第七章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及細(xì)胞融合2014

內(nèi)容植物原生質(zhì)體分離，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)，植物細(xì)胞融合。要求了解原生質(zhì)分離、純化、活力測(cè)定及其影響因素，掌握植原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法、步驟和影響因素；理解植物細(xì)胞融合的原理及方法。第七章原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物細(xì)胞中除去細(xì)胞壁的裸露的有生活力的部分。除了沒(méi)有細(xì)胞壁外，具有細(xì)胞的一切特征。原生質(zhì)體包括▲細(xì)胞質(zhì)膜▲膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)▲其他具有生命活性的細(xì)胞器，如細(xì)胞核、線(xiàn)粒體和高爾基體等。原生質(zhì)體（protoplast）原生質(zhì)體培養(yǎng)意義是植物細(xì)胞工程的核心技術(shù)。

1.除去了細(xì)胞壁，為植物細(xì)胞之間的融合掃平了障礙，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交，為制造新雜種開(kāi)辟了道路。

(克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性)2.原生質(zhì)體是各種遺傳操作的理想受體，從而可以進(jìn)行品種的遺傳改良?？蓴z入外源DNA，細(xì)胞器、細(xì)菌或病毒顆粒，為高等植物的遺傳飾變打下基礎(chǔ)。3.獲得細(xì)胞無(wú)性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料。一、原生質(zhì)體的分離（一）材料來(lái)源植物的莖、葉、胚、子葉、下胚軸等器官組織以及愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞均可作為原生質(zhì)體分離的材料。

目前較多采用葉片分離原生質(zhì)體，但分裂旺盛的、再分化能力強(qiáng)的愈傷組織或懸浮細(xì)胞系，尤其是胚性愈傷組織或胚性懸浮細(xì)胞系是最理想的原生質(zhì)體分離材料。

第一節(jié)原生質(zhì)體的分離與純化材料預(yù)處理意義▲提高原生質(zhì)體的分裂頻率；▲逐步提高植物材料的滲透壓，以適應(yīng)培養(yǎng)基中的高滲環(huán)境。方法◆暗處理豌豆枝條取下后，分離原生質(zhì)體前，先在黑暗中（一定濕度）放1-2d，提高原生質(zhì)體存活率高，并能繼續(xù)分裂；◆預(yù)培養(yǎng)羽衣甘藍(lán)先去葉下表皮，再在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7d，再去壁，原生質(zhì)體高度液泡化，葉綠體也解體；◆低溫處理龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理后，分離得到的原生質(zhì)體才能分裂。（在很多情況下材料不必經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)的預(yù)處理）1.

機(jī)械法Klercker于1892年最早進(jìn)行分離高等植物原生質(zhì)體的研究。其方法是把細(xì)胞置于一種高滲的糖溶液中，使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形，然后用利刃切割，發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞壁被切去后釋放出原生質(zhì)體。缺點(diǎn)◆原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；◆方法繁瑣費(fèi)力；◆對(duì)分生細(xì)胞和其它液泡化程度不高的細(xì)胞不適用。未得到廣泛應(yīng)用。優(yōu)點(diǎn)

能夠排除外加酶對(duì)離體原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和代謝活性的有害影響。（二）原生質(zhì)體分離方法2.

酶分離法1960年，Cocking首先利用纖維素酶處理番茄根尖，分離得到收率高、活力強(qiáng)、完整性好的原生質(zhì)體。1968年，纖維素酶和離析酶商品化生產(chǎn)后，大量進(jìn)行植物原生質(zhì)體的研究?，F(xiàn)在果膠酶處理→單細(xì)胞－－纖維素酶處理→原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體最有效方法。細(xì)胞壁的組成纖維素

半纖維素

果膠質(zhì)少量蛋白質(zhì)25-50％53％5％纖維素酶半纖維素酶果膠酶酶的種類(lèi)及特點(diǎn)◆

纖維素酶主要含有纖維素酶C，作用于天然的和結(jié)晶的纖維素，具有分解天然纖維素的作用，還含纖維素酶CX，作用于定形的纖維素，可分解短鏈纖維素，另含有纖維素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，總體作用是降解纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體。

◆半纖維素酶降解半纖維素為單糖或單糖衍生物?！?/p>

果膠酶使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來(lái)。此外，還有蝸牛酶（主要用于花粉母細(xì)胞和四分體細(xì)胞）等。原生質(zhì)體酶分離法◆兩步分離法用果膠酶離析植物組織，收集細(xì)胞；經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁，然后獲得原生質(zhì)體。日本產(chǎn)的Onozuka纖維素酶常和果膠酶結(jié)合使用?！粢徊椒蛛x法一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對(duì)材料進(jìn)行一次性處理。上海植物生理研究所生產(chǎn)的ZA3-867纖維酶是多種酶的復(fù)合物，含有纖維素酶，果膠酶，半纖維素酶等，分離細(xì)胞壁的效果較好。酶液的配制◆酶的配比和濃度果膠酶/纖維素酶純度高，但濃度不宜太高；木本植物加入半纖維素酶。如果溶液中的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能漲破或收縮，因此在酶液、洗液和培養(yǎng)液中滲透壓

應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同，或者比細(xì)胞內(nèi)滲透壓略大些。

較高水平的滲透劑可以阻止原生質(zhì)體的破裂和出芽，但同時(shí)也可能抑制原生質(zhì)體的分裂。①糖溶液系統(tǒng)包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，濃度約在0.40-0.80mol／L?？纱龠M(jìn)分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂；②鹽溶液系統(tǒng)包括KCl、MgSO4和KH2PO4等。

此外，酶溶液里還可加入適量的葡聚糖硫酸鉀，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性；使RNA酶不活化；并使離子穩(wěn)定?！魸B透穩(wěn)定劑◆pH酶溶液的pH值對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時(shí)發(fā)現(xiàn)原始pH值為5.0時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)生得很快，但損壞較嚴(yán)重，并且培養(yǎng)后大量破裂。當(dāng)pH值提高到6.0時(shí)，最初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少，但與pH值為5.0時(shí)處理同樣時(shí)間后相比，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加。原始pH值提高到7.0時(shí)，生活的原生質(zhì)體數(shù)量進(jìn)一步增加，損傷的原生質(zhì)體也少得多。

分離葉肉原生質(zhì)體的完整流程表面滅菌的葉片①撕去下表皮酶溶液及滲壓穩(wěn)定劑（葉段漂浮其上）②抽真空、振蕩保溫8hr原生質(zhì)體沉于培養(yǎng)皿底吸掉酶液原生質(zhì)體懸浮于清洗液中

⑤離心2次，第2次離心前重新懸浮于高蔗糖清洗液中原生質(zhì)體（上層）⑥重新懸浮于培養(yǎng)基中取少量樣品用血球板計(jì)數(shù)以適當(dāng)?shù)闹舶迕芏戎匦聭腋∮谂囵B(yǎng)基中③④（一）原生質(zhì)體的純化1.

沉降法（過(guò)濾離心法）-應(yīng)用最廣利用比重原理，低速離心使原生質(zhì)體沉于底部。

過(guò)濾酶處理混合液，30-40μm微孔濾膜，

低速離心，150g以下，3-5min，棄上清，用液體培養(yǎng)基或甘露醇溶液懸浮洗滌，重復(fù)2-3次，

1-2ml液體培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體，備用。優(yōu)點(diǎn)：操作方便；損失少。缺點(diǎn)：純度不高二、原生質(zhì)體的純化與活力測(cè)定2.

漂浮法利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后

原生質(zhì)體位于蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)基的界面上，

殘?jiān)樾汲恋焦艿住?/p>

先加蔗糖溶液（20%左右），

酶處理混合液置于其上，

離心，150g，5min

用液體培養(yǎng)基或甘露醇溶液懸浮洗滌2-3次,1-2ml液體培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體，備用。優(yōu)點(diǎn)：純度高缺點(diǎn)：收率低。3.

界面法采用2種或2種以上密度不同的溶液，離心后使完整的原生質(zhì)體處在兩液相的界面。最早Hughes(1978)兩液相下層：450mM/L蔗糖上層：450mM/L甘露醇Piwowarczyk（1978）改進(jìn)了上述方法兩液相下層：培養(yǎng)基，含500mM/L蔗糖中層：培養(yǎng)基，含140mM/L蔗糖，360mM/L山梨醇上層：含原生質(zhì)體酶液，含300mM/L山梨醇和100mM/LCaCl2現(xiàn)在用不同連續(xù)梯度Ficoll（聚蔗糖）溶液，上面為酶-原生質(zhì)體混合液，經(jīng)離心（150g，5min）,不同比重的原生質(zhì)體漂浮在不同濃度梯度的界面上。優(yōu)點(diǎn)：收獲的原生質(zhì)體大小均勻一致。缺點(diǎn)：收率低。純化后的葉肉原生質(zhì)體（二）原生質(zhì)體活力的測(cè)定1.以胞質(zhì)環(huán)流作為進(jìn)行活躍代謝的指標(biāo)，

但對(duì)在細(xì)胞周?chē)鷶y有大量葉綠體的葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體來(lái)說(shuō)，這種方法的作用不大；2.以氧的攝入量作指標(biāo)，攝入量可通過(guò)一個(gè)能指示呼吸代謝強(qiáng)度的氧電極進(jìn)行測(cè)定。3.以光合活性作指標(biāo)。4.以完整的質(zhì)膜排斥伊凡藍(lán)的能力作指標(biāo)。5.以熒光素雙醋酸酯（FDA）的染色能力為指標(biāo)。一、供體植物的選擇

供體組織的生理狀態(tài)很重要。一般情況下，在可控光、溫、濕的環(huán)境條件下能得到重復(fù)的結(jié)果，

即在無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的幼苗制備原生質(zhì)體較好。第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)1.基本培養(yǎng)基

MS和B5，或其衍生的培養(yǎng)基。

CaCl2促進(jìn)細(xì)胞分裂。鈣可增強(qiáng)原生質(zhì)體穩(wěn)定性，提高分裂頻率，明顯改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)外的離子交換。

NH4NO3降低細(xì)胞分裂頻率。2.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素類(lèi)。針對(duì)不同的研究對(duì)象，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的水平要做適當(dāng)調(diào)整。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)基3.滲壓劑在沒(méi)有再生出一個(gè)堅(jiān)韌的細(xì)胞壁之前，原生質(zhì)必須有培養(yǎng)基滲透壓的保護(hù)。高滲溶液，培養(yǎng)時(shí)一般逐步過(guò)渡。通常的滲透劑是甘露醇和山梨醇。

MS＋NAA2.0ppm＋BA0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇

4.pH：5.6-6.0培養(yǎng)基用醋酸纖維微孔濾膜過(guò)濾滅菌。新分離出來(lái)的原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng)。

培養(yǎng)溫度一般在25-30℃下。三、培養(yǎng)條件

1.液體淺層培養(yǎng)

原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基（約2×105/ml密度）

—將原生質(zhì)體懸浮液移到直徑為6cm的培養(yǎng)皿中（2-3mm為宜）

—5-10天后開(kāi)始原生質(zhì)體分裂

優(yōu)點(diǎn)▲通氣好；▲原生質(zhì)體代謝物易擴(kuò)散，防止有害物質(zhì)積累過(guò)多造成毒害；▲轉(zhuǎn)移添加新鮮培養(yǎng)基方便，便于觀(guān)察和照相；▲操作簡(jiǎn)單；▲可微量培養(yǎng)，細(xì)胞植板率高。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體沉淀，分布不均；細(xì)胞團(tuán)聚集多，難成單細(xì)胞株系。四、培養(yǎng)方法

原生質(zhì)體（密度為4×105/ml）與等量體積瓊脂糖培養(yǎng)基均勻混合

—置于6cm培養(yǎng)皿（2-3mm）,

—暗培養(yǎng)

—5-7天原生質(zhì)體開(kāi)始分裂。

優(yōu)點(diǎn)

原生質(zhì)體分布均勻，利于分裂，容易獲得單胞株系；

可定位觀(guān)察。

缺點(diǎn)

原生質(zhì)體易受熱傷害，易破碎；

原生質(zhì)體始終處于高滲透壓脅迫下生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，植板率低。

2.

固體/平板培養(yǎng)原生質(zhì)體采用平板培養(yǎng)方法包埋在培養(yǎng)皿底層；

上面再加入相同成分的液體培養(yǎng)基，

暗培養(yǎng)。

需更換新鮮液體培養(yǎng)基。

優(yōu)點(diǎn)

原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂，易獲單細(xì)胞株系；

能除去抑制分裂的有害物質(zhì)，細(xì)胞植板率高。

缺點(diǎn)

原生質(zhì)體易受熱傷害，易破碎。

3.

（固、液）雙層培養(yǎng)五、低密度培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)相似，原生質(zhì)體初始植板密度對(duì)植板效率有顯著的影響。原生質(zhì)體培養(yǎng)的一般密度為104-105。高密度下，個(gè)別原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)在相當(dāng)早時(shí)就交織在一起，如果原生質(zhì)體群體在遺傳上是異質(zhì)的，就會(huì)形成嵌合體組織。在體細(xì)胞雜交和誘發(fā)突變的研究中，最好能獲得個(gè)別細(xì)胞的無(wú)性系。需要低密度（100-500）原生質(zhì)體培養(yǎng)。1.

培養(yǎng)基KM8pKao&Michayluk（1975）Vicia

hajastana（一種蠶豆）單細(xì)胞再生出壁，并分裂形成愈傷；在苜蓿、豌豆和Vicia中培養(yǎng)中，低密度下（小于100）分裂的更快；培養(yǎng)馬鈴薯原生質(zhì)體及馬鈴薯/番茄原生質(zhì)體融合產(chǎn)物獲得成功。黑暗或近于黑暗（50lx）培養(yǎng)。2.培養(yǎng)方法1）飼養(yǎng)細(xì)胞層法

用X射線(xiàn)或紫外線(xiàn)照射細(xì)胞（106），抑制細(xì)胞分裂，但不破壞細(xì)胞代謝，

將其清洗，

植板在軟瓊脂培養(yǎng)基上，此平板稱(chēng)飼喂層，

然后將未照射處理的原生質(zhì)體鋪在飼喂層上。

特點(diǎn)

以一種植物細(xì)胞制成的平板，支持另一種植物原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。

飼喂層沒(méi)有種的特異性。煙草原生質(zhì)體植板密度低于104時(shí)，一般不能分裂，用此方法，植板密度可低至10-100。2種類(lèi)型的活躍代謝和正在分裂的原生質(zhì)體

混合在液體培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)。

用于某些物種原生質(zhì)體或雜種細(xì)胞的培養(yǎng)。

條件

2個(gè)物種原生質(zhì)體間能發(fā)生有效的互饋；

其產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)上能彼此區(qū)分。2）共培養(yǎng)法3）Cuprak微滴法高國(guó)楠（1977）及Gleba（1978）設(shè)計(jì)特別培養(yǎng)皿培養(yǎng)單個(gè)原生質(zhì)體及其再生的細(xì)胞。兩室大的內(nèi)室：很多小穴，加入原生質(zhì)體懸浮液（0.25-0.5μl）；小的外室：注入無(wú)菌水，保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕度?？蛇M(jìn)行單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)。六、細(xì)胞壁的形成培養(yǎng)2-4天，原生質(zhì)體失去其特有的球型外觀(guān)，這是再生新壁的象征。研究認(rèn)為，旋花科植物原生質(zhì)體只有在外源供應(yīng)一種易于代謝的碳源（蔗糖）時(shí)，細(xì)胞壁才能再生。培養(yǎng)基中若存在電解質(zhì)滲透壓調(diào)節(jié)劑時(shí)會(huì)抑制壁的再生。壁的形成與細(xì)胞分裂有直接關(guān)系，凡是不能再生壁的原生質(zhì)體就不能進(jìn)行正常的有絲分裂。愈傷組織形成后，轉(zhuǎn)入不含滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)劑中，其培養(yǎng)及植株再生與一般組織培養(yǎng)方法相同。原生質(zhì)體培養(yǎng)的程序

一、原生質(zhì)體融合意義

原生質(zhì)體融合也稱(chēng)體細(xì)胞雜交，

即，分離下來(lái)的不同親本雜交的原生質(zhì)體，

在人工控制下互相融合成一體。

自然條件下，原生質(zhì)體自然融合頻率極低，

必須加以一定的方法誘導(dǎo)，才能促進(jìn)原生質(zhì)體的融合。第三節(jié)原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合◆打破了種間界限（生殖隔離），使基因交流擴(kuò)大范圍；◆克服有性雜交特別是遠(yuǎn)緣雜交的不親和性；◆擴(kuò)大了遺傳變異及種質(zhì)資源的范圍。原生質(zhì)體融合的意義甘薯原生質(zhì)體融合植株1.

化學(xué)法融合1）無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合1909年，Kuster證實(shí)，低滲NaNO3處理可誘導(dǎo)發(fā)生質(zhì)壁分離表皮細(xì)胞2個(gè)原生質(zhì)體融合。缺點(diǎn)異核體形成頻率不高，尤其是對(duì)于高度液泡化的葉肉原生質(zhì)體。二、原生質(zhì)體融合方法Carlson等（1972）獲得第一個(gè)體細(xì)胞雜種2）高pH-高鈣離子誘導(dǎo)融合Keller和Melcher（1973年）強(qiáng)堿性的高濃度鈣離子（pH，10.5；鈣離子，50mmol/L）37℃處理30min，兩個(gè)品系煙草葉肉原生質(zhì)體很容易融合。1977年，獲得煙草種間和種內(nèi)體細(xì)胞雜種。對(duì)矮牽牛效果也很好，但對(duì)有些物種，高pH可能有毒。高國(guó)楠等（1974）提出，現(xiàn)被廣泛采用。

滴150μl混合雙親的原生質(zhì)體懸浮液于載體玻片上，形成一層薄層;

吸取PEG融合誘導(dǎo)液（28-58%，分子量1500-6000）450μl，

使其逐漸與原生質(zhì)體接觸，促使原生質(zhì)體相粘連；

培養(yǎng)基進(jìn)行清洗。

高Ca2+-高pH溶液清洗，

可提高原生質(zhì)體融合頻率。3）聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合優(yōu)點(diǎn)

▲采用聚乙二醇作為融合劑時(shí)，

異核體形成的頻率很高，可重復(fù)性很強(qiáng)；

▲對(duì)大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型來(lái)說(shuō)毒性很低；洋蔥煙草將原生質(zhì)體懸浮液離心，去上清，用電擊液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸鈣，0.5mmol/L醋酸鎂）懸浮，置于融合小室；

在電融合儀的交變電場(chǎng)作用下，原生質(zhì)體彼此靠近，緊密接觸，在兩極間排成串珠狀。給予瞬間的高強(qiáng)度電脈沖，質(zhì)膜發(fā)生可逆性電激穿，導(dǎo)致融合。電融合法的優(yōu)點(diǎn)（與化學(xué)融合法相比）▲簡(jiǎn)單、迅速、效率高；▲經(jīng)融合處理后沒(méi)有中毒反應(yīng)；▲需要特殊設(shè)備，不常采用。2.

物理法融合（電融合技術(shù)）德國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育枝頭上開(kāi)花、結(jié)出鮮紅的番茄，而地下塊莖卻是馬鈴薯。番茄馬鈴薯德國(guó)漢堡大學(xué)把牛肉細(xì)胞和番茄細(xì)胞融合成雜交種細(xì)胞，繁殖出一種雜交新品種。▲內(nèi)含牛肉動(dòng)物蛋白和番茄植物蛋白各半；▲蛋白質(zhì)總量為普通番茄的40倍；▲所結(jié)出的果實(shí)

兼有牛肉味和番茄味，營(yíng)養(yǎng)也較全面。牛肉番茄◆對(duì)稱(chēng)融合完整原生質(zhì)體融合，產(chǎn)生核－核、胞質(zhì)－胞質(zhì)重組的對(duì)稱(chēng)雜種。常因分裂不同步使一方的染色體全部或部分丟失?！舨粚?duì)稱(chēng)融合使一方的細(xì)胞核失活（胞質(zhì)體）或同時(shí)也使另一方的胞質(zhì)失活（核質(zhì)體），產(chǎn)生不對(duì)稱(chēng)雜種?！粑⒃|(zhì)體融合只有一條或幾條染色體的微核與原生質(zhì)體融合。原生質(zhì)體融合類(lèi)型◆胞壁再生比原生質(zhì)體培養(yǎng)稍滯后?！艉巳诤袭惡梭w、同核體及多核體的混合群體。異核體雙核分裂同步——子細(xì)胞含雙親的遺傳物質(zhì)；

不同步——一方染色體丟失；◆細(xì)胞增殖有的在條件適合時(shí)繼續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織；有的中途停止分裂、死亡。融合體的培養(yǎng)和發(fā)育經(jīng)過(guò)融合處理后的原生質(zhì)體群體內(nèi)包含未融合的2種親本原生質(zhì)體，同核體、異核體、各種其他核-質(zhì)組合。異核體是未來(lái)雜種的潛在來(lái)源，約占0.5-10%，但其在生長(zhǎng)和分化兩個(gè)方面均無(wú)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)可言，有效鑒定和選擇雜種細(xì)胞，是體細(xì)胞雜交成功的關(guān)鍵。三、雜種細(xì)胞的篩選與鑒定1.根據(jù)物理特性直觀(guān)選擇1）根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)志選擇如根據(jù)親本原生質(zhì)體含有的色素，對(duì)融合產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，在其可辨特征消失之前，將其從混合群體中分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)。主要用于非綠色原生質(zhì)體

與含有葉綠體的原生質(zhì)體的融合。用不同熒光染料標(biāo)記2種原生質(zhì)體，雜種存在2種熒光染料。在酶解時(shí)，染料

0.5mg/L，加到酶混合液中。異硫氰酸熒光素（綠）堿性蕊香紅熒光素（紅）2）根據(jù)熒光標(biāo)記選擇用發(fā)不同熒光的熒光染料標(biāo)記3）低密度植板選擇把原生質(zhì)體以低密度植板在瓊脂培養(yǎng)基上，以便追蹤個(gè)別的雜種細(xì)胞及它們的后代。1）激素自主性互補(bǔ)選擇2個(gè)親本原生質(zhì)體生長(zhǎng)，需要生長(zhǎng)激素，雜種自身能產(chǎn)生生長(zhǎng)激素。無(wú)激素培養(yǎng)基篩選。Carson篩選出粉藍(lán)煙草和