-24h。取細(xì)菌培養(yǎng)物1.5mL于EP管中，12000rpm離心2min,濃縮菌液2-3次。沉淀用TE緩沖液567》L重懸，加10%SDS30uL和20mg/ml蛋白酶K35uL,混勻，37C水浴1h,加人5mol/LNaCl100uL充分混勻，再加人CTAB/NaCI溶液80uL混勻,65C水浴10min,加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),混勻，12000rpm離心5min,吸上清，轉(zhuǎn)移到新EP管中，加0.6體積的異丙醇，12000rpm離心10min,棄上清，沉淀用70%乙醇1mL洗兩次，棄上清，室溫放置使乙醇揮發(fā)干凈，加100uLddH20溶解沉淀，所得溶液即為DNA模板。PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為25uL:lOxPCRbuffer(含Mg2*)2.5uL,lOpMdNTP1|JL,模板1|JL,TaqDNA聚合酶0.25uL(1U),上下游引物(50umol/L)各0.5uL,加ddH2O定容至25uL.反應(yīng)條件為94C預(yù)變性5min;94C60s,52.5〃C60s,72C90s,30個(gè)循環(huán)，最后72C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物電泳50XTAE取10ml稀釋成500ml,取50ml溶解0.5g瓊脂糖。電爐上煮沸后加入EB5ul。另外450mlTAE倒入電泳槽中。用透明膠封閉電泳板，瓊脂糖溶液冷卻至溫?zé)釙r(shí)，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后，拔出梳子，放入電泳槽中。力口樣：PCRMarker：lulMarker+lulLoadingBuffer+4ulTAE混勻于塑料膜上，加入孔中。PCR樣品：5ul樣品DNA+lulLoadingBuffer混勻后依次加入孔中。接上電源，電壓120V，電流50mA進(jìn)行電泳。電泳約1小時(shí)后，紫外燈檢測(cè)。4.6多重PCR反應(yīng)[2]參考上述PCR反應(yīng)體系中PCRbuffer(含Mg2+)、TaqDNA聚合酶的用量，將dNTP和模板的量適當(dāng)提高，重點(diǎn)優(yōu)化3種引物之間的比例和退火溫度。先建立并優(yōu)化單個(gè)靶基因PCR檢測(cè)體系，繼而進(jìn)行多重PCR體系組合和條件優(yōu)化。固定EF引物的用量，改變另外兩引物的比例。優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系為：10xPCRbuffer(含Mg"*)5uL,2.5mmol/LdNTP3uL,10umol/L上下游引物Sly0.6uL,MRP、EFL|物各1.0uL,DNA模板1.5pL,TaqDNA聚合酶0.25uL(1U),加ddH2O定容至50uL.擴(kuò)增參數(shù)：94C預(yù)變性5min,94C50s,50.3C60s,72C90s,35個(gè)循環(huán)，最后72C延伸10min.此條件下，三種毒力基因均可獲得有效特異的擴(kuò)增。治療對(duì)于敗血型的豬鏈球菌病病豬，采用藥物進(jìn)行治療，藥物選擇3X104U的青霉素、30mg磺胺類,2次/d，連續(xù)治療4d；對(duì)于關(guān)節(jié)炎型豬鏈球菌病病豬，將青霉素、慶大霉素和適量的氨基比林加以混合之后注射，2次/d；對(duì)于腦膜炎型病豬，用磺胺類藥物進(jìn)行治療，同時(shí)給予強(qiáng)心和補(bǔ)液；對(duì)于重癥的病豬，可靜脈注射生理鹽水、葡萄糖和VC,1次/d，連續(xù)治療3d。在初次注射時(shí)，可以適當(dāng)增加劑量，待病豬病情好轉(zhuǎn)之后再將劑量減少。對(duì)于新生的仔豬，用小諾霉素與柴胡混合藥物進(jìn)行注射治療；若仔豬存在神經(jīng)癥狀，按照1：1的比例利用等滲鹽水將增效磺胺鈉稀釋后注射;若病豬處于剛剛斷奶的階段，可用氯丙嗪或者恩諾沙星和柴胡的混合藥物進(jìn)行注射治療［3］。預(yù)防措施隔離病豬治療、對(duì)疑是患病豬也進(jìn)行隔離治療。淘汰治不好的染病豬。對(duì)病死豬進(jìn)行深埋、發(fā)酵、焚燒等無害化處理”。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，降低飼養(yǎng)密度，保證飼料和飲水的質(zhì)量。飼料要做到不發(fā)霉，飲水要做到清潔。改善飼養(yǎng)環(huán)境加強(qiáng)豬舍內(nèi)通風(fēng)換氣保持舍內(nèi)環(huán)境溫溫度在豬只適宜范圍之內(nèi)。及時(shí)清除積糞和打掃圈舍，保持圈舍地面的干凈。并定期進(jìn)行驅(qū)蟲、滅蚊。滅鼠的工作。清除養(yǎng)豬環(huán)境中易引起損傷的因素如針頭、碎玻璃、鐵片等。減少對(duì)豬的各類應(yīng)激。清除傳染源。對(duì)患病豬舍加強(qiáng)消毒工作，用衛(wèi)可，百勝進(jìn)行消毒。對(duì)于發(fā)病期間豬所使用的食槽及飼養(yǎng)管理用具以及病豬和帶菌豬的排泄物、分泌物進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，切斷病毒的傳播途徑，防止病毒的進(jìn)一步傳染與擴(kuò)散。藥物預(yù)防?？稍陲暳现羞m當(dāng)添加一些抗菌素藥物，如青霉素、氯霉素、紅霉素、磺胺類和頭孢類藥物。加強(qiáng)檢疫監(jiān)督，嚴(yán)格引種。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和“全進(jìn)全出”的飼養(yǎng)方式。完善繁育體系，建立良種繁殖場(chǎng)，解決豬源不足問題。若必須引種-定要從正規(guī)的種豬場(chǎng)引種，并經(jīng)檢疫合格后方可引進(jìn)?？茖W(xué)的免疫程序，種豬在60日齡首次免疫接種豬鏈球菌病氫氧化鋁膠苗以后每年春秋各免疫1次，不論大小豬一律機(jī)內(nèi)成皮下注制5mL/(kg體重),濃縮菌苗注射3mL/(kg體重)，注射后21d產(chǎn)生免疫力，免疫期約6個(gè)月或選用鏈