第41章基因工程及蛋白質(zhì)工程12

第41章基因工程及蛋白質(zhì)工程Chapter41.GeneandProteinEngineering1第一節(jié)概述基因工程（geneengineering）:是對(duì)攜帶遺傳信息的分子進(jìn)行施工的分子工程，包括基因重組、克隆和表達(dá)?；蚬こ踢@個(gè)術(shù)語(yǔ)既可用來(lái)表示特定的基因施工項(xiàng)目，也可泛指它所涉及的技術(shù)體系，其核心是構(gòu)建重組體DNA的技術(shù)，因此基因工程和重組體DNA技術(shù)(DNArecombination)有時(shí)也就成為同義詞。

蛋白質(zhì)工程（proteinengineering):是在基因工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。是指通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)已知結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，利用基因定位誘變等技術(shù)改造蛋白質(zhì)，以達(dá)到改進(jìn)其某些性能的目的。21972年美國(guó)斯坦福大學(xué)的Berg和他的同事將λ噬菌體基因和大腸桿菌乳糖操縱子插入猴病毒SV40DNA中，首次構(gòu)建出DNA的重組體。1973年，Cohen和Boyer獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落，標(biāo)志著基因工程的誕生。EcoRIDNALigaseTetracyclinepSC101Kanamycin

R6-5KanrandTetr3

技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)

限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)（標(biāo)志著DNA重組時(shí)代的開(kāi)始）。載體的使用。逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)。4

第二節(jié)工具酶

DNA分子的剪切、重組、合成及修飾涉及一系列酶促反應(yīng)，催化這些反應(yīng)的酶是基因操作的基本工具，故又稱為工具酶。工具酶在基因克隆中占有非常重要的地位，只有了解其作用機(jī)制后，才能加以靈活應(yīng)用。5

用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶反轉(zhuǎn)錄酶6一、限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)又稱限制性內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱為限制酶。這類酶能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并且裂解磷酸二酯鏈。主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵。1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII。7（一)限制酶的命名和分類1.限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名Haemophilus

influenzae

d

（嗜血流感桿菌d株）HindII

HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶82.限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型

III型蛋白結(jié)構(gòu)限制修飾輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)雙功能異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCT（EcoB）AACN6GTGC（EcoC）距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割單功能同源二聚體Mg2+旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列

識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割雙功能異源二聚體ATPMg2+SAMGAGCCCAGCAG距識(shí)別序列下游24-26bp處9（二)II型限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性:識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列,大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè),識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)(palindrome).EcoRI的切割位點(diǎn)EcoRI的識(shí)別序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’10中英聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端(Stickyend)退火4-7℃3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’POH5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’HOPEcoRI37℃3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’11PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’POHHOP12PvuII等產(chǎn)生的平頭末端(blundend)5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’13

現(xiàn)巳提純供商品用的限制酶有400余種，其中常用者列舉于表下表14

使用限制酶時(shí)應(yīng)注意提供適宜的反應(yīng)條件，如DNA底物的純度、濃度、分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型、緩沖液的PH及離子強(qiáng)度等。如果反應(yīng)體系不能滿足最適條件，則可能導(dǎo)致酶產(chǎn)生第二活性，又稱星活性(staractivity)，即限制酶嚴(yán)格的識(shí)別特異性降低，導(dǎo)致其在DNA分子內(nèi)產(chǎn)生附加切割。如EcoRI，當(dāng)反應(yīng)條件改變時(shí)，其特異性可由原來(lái)6bp的GAATTC降為4bp的AATT，一般用EcoRI＊表示，稱為EcoRI的星活性。15

由不同微生物分離得到的限制酶，如果識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)完全一樣，稱為同裂酶（isoschizomers）；如僅僅是粘性末端突出的單鏈相同，稱為同尾酶（isocaudamers）。由同尾酶切割的限制片段彼此相連，不能再被原來(lái)的限制酶切割。例如，BamHI限制片段與BglII的限制片段相連后，其序列變?yōu)?，與原來(lái)兩個(gè)限制酶的識(shí)別序列均不相同，因此不再為原來(lái)的酶所切割。同裂酶、同尾酶16同裂酶GCCTAGGATCTA5'-3'--3'-5'GCCTAGGATCCGGATCCTAG5'-3'--3'-5'BamHI

BglII5'-A3'-TT-3'A-5'同尾酶17二.DNA連接酶

DNA連接酶(DNALigase)的作用是催化DNA片段之間的5’磷酸基和3’羧基間形成3’，5’-磷酸二酯鍵，主要用于連接兩個(gè)獨(dú)立的DNA片段或修復(fù)雙鏈DNA中一條鏈上的切口?，F(xiàn)常用的有：

T4DNA連接酶：粘性末端、平頭末端，需ATP

大腸桿菌DNA連接酶：只能連接粘性末端，需NAD+。18OHPOHP修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’19連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’20三、DNA聚合酶

基因克隆中常用的DNA聚合酶(DNApolymerase)：大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）K1enow片段T4DNA聚合酶。1.大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）

大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：5‘→3‘的DNA聚合酶活性

5‘→3‘的核酸外切酶活性

3‘→5‘的核酸外切酶活性

21由于它具有5’→3’核酸外切酶活性，當(dāng)用缺口平移法(nicktranslation)標(biāo)記DNA探針時(shí)，常用DNA聚合酶I。DNApolIMg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）DNaseI5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

222.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。23Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列24Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’25Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記Klenowa-32P-pppdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’263.T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位27T4-DNA聚合酶的基本用途I：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多28T4-DNA聚合酶的基本用途II：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApol5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolMg2+5‘pppdN5‘ppp

dA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T

3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘29四、反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶，AMV、M-MuLV）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP303’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’5’

DNA3’反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶31大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）五、核酸酶ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’32ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘-OH端外切，并且優(yōu)先切3‘凹陷端。雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）33lExo3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外切酶特異性地從5‘端外切34單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶來(lái)自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或

RNA（雙鏈中的單鏈區(qū)）35DNAmRNA雜交S1EcoRIS1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）36Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶來(lái)自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）37EcoRIACEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化ACBal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA缺失突變B38TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAOH3‘p5‘六、核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）來(lái)自小牛胸腺5‘p3‘HOOH3‘p5‘不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs395‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘AAAAAAAAAAA405‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON堿性磷酸單酯酶來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）415‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷用于探針的末端同位素標(biāo)記：42第三節(jié)載體

用來(lái)插人外源DNA片段構(gòu)建重組DNA分子，并能將外源DNA攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA稱作基因克隆裁體，簡(jiǎn)稱為載體(vector)。載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件43載體應(yīng)具備的條件具有自主復(fù)制的能力

攜帶易于篩選的選擇標(biāo)記含有多種限制酶的單一識(shí)別序列，以供外源基因插入除保留必要序列外，載體應(yīng)盡可能小，便于導(dǎo)入細(xì)胞和進(jìn)行繁殖使用安全

44一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒（plasmid)是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA.質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1～300kb45

拷貝數(shù)的控制機(jī)制-保持恒定的拷貝數(shù)

野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因物質(zhì)抗性:抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物

物質(zhì)合成:抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿

這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義462.常用的質(zhì)粒載體pBR322：①分子量較小，4.3kb，能克隆較大外源DNA；②具有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗生素的抗性基因；③在兩種抗生素抗性基因中間存在限制酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選④具有較高的拷貝數(shù)，這為重組DNA的制備提供了極大方便。47pUC18/19：

pUC質(zhì)粒載體是在pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’端帶有一段多克隆位點(diǎn)的1acZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。①來(lái)自于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)(ori)；②氨芐青霉素抗性基因(Ampr)；③大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因1acZ’的啟動(dòng)子及其編碼。a-肽鏈的DNA序列；④位于lacz’基因中的靠近5’端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段；48PlaclacZ’MCSawX-galpUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷b-半乳糖苷酶的a-肽段49二、噬菌體載體1.大腸桿菌的l噬菌體（lphage)l噬菌體是一種大腸桿菌噬菌體，由頭、尾兩部分組成。頭部呈六角型，裝載了噬菌體的整個(gè)基因組(即lDNA)。lDNA為雙鏈線狀分子，長(zhǎng)約48.5kb，在分子兩端各有12bp的互補(bǔ)單鏈(是天然的粘性末端)，稱cos位點(diǎn)。當(dāng)噬菌體吸附于宿主細(xì)胞膜后，lDNA自噬菌體的尾部注入宿主細(xì)胞，其兩個(gè)粘性末端互相結(jié)合，既可以裂解性生長(zhǎng)，也可以溶解性生長(zhǎng)。DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)502.l噬菌體載體

野生型l-DNA包裝的包裝范圍為原來(lái)DNA的75-105%，即36-51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，野生型噬菌體經(jīng)突變和缺失等手段改造，已衍生出上百種克隆載體。

衍生載體有插入型載體和置換型載體。

A．插入型載體

將野生型l噬菌體的lDNA中多余限制酶切位點(diǎn)刪除，使其中心僅留有幾個(gè)單一酶切位點(diǎn)。這樣經(jīng)限制酶切割的lDNA便能夠與經(jīng)同樣限制酶消化的外源DNA片段結(jié)合，使之插入在這個(gè)位點(diǎn)上，而不導(dǎo)致噬茵體功能的喪失。51體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度

37kb插入片段大?。?-14kb插入型載體

當(dāng)插入的cDNA閱讀框與1acZ基因相一致時(shí)，能產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，可以用免疫學(xué)方法，如蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。此外，因外源基因插入使1acZ基因失活，故在含x-gal培養(yǎng)基中形成白斑，而未重組的形成藍(lán)色斑點(diǎn)，便于區(qū)分篩選。插入型載體有：Charon2、Charon6、lgt11等。52B.置換型載體

lDNA中心區(qū)段是一些非必需序列，將該區(qū)段刪除并替換上一個(gè)兩側(cè)多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列的外源DNA片段，即可建成置換型克隆載體。當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之間的DNA片段即會(huì)被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。載體有：lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40等。插入片段最小裝載長(zhǎng)度

10kb載體長(zhǎng)度

26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度

25kb體外包裝體外包裝533.M13噬菌體M13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)

M13

DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子54+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNA感染周期55

M13噬菌體的最大優(yōu)點(diǎn)是噬菌體顆粒中所含的是單鏈DNA，可作為模版用于DNA序列分析。

另外，利用單鏈M13克隆可制備成單鏈DNA探針，用于檢測(cè)DNA或RNA的雜交分析。

也可以用作基因定位誘變的載體。噬菌體成熟后分泌出細(xì)胞，可以從細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中獲得噬菌體，制備單鏈?zhǔn)删wDNA。雙鏈?zhǔn)删wDNA可通過(guò)裂解細(xì)胞進(jìn)行制備。

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb56pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI

考斯質(zhì)粒（黏粒）是一類人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。1978年Collins和Hohn發(fā)明。1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段。裝載范圍為31-45kb。其本身分子較小，如pHC79僅6.4kb。由于非重組體質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而體外包裝的主要是重組體，有利于以后的篩選。4.考斯質(zhì)粒（cosmid）57

三、表達(dá)載體

表達(dá)載體(expressionvector)是用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。這類載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件-轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。表達(dá)載體包括原核細(xì)胞表達(dá)載體,真核細(xì)胞表達(dá)載體（昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物表達(dá)載體）。581.原核細(xì)胞表達(dá)載體-大腸桿菌表達(dá)載體

一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體應(yīng)具備克隆載體所具備的特性。選擇標(biāo)記的抗菌素抗性基因復(fù)制起始點(diǎn)克隆位點(diǎn)等此外，還應(yīng)含有表達(dá)系統(tǒng)元件即啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)終止子59大腸桿菌表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)特征60

啟動(dòng)子trp一1ac啟動(dòng)子又稱為tac啟動(dòng)子，是一個(gè)雙啟動(dòng)子或稱雜合啟動(dòng)子，由trp啟動(dòng)子加上1ac操縱子中的操縱基因、SD順序融合而成。整個(gè)tac啟動(dòng)子受1ac阻抑物調(diào)控，在1ac阻抑物高水平表達(dá)的lacIq大腸桿菌菌株中，其轉(zhuǎn)錄可被抑制，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)其表達(dá)。

l噬菌體PL啟動(dòng)子是一種溫度誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，受控于溫度敏感的阻抑物。在低溫下(37℃)可以阻抑PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但在高溫下(42℃)則失去阻抑作用。含PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體需轉(zhuǎn)化到M5219茵株中才能調(diào)控表達(dá)。61

T7噬菌體啟動(dòng)子是一個(gè)表達(dá)效率很高的啟動(dòng)子，但需要特殊的受體菌，如JMl09(DE3)等。核糖體結(jié)合位點(diǎn)

mRNA在細(xì)菌中的翻譯效率依賴于是否有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomeBidingSite，RBS)的存在。RBS包括起始密碼(ATG)和SD序列。SD(Shine-Dalgarno)序列,富含嘌呤核苷酸，16SrRNA3‘-末端富嘧啶的序列互補(bǔ)，mRNA于是與核糖體很好結(jié)合。

終止子

一個(gè)基因3’-末端的能被RNA聚合酶識(shí)別并停止轉(zhuǎn)錄的DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子。原核生物終止子序列有一段富含A／T的區(qū)域和一段富含G／C的區(qū)域，富含G／C區(qū)域具有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)。這種終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。622.真核細(xì)胞表達(dá)載體-哺乳動(dòng)物表達(dá)載體

克隆基因要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，必須將基因重組到適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體中。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有必不可少的原核序列，如在大腸桿菌中能起作用的復(fù)制起始位點(diǎn)以及便于篩選重組質(zhì)粒的抗生素抗性基因等，還含有在真核細(xì)胞中工作的遺傳元件，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列以及加多聚腺苷酸的信號(hào)序列等。63增強(qiáng)子一啟動(dòng)子

有些來(lái)源于動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子能被真核細(xì)胞識(shí)別。如SV40病毒早期基因增強(qiáng)子(SV40)、Rouse肉瘤病毒基因組長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Rsv)、人類原細(xì)胞病毒(heMV）等。轉(zhuǎn)錄終止和加poly(A)信號(hào)一是位點(diǎn)下游的GU富集區(qū)，二是Po1y(A)加尾信號(hào)：AAUAAA。64

第四節(jié)基因克隆的基本程序

基因克隆的基本程序包括五大步驟：①制備目的基因;②連接目的基因與裁體形成重組體;③將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；④重組體的篩選和鑒定；⑤重組體的擴(kuò)增和表達(dá)。65目的基因是指要克隆或表達(dá)的基因目的基因可以有如下幾種來(lái)源和制備方法：1．從基因文庫(kù)中篩選：將某一種基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G-文庫(kù)(genomicDNAlibrary)。將某種細(xì)胞的全部mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(kù)(cDNAlibrary)。C-文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。

一、目的基因的制備66

基因組文庫(kù)分離、純化基因組DNA

條件：溫和，在EDTA或SDS等存在下

↓RE

用蛋白酶K消化細(xì)胞、酚抽提大小不同酶切片段

片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離

↓分別與同樣RE消化的載體連接

常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體

↓

DNA連接酶連接。

導(dǎo)入細(xì)胞

進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增。

↓篩選鑒定

用分子雜交、凝膠電泳等方法鑒定。67cDNA文庫(kù)（1）合成cDNA第一條鏈反應(yīng)體系只有mRNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、4種dNTP、引物。引物是與mRNA3ˊ端polyA互補(bǔ)的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二條鏈

RNase去掉模板mRNA（3）構(gòu)建cDNA文庫(kù)①cDNA兩端加接頭②cDNA與載體相連。③導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，這些菌體內(nèi)保存cDNA集合體便是cDNA文庫(kù)。683.利用PCR合成：

如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。694.人工合成：

根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。

二、目的基因與載體重組

目的基因片段與適當(dāng)?shù)妮d體經(jīng)限制酶剪切后，再在DNA連接酶的催化下即可相互連接，形成人工重組體。常用體外重組方法主要有以下四種。70粘性末端連接法：當(dāng)載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過(guò)粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。71722.同聚物加尾連接法:當(dāng)載體和目的基因無(wú)法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無(wú)法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3‘-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過(guò)堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由DNA連接酶連接。733.人工接頭連接法：

將人工接頭（linker),即一段含有多種限制酶切點(diǎn)的DNA片段,連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。744.平端連接法：

利用T4DNA連接酶可催化連接相同或不同限制酶切割的平端dsDNA。75

在基因克隆技術(shù)中，將質(zhì)粒DNA及其重組體導(dǎo)入細(xì)菌稱為轉(zhuǎn)化(transformation)；將病毒及其重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染(transfection)；將噬菌體及其重組體才入宿主細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。

三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞76

將受體菌懸浮在低溫0℃和低滲CaCl2溶液中，菌菌體細(xì)胞壁通透性增加、膨脹成球形，易于吸收外源DNA，這種狀態(tài)的菌稱謂感受態(tài)菌（competant)。

1.氯化鈣法77

電穿孔法（electroporation)最早用于DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，現(xiàn)已用于大腸桿菌和其他細(xì)菌。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌與外源DNA混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下，細(xì)胞壁出現(xiàn)許多小孔，外源DNA即可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)化應(yīng)在0℃～4℃進(jìn)行。該法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需制備感受態(tài)細(xì)胞，故操作較氯化鈣法簡(jiǎn)單，其轉(zhuǎn)化率也比較高，可獲得108～109轉(zhuǎn)化子／mgDNA。其缺點(diǎn)是需特殊儀器。2.電穿孔法78

近年相繼發(fā)展了系列廣譜和高效的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一類雙層的微囊結(jié)構(gòu)，如DOSPER和infectAMINETM，含有一個(gè)親水性正電荷的精胺基團(tuán)頭和疏水性脂酸尾，可與DNA分子結(jié)合成脂質(zhì)體／多核苷酸復(fù)合物，使DNA免受DNase的降解，精胺基團(tuán)可與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面非特異吸附，易于通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率最高，轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型廣泛。其缺點(diǎn)是脂質(zhì)體價(jià)格昂貴。3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法79

顯微注射法是在顯微鏡下，經(jīng)細(xì)胞玻璃針將外源DNA直接注入細(xì)胞。該方法是將DNA準(zhǔn)確注入細(xì)胞核中最可靠的方法，特別是借助于電腦技術(shù)更為精確快速。該法適用于多種貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞及懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞.其缺點(diǎn)是儀器昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作技巧和熟練程度的要求比較高。4.顯微注射法80根瘤土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti質(zhì)粒（tumer-inducingplasmid）有一段T-DNA，即轉(zhuǎn)移DNA，能攜帶基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)并整合到染色體DNA中。因此Ti質(zhì)粒是目前植物基因工程最常見(jiàn)的基因載體。將外源基因插入Ti質(zhì)粒載體的T-DNA

，借助土壤桿菌而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞。

5.根瘤土壤桿菌法81

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。6.基因槍法82四、重組體的篩選和鑒定

由于重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的比例通常較低，因此需要對(duì)含有重組體的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選并作鑒定?？刹捎靡韵路椒ㄟM(jìn)行：

1.根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選：對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。還可以根據(jù)b-乳糖苷酶a-互補(bǔ)(alphacomplemention)的顏色反應(yīng)進(jìn)行篩選。83842.根據(jù)標(biāo)志互補(bǔ)進(jìn)行篩選：

當(dāng)宿主細(xì)胞存在某種基因及其表達(dá)產(chǎn)物的缺陷時(shí)，可采用此方法篩選重組體。即在載體DNA分子中插入相應(yīng)的缺陷基因，如宿主細(xì)胞重新獲得缺陷基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說(shuō)明該細(xì)胞中帶有重組體。組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體853.根據(jù)DNA限制酶譜進(jìn)行分析：

經(jīng)過(guò)粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)行限制酶譜分析進(jìn)一步鑒定。將單一細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后分別提取其DNA，用重組時(shí)所用的同一限制酶進(jìn)行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進(jìn)行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。864.用核酸雜交法進(jìn)行分析鑒定：為了進(jìn)一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補(bǔ)的DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽(yáng)性，即可確定重組體中帶目的基因。875.PCR篩選法:一些載體克隆位點(diǎn)外源DNA插入點(diǎn)兩側(cè)存在可作為PCR引物的已知序列，如pGEM載體系列的多克隆位點(diǎn)(MCS)兩側(cè)為SP6、T7，對(duì)抽提出的重組DNA進(jìn)行PCR分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA序列測(cè)定。6.免疫化學(xué)等方法:如果外源基因能夠在宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，合成外源蛋白質(zhì)．可以采用免疫化學(xué)等方法檢測(cè)，即用已知的抗體來(lái)檢測(cè)目的基因編碼的抗原。88第五節(jié)真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)被表達(dá)的基因和表達(dá)基因所用的系統(tǒng)可將表達(dá)分為四種：①原核基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)；②真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)；③原核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)；④真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。89一、真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的基本條件

①真核細(xì)胞的目的基因必須來(lái)自于cDNA；

②真核基因mRNA缺乏結(jié)合細(xì)菌核糖體的SD序列，因此

cDNA的起始密碼子(ATG)上游部分(5’端非編碼區(qū))是無(wú)用的，必須除去;③表達(dá)載體應(yīng)是含有大腸桿菌RNA聚合酶所能識(shí)別的啟動(dòng)子如PL、tac、T7等;④為提高表達(dá)效率，應(yīng)根據(jù)啟動(dòng)子類型和特定的蛋白質(zhì)，選擇合適的菌株和誘導(dǎo)條件。90二、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式真核基因在E.coli中可以表達(dá)為:融合蛋白、非融合蛋白或分泌型表達(dá)。1.融合蛋白融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。融合蛋白中由于含有一段原核多肽序列。缺點(diǎn)：可能影響其真核蛋白的免疫原性；優(yōu)點(diǎn)：①在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；②基因操作比較簡(jiǎn)單；③可以切除其氨基端的原核多肽，而獲得具有生物學(xué)活性的真核天然蛋白分子。91

非融合蛋白是指在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的蛋白。以真核蛋白mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。為此，表達(dá)非融合蛋白的操縱子須改建成原核啟動(dòng)子—原核SD序列—真核基因的起始密碼子、結(jié)構(gòu)基因及終止密碼子。3.蛋白分泌型表達(dá)

將真核基因重組于編碼原核蛋白信號(hào)肽序列的下游，以表達(dá)帶有原核蛋白信號(hào)肽的融合蛋白。這種融合蛋白當(dāng)分泌到位于E.coli細(xì)胞內(nèi)膜與外模之間的間質(zhì)時(shí)，其信號(hào)肽可被信號(hào)肽酶切割，而真核蛋白分泌至胞外。2.非融合蛋白92優(yōu)點(diǎn)：①可減少所需蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)的降解；②有些在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無(wú)活性的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)時(shí)則具有活性；③分泌后的蛋白質(zhì)氨基端不含起始密碼子編碼的甲硫氨酸；④蛋白質(zhì)分泌至胞外后便于提純。93第六節(jié)、蛋白質(zhì)工程94一.蛋白質(zhì)工程的理論和技術(shù)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系DNA重組技術(shù)和基因定點(diǎn)誘變等技術(shù)二.蛋白質(zhì)工程的研究?jī)?nèi)容通過(guò)改變蛋白質(zhì)的活性部位，提高其生物功效及獨(dú)立工作的能力；通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序，提高其在極端條件(如酸、堿、熱等)下的穩(wěn)定性；通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序使其便于分離純化。95三.蛋白質(zhì)工程的目的1)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2)改變蛋白質(zhì)的特性3)生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)提高酶的產(chǎn)量和創(chuàng)建新型酶設(shè)計(jì)和研制新型抗體設(shè)計(jì)和研制多肽及蛋白質(zhì)類藥物設(shè)計(jì)合成全新蛋白質(zhì)96四、蛋白質(zhì)工程的技術(shù)原理定點(diǎn)誘變(Site-directedMutagenesis)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組研究的重點(diǎn)之一。在體外對(duì)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變，通過(guò)取代、缺失或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)叫定點(diǎn)誘變。對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究不僅有助于我們了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，還可以改造天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)。97定點(diǎn)誘變的優(yōu)點(diǎn)

傳統(tǒng)的誘變技術(shù)（如化學(xué)或物理誘變劑）處理的生物體，具有突變頻率低且任何基因都可能發(fā)生突變等問(wèn)題。定點(diǎn)誘變技術(shù)是一種通過(guò)改變基因中的特定位置的堿基，從而改造蛋白質(zhì)的技術(shù)。跟傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比，具有高效、簡(jiǎn)單、目的性和重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中改造、優(yōu)化基因常用的手段。98帶突變位點(diǎn)的寡核苷酸可介導(dǎo)定點(diǎn)誘變99Kunkel法Dut:dUTP酶Ung:N-尿嘧啶脫糖苷酶100PCR誘變法的步驟PCR誘變法的原理是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的誘變引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增而獲得定點(diǎn)突變的基因或DNA片段。

PCR定點(diǎn)誘變法可分為重組PCR定點(diǎn)誘變法和大引物誘變法兩種。重組PCR定點(diǎn)誘變法：該方法是利用四種引物，三輪PCR反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的,操作較為繁瑣。大引物誘變法：該方法是利用三種引物，兩輪PCR反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的。101重組PCR定點(diǎn)誘變法102大引物PCR定點(diǎn)誘變法(分離擴(kuò)增產(chǎn)物)103盒式誘變(cassettemutagenesis)104

利用定點(diǎn)誘變的方法對(duì)天然酶蛋白質(zhì)進(jìn)行改造已有很多成功的例子。然而，該方法僅適用于三維結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系基本清楚的蛋白質(zhì)，目前我們對(duì)這類關(guān)系的認(rèn)識(shí)還很膚淺。對(duì)于那些結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚不清楚的酶蛋白，定點(diǎn)突變是無(wú)能為力的。近年來(lái)有人提出“定向進(jìn)化”的觀點(diǎn)，為酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究開(kāi)辟了嶄新的途徑。105

酶(蛋白質(zhì)）的體外定向進(jìn)化(directedevolutionofenzymeinvitro)是1993年,由美國(guó)科學(xué)家Aronld首先提出的概念，是改造酶蛋白質(zhì)分子的一種新策略。它不需事先了解酶的定向結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)室模擬自然進(jìn)化機(jī)制，通過(guò)由易錯(cuò)PCR、致突變菌株誘變等方法對(duì)編碼酶蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，由DNA改組(DNAshuffling)、隨機(jī)引發(fā)重組和交錯(cuò)延伸等方法進(jìn)行突變基因體外重組，設(shè)計(jì)高通量篩選方法來(lái)選出需要的突變株。不僅可快速生產(chǎn)工業(yè)上有用的新酶，而且為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系開(kāi)辟了嶄新的途徑。2.定向進(jìn)化106107定向進(jìn)化的常用技術(shù)易錯(cuò)PCRDNA改組隨機(jī)引發(fā)重組交錯(cuò)延伸技術(shù)108易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR（errorpronePCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。連續(xù)易錯(cuò)PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。109DNA改組

DNA改組(DNAshuffling)是Stemmer于1994年建立的模仿自然進(jìn)化的一種DNA體外隨機(jī)突變方法。所謂DNA改組，就是將DNA拆散后重排，即將一種基因或具有結(jié)構(gòu)同源型的幾種基因在DNaseI的作用下隨機(jī)酶切成小片段，這些小片段之間有部分的堿基序列重疊，它們通過(guò)自身引導(dǎo)PCR(self-primingPCR)延伸，并重新組裝成全長(zhǎng)的基因，這一過(guò)程被稱為再組裝PCR(reassemblyPCR)。110DNA改組的基本過(guò)程目的基因的準(zhǔn)備：根據(jù)需要選擇一個(gè)基因或其片段，也可以是幾個(gè)序列上具有較高同源性的基因；DNaseI酶切：將目的基因隨機(jī)切割成約10-50bp或300bp左右的小片段；不加引物的PCR：在Taq酶的作用下將DNaseI切割后的DNA重疊小片段重新連接起來(lái)，在此過(guò)程中可能發(fā)生許多突變和重組加入引物的PCR：加入目的基因片段兩端的引物，使連接好的DNA得到擴(kuò)增，篩選正突變。得到正突變子又可以重復(fù)進(jìn)行改組，使性狀進(jìn)一步提高。111112隨機(jī)引發(fā)重組

隨機(jī)引發(fā)重組(random-primingrecombination，RPR)是Aronld于1998年首先報(bào)道。其基本原理是以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的DNA小片段，由于堿基的錯(cuò)誤摻入和錯(cuò)誤引發(fā)，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨重組，再組裝成完整的基因，克隆到表達(dá)裁體上，隨后篩選。113114第七節(jié)、基因工程與蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用與展望

基因工程技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

1151、基因工程技術(shù)與醫(yī)藥制造業(yè)

1982年,美國(guó)Lilly公司首先將重組胰島素投放市場(chǎng),標(biāo)志著世界上第一個(gè)基因工程藥物誕生。目前,以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一,發(fā)展前景非常廣闊?；蚬こ趟幬镏饕?xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核苷酸藥物等。116117胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素干擾素1200升人血1升發(fā)酵液2－3萬(wàn)美元/病人200－300美元/病人1182、基因工程技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

隨著石油、煤炭等不可再生資源的大量消耗，能源危機(jī)和環(huán)境污染已經(jīng)成為影響人類可持續(xù)發(fā)展的最大障礙。以中國(guó)為例，按已探明儲(chǔ)量和年開(kāi)采量計(jì)算，中國(guó)的石油資源有可能在20余年內(nèi)枯竭。面對(duì)日益增加的危機(jī)，大力開(kāi)發(fā)新的可再生性資源已經(jīng)成為人類走可持續(xù)發(fā)展道路的前提條件。生物質(zhì)資源是地球上數(shù)量最豐富的可再生資源，全球每年光合作用的生物質(zhì)高達(dá)1500-2000億噸，其中80%以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，估計(jì)其年產(chǎn)量相當(dāng)于目前所需能源的10倍，但這些可再生資源被作為能源利用的還不到1%。所以，開(kāi)發(fā)利用生物質(zhì)可再生資源是十分必要和迫切的。目前，利用生物質(zhì)—如淀粉和纖維素等可再生資源轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料酒精已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。119

但由于纖維素的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，使得在纖維素的生物降解和纖維素水解產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化上，都還存在著一些問(wèn)題，如：纖維素酶活力低、微生物對(duì)纖維素水解底物利用率低等。為此，人們嘗試?yán)没蚬こ淌侄危瑢?duì)微生物進(jìn)行定向改造來(lái)促進(jìn)可再生資源的生物轉(zhuǎn)化。

已經(jīng)從細(xì)菌和真菌中克隆到各種纖維素酶基因。如人們已成功將來(lái)自糞肥纖維單胞菌的內(nèi)切和外切纖維素酶基因?qū)虢湍钢?，發(fā)現(xiàn)其能向培養(yǎng)基中分泌纖維素酶，且活性提高了70%。120

通過(guò)基因工程育種可使植株獲得各種抗性，使品質(zhì)和產(chǎn)量得到改良和提高3、基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

1994年第1個(gè)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品延熟保鮮轉(zhuǎn)基因番茄獲得美國(guó)農(nóng)業(yè)部和美國(guó)食品與藥品管理局批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng),開(kāi)創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因食品商業(yè)應(yīng)用的先河。截止1998年6月，國(guó)外批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)的各類轉(zhuǎn)基因作物已近90種，常用的有大米、玉米、棉花、油菜和馬鈴薯。1986年全世界被批準(zhǔn)進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)的植物只有5例，到1997年達(dá)2,584例。大量的轉(zhuǎn)基因生物體作為食品或其他生活品進(jìn)入人們的生活。121

我國(guó)人口眾多，土地資源相對(duì)貧乏，糧食生產(chǎn)壓力很大。GMO能改善食品品質(zhì)、抗蟲(chóng)、增產(chǎn)、增加作物對(duì)病菌的抵抗力，減少水土流失及農(nóng)藥使用量，從而帶來(lái)顯著的農(nóng)業(yè)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

2008年7月9日,國(guó)務(wù)院常務(wù)會(huì)議就審議通過(guò)“轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)”,該專項(xiàng)擬投入資金約240億元人民幣,將主要投入到優(yōu)勢(shì)基因的挖掘、轉(zhuǎn)基因品種選育和轉(zhuǎn)基因作物品種的產(chǎn)業(yè)化;其次,2009年中央一號(hào)文件中曾提到,我國(guó)將加快推進(jìn)轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng),整合科研資源,加大研發(fā)力度,盡快培育一批抗病蟲(chóng)、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的轉(zhuǎn)基因新品種,并促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化。

2009年12月，我國(guó)轉(zhuǎn)基因玉米(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所)和轉(zhuǎn)基因水稻(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))獲得安全證書(shū).122轉(zhuǎn)基因作物123124125126127蘇云金桿菌在芽孢形成過(guò)程中，菌體內(nèi)可產(chǎn)生大量具有高度特異性殺蟲(chóng)活性的結(jié)晶蛋白組成，這種蛋白通常被稱之為殺蟲(chóng)晶體蛋白或蘇云金桿菌毒蛋白（Bttoxin）。Bt基因是目前抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用最為廣泛和成熟的一種基因。Bt對(duì)于鱗翅目某些昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)有特異的毒性作用。128Non-transgenicsTransgenicsHerbicideResistancetransgene=modifiedEPSPsynthaseorphosphinothricin-N-acetyltransferase129改善營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物TheGoldenRiceStory

VitaminAdeficiencyisamajorhealthproblem

Causesblindness

Influencesseverityofdiarrhea,measles

>100millionchildrensufferfromtheproblem

Formanycountries,theinfrastructuredoesn’texisttodelivervitamin