第9章 生物芯片

第九章生物芯片biochip2/1/2023海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss12/1/202322/1/202332/1/202342/1/20235何為生物芯片？生物芯片是通過(guò)平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快捷、大信息量的檢測(cè)。生物芯片包括2/1/20236生物芯片的分類

2/1/20237根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。2/1/20238生物芯片分析過(guò)程試樣處理點(diǎn)陣固定反應(yīng)或雜交芯片制作標(biāo)記洗滌檢測(cè)掃描光刻合成微量點(diǎn)樣噴墨純化、標(biāo)記光化學(xué)檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè)計(jì)算處理2/1/20239內(nèi)容提要第一節(jié) 基因芯片第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片第三節(jié) 芯片實(shí)驗(yàn)室2/1/202310基因芯片技術(shù)的概念基因芯片(Genechip)技術(shù)是指通過(guò)微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面研究的最新革命性技術(shù)。基因芯片又稱DNA芯片。第一節(jié)基因芯片2/1/202311基因研究的前沿技術(shù)-----基因芯片技術(shù)測(cè)序類基因芯片類PCR類2/1/202312基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray2/1/202313DNA芯片的主要類型按制備方式分：原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術(shù)在特定部位原位合成寡核苷酸(ONA)而制備的芯片。合成的序列較短cDNA微集陣列：將通過(guò)mRNA制備的（cDNA)片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片(CDA)。固定基因的來(lái)源較靈活2/1/202314按探針?lè)诸悾篋NA芯片寡核苷酸陣列（芯片）基因組芯片cDNA芯片2/1/202315一、基本原理基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southern

、northern）相似。核酸印跡：將待測(cè)樣品DNA（靶基因）固定于支持物上，用已知序列DNA片段制作探針，二者按堿基互補(bǔ)配對(duì)原理雜交，檢測(cè)出欲鑒定的基因?；蛐酒簩⒋罅恳阎蚱危ㄅc核酸印跡相反）以微陣列方式固定在支持物上，待測(cè)樣品用熒光染料標(biāo)記制成探針，當(dāng)探針與芯片上的靶基因雜交后，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析?；蛐酒谝晃⑿〉幕砻婕闪舜罅康腄NA分子，能夠在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因，進(jìn)行大信息量的篩選與檢測(cè)分析。2/1/202316二、基因芯片的制作DNA芯片技術(shù)流程圖芯片制作樣品的制備顯微光蝕刻壓電打印分子打印原位合成芯片固定基因設(shè)計(jì)與制備支持物預(yù)處理打印固化DNA微集陣列樣品核酸的提取與純化擴(kuò)增與標(biāo)記標(biāo)記樣品的純化雜交及雜交后清洗掃描與分析2/1/202317基因芯片技術(shù)流程

1.芯片制備-目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機(jī)器人技術(shù)。以便能快速、準(zhǔn)確地將探針?lè)胖玫叫酒系闹付ㄎ恢谩?/p>

2.樣品制備-生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時(shí)樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。2/1/202318

3.雜交反應(yīng)-雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的DNA片段進(jìn)行的反應(yīng),產(chǎn)生一系列信息的過(guò)程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配率。

4.信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析-雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過(guò)芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。2/1/202319基因芯片的基本要素固相介質(zhì)有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龍膜、塑料等。靶片段

DNA、寡核苷酸、RNA等。探針

mRNA，或是以mRNA為模板合成的cDNA。標(biāo)記物常采用熒光劑，如Cy3、Cy5，

同位素、地高辛等。2/1/202320

1.支持物的預(yù)處理（略）

2.制作DNA芯片(1)原位合成芯片的制備

A.光引導(dǎo)原位聚合技術(shù)：支持物表面活性基團(tuán)連接有光敏保護(hù)基團(tuán)（X）受到保護(hù)。

優(yōu)點(diǎn)：合成效率高，點(diǎn)陣密度高；

缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)率低。(一)芯片的制備2/1/202321原位合成(InSituSynthesis)2/1/202322B.壓電打印法：壓電毛細(xì)管噴射器

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備廉價(jià)，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)產(chǎn)率高。

缺點(diǎn)：點(diǎn)陣密度低，易產(chǎn)生交叉污染。2/1/202323(2)DNA微集陣列的制備方式：預(yù)先合成寡聚核苷酸、cDNA或DNA基因組通過(guò)高速點(diǎn)樣打印到芯片上。A.DNA片段的制備已克隆的基因片段PCR，RT-PCR擴(kuò)增的基因片段人工合成的DNA片段單鏈、雙鏈、DNA或RNA均可2/1/202324B.打印噴墨打?。ǚ墙佑|式點(diǎn)樣）優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)針式打?。ń佑|式點(diǎn)樣）優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)2/1/202325點(diǎn)陣芯片的制作技術(shù)2/1/202326DNA點(diǎn)陣芯片2/1/202327C.固化打印DNA片段后，需要將其固定在支持物表面，同時(shí)也要封閉支持物上未打印區(qū)域以防止核酸樣品的非特異性固定。2/1/202328(二)測(cè)定樣品的準(zhǔn)備1.樣品的分離純化DNA,mRNA2.擴(kuò)增PCR,RT—PCR，固相PCR3.標(biāo)記等過(guò)程熒光標(biāo)記（常用Cy3、Cy5），生物素,放射性標(biāo)記4.標(biāo)記后樣品的純化2/1/20232916economicalandsensitiviefluorescentdyealternativesscannedwithScanArray5000.多種熒光染料2/1/202330(三)分子雜交樣品與DNA芯片上的陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成；可同時(shí)平行檢測(cè)許多基因序列。影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)2/1/202331芯

片

合

成

程

序2/1/202332(四)檢測(cè)分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號(hào)軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理2/1/202333芯片信息采集：熒光標(biāo)記雙波長(zhǎng)掃描激光激發(fā)光源共聚焦掃描計(jì)算機(jī)處理2/1/202334ScanArray

Lite

2/1/202335三、DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用2/1/2023海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss36（一）應(yīng)用之一：基因表達(dá)譜（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation紅色上調(diào)黃色不變綠色下調(diào)2/1/202337基因表達(dá)譜芯片應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也最成熟。這種芯片可以檢測(cè)整個(gè)基因組范圍的眾多基因在mRNA表達(dá)水平的變化。它能對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析。從而對(duì)基因群在個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進(jìn)行描述。2/1/202338進(jìn)一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關(guān)系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并從已知生物學(xué)功能的基因推論未報(bào)道基因的生物學(xué)意義。同時(shí)，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達(dá)譜芯片的研究。2/1/202339應(yīng)用舉例：檢測(cè)人正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中差別表達(dá)的基因?qū)?096條人cDNA制備成表達(dá)芯片。（1500條為已知基因，2548未知，16個(gè)陰性對(duì)照基因，32個(gè)空白點(diǎn)。）提取人正常肝和肝癌組織mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將Cy3和Cy5熒光分別標(biāo)記到兩種來(lái)源的cDNA。與芯片雜交、掃描。計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理，判斷差別表達(dá)的基因。標(biāo)準(zhǔn)：1、Cy3與Cy5表達(dá)差別>2。

2、Cy3或Cy5信號(hào)值>1000。2/1/202340（二）DNA測(cè)序：雜交測(cè)序（SBH）TCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGACTTAGCCTAGCTGAA65536個(gè)八核苷酸陣列2/1/202341生物芯片能為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供強(qiáng)有力的手段，促進(jìn)醫(yī)學(xué)從“系統(tǒng)、血管、組織和細(xì)胞層次”(通常稱之為“第二階段醫(yī)學(xué)”)向“DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其相互作用層次”(第三階段醫(yī)學(xué))過(guò)渡，使之快速進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用。（三）臨床診斷2/1/202342（四）基因診斷：尋找和檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測(cè)致病基因的表達(dá)（五）藥物研究與開(kāi)發(fā)：

1.藥物篩選

2.合理用藥

3.中草藥鑒定（六）癌癥研究2/1/202343基因芯片的優(yōu)點(diǎn)：高通量大規(guī)模高度平行性快速高效高靈敏度高度自動(dòng)化2/1/202344基因芯片的缺點(diǎn)

基因芯片的缺點(diǎn)在于其不能對(duì)待檢測(cè)基因在多細(xì)胞類型組織中的精確定位進(jìn)行判斷。另外很多蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其功能不主要是依賴其是否表達(dá)或表達(dá)量高低，而是依賴蛋白質(zhì)磷酸化-去磷酸化等方式。在這種情況下，用核酸類生物芯片就沒(méi)有什么意義了，正在研究開(kāi)發(fā)中的蛋白類芯片可能會(huì)有所作為的。

2/1/202345內(nèi)容提要第一節(jié) 基因芯片第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片第三節(jié) 芯片實(shí)驗(yàn)室2/1/202346固定于載體上的蛋白質(zhì)樣品（靶蛋白）以陣列方式構(gòu)成，待測(cè)樣品用熒光染料或同位素標(biāo)記制備成探針與芯片雜交，雜交信號(hào)用激光掃描儀或放射自顯影檢測(cè)及計(jì)算機(jī)分析檢測(cè)結(jié)果。蛋白質(zhì)芯片適合于蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－核酸（DNA、RNA）、蛋白質(zhì)－小分子之間的相互作用分析；適合功能基因組、蛋白組研究。第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片2/1/202347一、蛋白質(zhì)芯片特點(diǎn)蛋白質(zhì)不能用擴(kuò)增方法提高拷貝數(shù)來(lái)達(dá)到要求的靈敏度；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的特異作用主要是抗原－抗體或配體－受體的反應(yīng)；反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是專一性，而非序列的特異性。2/1/202348二、蛋白組研究動(dòng)態(tài)雙向電泳蛋白質(zhì)芯片雙鏈DNA芯片與相關(guān)蛋白質(zhì)的作用2/1/202349三、制備蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子以共價(jià)結(jié)合方式固定于玻片固定封阻醛基化（適合蛋白質(zhì)分子）共價(jià)結(jié)合法：BSA-羥基琥珀酰化（適合多肽、小分子蛋白）2/1/202350四、制備蛋白質(zhì)探針待測(cè)蛋白質(zhì)樣品經(jīng)熒光染料、生物素等標(biāo)記，制成探針。熒光染料：熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等；生物素標(biāo)記：偶聯(lián)法標(biāo)記抗體、標(biāo)記蛋白質(zhì)；金標(biāo)記：以金粒的電子密度大的特點(diǎn)，與抗體偶聯(lián)，經(jīng)特異性的反應(yīng)，通過(guò)電子顯微鏡觀察膠體金顆粒，顯示細(xì)胞、組織反應(yīng)的實(shí)質(zhì)即部位。2/1/202351五、蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用1.蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)圖譜；2.酶－底物相互作用，分析酶的化學(xué)及酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；3.分析基因表達(dá)與篩選抗體；4.建立蛋白質(zhì)譜，診斷疾病，直接采患者的血清或體液進(jìn)行快速診斷。2/1/202352雙鏈DNA芯片與相關(guān)蛋白質(zhì)的作用DNA的轉(zhuǎn)錄的起始或終止都與