紫外可見分光光度法pjm

10-1概述10-2基本原理10-3Lambert-Beer定律10-4分析應(yīng)用10-5UV-Vis分光光度計第10章紫外-可見分光光度法(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)案例：我們經(jīng)?？梢杂^察到兩種現(xiàn)象：一種現(xiàn)象是，當(dāng)一束陽光通過棱鏡時，色散出的光呈現(xiàn)不同的顏色；另一種現(xiàn)象是，不同的物質(zhì)呈現(xiàn)出不同的顏色。試解釋這兩種現(xiàn)象的原因。我們觀察到物質(zhì)的顏色是怎么產(chǎn)生的？可見光10-1概述單色光、復(fù)合光、光的互補(bǔ)單色光復(fù)合光光的互補(bǔ)單一波長的光由不同波長的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。藍(lán)黃紫紅綠紫黃綠綠藍(lán)橙紅藍(lán)綠物質(zhì)對光的吸收物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光UV-Vis—是基于被測物質(zhì)的分子對光（200~760nm）具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。

基本原理：根據(jù)被測物質(zhì)對單色光的吸收特征和吸收強(qiáng)度對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

UV-Vis光譜圖：用相同強(qiáng)度但不同波長（200nm—760nm）的電磁波照射分子，由于被物質(zhì)分子吸收了部分能量，透過物質(zhì)分子的照射光強(qiáng)度就呈不同程度的衰減，這樣就得到一張光強(qiáng)度變化對波長的關(guān)系曲線圖—UV-Vis光譜圖。

UV-Vis方法是分子光譜方法，它利用分子對外來輻射的吸收特性。

UV-Vis涉及分子外層電子的能級躍遷；光譜區(qū)在160~760nm.UV-Vis主要用于物質(zhì)的定量分析，但紫外光譜(UV)為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，尤其是有機(jī)化合物的重要定性工具之一。

1.過程：運動的分子外層電子--------吸收外來輻射------產(chǎn)生電子能級躍遷-----分子吸收光譜。2.能級組成：10-2基本原理一、分子吸收光譜的產(chǎn)生物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動形式：（1）電子相對于原子核的運動；（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動；（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動。三種能級都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量。分子的能量變化E為各種形式能量變化的總和：其中Ee最大：1-20eV;（紫外-可見）Ev次之：0.05-1eV;（紅外）Er最?。?.05eV。（遠(yuǎn)紅外）可見，電子能級間隔比振動能級和轉(zhuǎn)動能級間隔大1~2個數(shù)量級，在發(fā)生電子能級躍遷時，伴有振-轉(zhuǎn)能級的躍遷，形成所謂的帶狀光譜。ΔEe>ΔEv>ΔEr3.吸收光譜純電子能態(tài)間躍遷S2S1S0S3hE2E0E1E3S2S1S0hAhhh分子內(nèi)電子躍遷帶狀光譜銳線光譜A

不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同或者說其分子能級的能量(各種能級能量總和)或能量間隔不同，因此不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長或能量的外來輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。

物質(zhì)對光的選擇吸收物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對光的選擇吸收基礎(chǔ)。例：A物質(zhì)B物質(zhì)同理，得：1eV=1.610-19J.測量某物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長（）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制吸光度隨波長的變化可得一曲線，此曲線即為吸收光譜。吸收光譜的獲得-胡羅卜素咖啡因阿斯匹林丙酮

幾種有機(jī)化合物的分子吸收光譜圖。分子吸收光譜上可以看到哪些特征呢？②吸收谷：吸收曲線上的谷稱為吸收谷，所對應(yīng)的波長稱為最小吸收波長（λmin）。④末端吸收：在吸收曲線的200nm波長附近

①吸收峰：吸收曲線上的峰稱為吸收峰，所對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長（λmax）。③肩峰：吸收峰上的曲折處稱為肩峰(shoulderpeak)，通常用λsh表示。概念：吸收曲線的討論：①同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。②吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。③不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。ABAAC增大④不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。⑤在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。AC增大有機(jī)分子成鍵的原理及躍遷類型化學(xué)鍵的類型σ鍵：σ鍵有三種：A、組成分子的原子靠s軌道與s軌道交疊形成σ鍵。B、組成分子的原子靠s軌道與Px軌道交疊形成σ鍵。C、組成分子的原子靠Px軌道與Px軌道交疊形成σ鍵。這種化學(xué)鍵位能低，比較穩(wěn)定。

π鍵：組成分子的原子間的P軌道靠肩并肩的方式交蓋。則形成π軌道。由π軌道形成的化學(xué)鍵稱為π鍵。如果有機(jī)物中含有N、O、S、X等雜原子，由于這些原子都有弧電子對，因此，分子中就有非成鍵電子軌道。

n鍵：分子中的原子含有未參加成鍵的孤對電子，由孤對電子所占據(jù)的軌道稱非成鍵軌道，也叫n軌道。含有弧對電子的n軌道稱為n鍵。

成鍵軌道和反鍵軌道當(dāng)兩個原子各提供一個軌道成鍵時，形成的分子軌道有兩個。一個比兩原子軌道中的任何一個能量都低，叫成鍵軌道。另一個比兩個原子軌道中任何一個的能量都高，叫反鍵軌道。例如：H2

根據(jù)能量最低原理，成鍵后，電子將首先填充能量低的成鍵軌道，而形成分子。各軌道能級高低順序：n**；可能的躍遷類型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*-*:C-H共價鍵,如CH4(125nm)；C-C鍵,如C2H6(135nm)處于真空紫外區(qū)。-*和

-*:盡管所需能量比上述-*躍遷能量小,但波長仍處于真空紫外區(qū)；n-*:含有孤對電子的分子,如H2O(167nm),CH3OH(184nm),CH3Cl(173nm)，(CH3)2O(184nm),CH3NH2(215nm),(CH3)3N(227nm),可見,大多數(shù)波長仍小于200nm，處于遠(yuǎn)紫外區(qū)。以上四種躍遷都與成鍵和反鍵軌道有關(guān)(-*，-*，-*和n-*),躍遷能量較高，這些躍遷所產(chǎn)生的吸收譜多位于真空紫外區(qū)或遠(yuǎn)紫外區(qū)，因而在此不加討論。只有-*和n-*兩種躍遷的能量小，相應(yīng)波長出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見光區(qū)，且對光的吸收強(qiáng)烈，是我們研究的重點。無機(jī)物分子能級躍遷

一些無機(jī)物也產(chǎn)生紫外-可見吸收光譜，其躍遷類型包括p-d躍遷或稱電荷轉(zhuǎn)移躍遷以及d-d,f-f躍遷或稱

配位場躍遷。1.電荷轉(zhuǎn)移躍遷

一些同時具有電子予體(配位體)和受體(金屬離子)的無機(jī)分子，在吸收外來輻射時，電子從予體躍遷至受體所產(chǎn)生的光譜。max較大(104以上)，可用于定量分析。

2.配場躍遷

過渡元素的d或f軌道為簡并軌道，當(dāng)與配位體配合時，軌道簡并解除，d或f軌道發(fā)生能級分裂，如果軌道未充滿，則低能量軌道上的電子吸收外來能量時，將會躍遷到高能量的d或f軌道，從而產(chǎn)生吸收光譜。max較小(102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物結(jié)構(gòu)及其鍵合理論。小結(jié)飽和有機(jī)化合物無UV-Vis；電子躍遷類型與分子結(jié)構(gòu)及存在基團(tuán)有密切關(guān)系分子結(jié)構(gòu)電子躍遷類型λmax和電子躍遷類型基團(tuán)（結(jié)構(gòu)鑒定）根據(jù)生色團(tuán)（Chromogenesisgroup）：分子中含有非鍵或鍵的電子體系，能吸收外來輻射時并引起n-*

和-*躍遷，可產(chǎn)生此類躍遷的結(jié)構(gòu)單元，稱為生色團(tuán)。助色團(tuán)（Auxochromousgroup）：含有孤對電子，可使生色團(tuán)吸收峰向長波方向移動并提高吸收強(qiáng)度的一些官能團(tuán)，稱之為助色團(tuán)。紅移或藍(lán)移（Redshiftorblueshift）：在分子中引入的一些基團(tuán)或受到其它外界因素影響，吸收峰向長波方向（紅移）或短波方向移動（藍(lán)移）的現(xiàn)象。那么促使分子發(fā)生紅移或藍(lán)移的因素有哪些呢三、常用術(shù)語？四、吸收帶

（一）吸收帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1．R帶：由含雜原子的不飽和基團(tuán)的n→π*躍遷產(chǎn)生C＝O；C＝N；—N＝N—△E小，λmax250~400nm，εmax<100

2．K帶：由共軛雙鍵的π→π*躍遷產(chǎn)生(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—λmax

>200nm，εmax>104共軛體系增長，λmax紅移，εmax增大3．B帶：由π→π*躍遷產(chǎn)生芳香族化合物的主要特征吸收帶

λmax=256nm，寬帶，具有精細(xì)結(jié)構(gòu)；εmax=2004.E帶：由苯環(huán)環(huán)形共軛系統(tǒng)的π→π*躍遷產(chǎn)生芳香族化合物的特征吸收帶E1180nmεmax>104

（常觀察不到）E2200nmεmax=7000強(qiáng)吸收苯環(huán)有發(fā)色團(tuán)取代且與苯環(huán)共軛時，E2帶與K帶合并一起紅移（長移）習(xí)題：1．以下四種化合物，能同時產(chǎn)生B吸收帶、K吸收帶和R吸收帶的是（）

DABC2．在下列化合物中，*躍遷所需能量最大的化合物是（）3．掌握以下名詞的概念吸收光譜即吸收曲線σ→σ*π→π*n→π*n→σ*電荷遷移配位場躍遷生色團(tuán)助色團(tuán)紅移藍(lán)移R帶K帶B帶E帶強(qiáng)帶弱帶分析：的UV-Vis？

為什么同一種吸收帶（不同化合物中的）位置、強(qiáng)度不同呢？（二）影響吸收帶的主要因素影響吸收帶形狀（位置）的因素有：

被測化合物的結(jié)構(gòu)測定的狀態(tài)測定的溫度溶劑的極性。影響吸收帶強(qiáng)度的因素有：

能級差因素：能級差小，躍遷幾率大；

空間位置因素：處在相同的空間區(qū)域躍遷幾率大。內(nèi)因外因

內(nèi)因：（1）共軛效應(yīng)的影響電子共軛體系增大，max紅移，

max增大165nm217nm

?

?

?

（3）位阻效應(yīng)

順反異構(gòu)造成的立體障礙順式二苯乙烯λmax

208nm反式二苯乙烯λmax295.5nm（2）超共軛效應(yīng)

兩個發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生共軛，可使吸收帶紅移。若立體障礙妨礙他們處于同一平面上，就會影響共軛效應(yīng)。烷基（-R）與共軛體系相連時，max紅移，空間阻礙使共軛體系破壞，max藍(lán)移，

max減小。

-重疊（4）跨環(huán)效應(yīng)π電子在環(huán)中越位發(fā)生作用的現(xiàn)象

有些β，γ不飽和酮中，雖然雙鍵與酮基不產(chǎn)生共軛，但由于適當(dāng)?shù)牧Ⅲw排列，使羰基π電子和雙鍵的π電子發(fā)生作用，以致相當(dāng)于nπ*的R帶紅移，吸收增強(qiáng)。

λmax=284nm當(dāng)C=O的π軌道與一個雜原子的p軌道有效交蓋時，也會出現(xiàn)跨環(huán)效應(yīng)。λmax=238nm

(5)取代基的影響

在光的作用下，有機(jī)化合物都有發(fā)生極化的趨向，即能轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。當(dāng)共軛雙鍵的兩端有容易使電子流動的基團(tuán)(給電子基或吸電子基)時，極化現(xiàn)象顯著增加。（1）給電子基：帶有未共用電子對的原子的基團(tuán)，如-NH2,-OH等。未共用電子對的流動性很大，能夠形成p-共軛，降低能量，max紅移。

（2）吸電子基：易吸引電子而使電子容易流動的基團(tuán)，如：-NO2,-CO,-CNH等。共軛體系中引入吸電子基團(tuán)，也產(chǎn)生電子的永久性轉(zhuǎn)移，max紅移。電子流動性增加，吸收強(qiáng)度增加。

（3）給電子基與吸電子基同時存在：產(chǎn)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移吸收，max紅移，

max增加。外因(1)溶劑效應(yīng)

溶劑極性的影響：

極性增大：n

π*躍遷產(chǎn)生的吸收峰短移

ππ*躍遷產(chǎn)生的吸收峰長移

溶劑極性對兩種躍遷的影響？

例：溶劑極性對異丙叉丙酮的兩種躍遷的影響

例如:苯胺在酸性環(huán)境形成陽離子,n電子消失，氨基的助色作用消失；苯酚在堿性環(huán)境形成陰離子,呈現(xiàn)n電子。(2)體系pH的影響λmax210.5nm，270nmλmax

236nm，287nmεmax62001450εmax94002600λmax

230nm，280nmλmax203nm，254nmεmax86001470εmax7500160

10-3Lambert-Beer定律一、幾個術(shù)語術(shù)語、符號定義其它表示方法輻射能P，P01s內(nèi)照在1cm2面積上的能量光強(qiáng)I0，I吸光度A吸光物質(zhì)對入射光的吸收程度透過率T透過光的效率，即透過透明或半透明體的光通量與其入射光通量的百分率。A=-lgT光程l待測物液層厚度b，d吸光系數(shù)a在給定波長，溶劑和溫度等條件下，吸光物質(zhì)在單位濃度(g/L)，單位液層厚度時的吸收度值E摩爾吸光系數(shù)ε指一定波長時，溶液的濃度為1mol/L，厚度為1cm時的吸光度值百分吸光系數(shù)/比吸光系數(shù)E1cm1%指一定波長時，100ml溶液中含被測物質(zhì)1g，，厚度為1cm時的吸光度值TransmittanceTAbsorbanceA

I0=Ia+It+Ir

+

Is

因此，在樣品測量時必須同時采用參比池扣除這些影響！I0IrItIs0.575光源單色器吸收池檢測器顯示I0It參比樣品注意比較吸光度的測量方式——相對測量法二、Lambert-Beer定律1.朗伯定律A=K1

b2.比耳定律A=K2

c3.朗伯-比耳定律如果同時考慮溶液的濃度和液層的厚度都變化，都影響物質(zhì)對光的吸收，則上述兩個定律可合并為此式為光吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式。推導(dǎo)得吸光系數(shù)Absorptivityb吸光液層的厚度，光程，cmc吸光物質(zhì)的濃度,g/L,mol/Lk比例常數(shù)入射光波長物質(zhì)的性質(zhì)溫度取值與濃度的單位相關(guān)c：mol/Lk

摩爾吸光系數(shù)，L·mol–1·cm-1c：g/Lk

a吸光系數(shù)，L·g–1·cm-1c：g/100mLk

比吸光系數(shù)相互關(guān)系例：氯霉素摩爾吸光系數(shù)的測定

稱取該物質(zhì)的純品配制成100ml含2.00mg的水溶液，以蒸餾水為空白，在1cm厚的吸收池中于278nm處，測得百分透光率為24.3。（已知M＝323.15）注意：1.吸光系數(shù)的測定不能在高濃度的溶液中進(jìn)行。2.必須應(yīng)用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品（物質(zhì)的純品）進(jìn)行測定。3.吸光系數(shù)是物質(zhì)的特性常數(shù)，與溶液的濃度無關(guān)。解：

討論：1）k=f（組分性質(zhì)，溫度，溶劑，λ）當(dāng)組分性質(zhì)、溫度和溶劑一定，k=f（λ）2）不同物質(zhì)在同一波長下k可能不同（選擇性吸收）同一物質(zhì)在不同波長下k一定不同3）k↑，物質(zhì)對光吸收能力↑,靈敏度↑吸收定律與吸收光譜的關(guān)系A(chǔ)C吸光定律A或吸收光譜AC

max三維譜圖討論:Lamber-Beer定律1．Lamber-Beer定律的適用條件（前提）入射光為單色光溶液是稀溶液2．適用范圍：該定律適用于固體、液體和氣體樣品（均勻介質(zhì)）3．在同一波長下，各組分(不相互影響)吸光度具有加和性應(yīng)用：多組分測定吸光的加合性多組分體系中，如果各組分之間無相互作用，其吸光度具有加合性，即對吸收定律偏離AC主要原因吸光質(zhì)點的相互作用——化學(xué)因素非單色光——光學(xué)因素

三、偏離Beer定律的因素(一)化學(xué)因素Beer定律適用的一個前提：稀溶液濃度過高會使c與A關(guān)系偏離Beer定律隨著溶液濃度的改變，溶液中的吸光物質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合、溶劑化以及配合物生成等的變化，使吸光物質(zhì)的存在形式發(fā)生變化，影響物質(zhì)對光的吸收能力，因而偏離Beer定律。質(zhì)點間相互作用c吸收質(zhì)點間隔變化例重鉻酸鉀的水溶液中存在下列平衡：

Cr2O72-

＋H2O=CrO42-

＋2H＋

若將溶液嚴(yán)格地稀釋2倍，則溶液中Cr2O72－離子的濃度不是恰好減少為原來的一半，而是受稀釋平衡向右移動的影響，Cr2O72－離子濃度的減少多于原來的一半，結(jié)果導(dǎo)致偏離Beer定律而產(chǎn)生誤差。例：聚合引起的對吸光定律的偏離（亞甲藍(lán)陽離子水溶液）2max=660nm二聚體：max=610nmACmax=660nm單體：A660nm610nm（二）光學(xué)因素

1．非單色光的影響：

Beer定律應(yīng)用的重要前提——入射光為單色光照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來的光具一定的波長寬度討論：結(jié)論：選擇較純單色光（Δλ↓，單色性↑）選λmax作為測定波長（Δε↓，測量誤差↓，且成線性）成線性關(guān)系A(chǔ)與c不成線性關(guān)系，偏離Beer定律A與c偏離線性關(guān)系越嚴(yán)重2．雜散光的影響：雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠(yuǎn)雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變化。雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成3．反射光和散射光的影響：反射光和散射光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光直接對T產(chǎn)生影響散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形注：一般可用空白對比校正消除4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形(三)透光率的測量誤差——ΔT影響測定結(jié)果的相對誤差有兩個因素：T和ΔT

由圖可見：1）當(dāng)ΔT一定，T較大和較小時，Δc/c均較大；2）T在65%-20%（即A為0.2-0.7）時，由T引起的RE較小；3）當(dāng)T=e-1=0.368,即A=0.434時，RE最小。1.在符合朗伯特-比爾定律的范圍內(nèi)，溶液的濃度、最大吸收波長、吸光度三者的關(guān)系是（）習(xí)題：2.在紫外可見分光光度法測定中，使用參比溶液的作用是（）3.掃描K2Cr2O7硫酸溶液的紫外-可見吸收光譜時，一般選作參比溶液的是（）

4.某分析工作者，在光度法測定前用參比溶液調(diào)節(jié)儀器時，只調(diào)至透光率為95.0%，測得某有色溶液的透光率為35.2%，此時溶液的真正透光率為（）

5.某物質(zhì)的吸光系數(shù)與下列哪個因素有關(guān)（）

6.假定ΔT=±0.50％A=0.699則測定結(jié)果的相對誤差為（）

10-4分析應(yīng)用一、定性分析

二、純度檢查三、定量分析四、結(jié)構(gòu)分析

一、定性分析

1、對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)

2、對比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值

假設(shè)某物質(zhì)X有兩個吸收峰1和2，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，使?jié)舛认嗤t：

標(biāo)準(zhǔn)溶液：A1/A2=C，ε1/ε2=D樣品溶液：A1/A2=c，ε1/ε2=d

★如果兩者為同一物質(zhì)，則C、D理論上應(yīng)等于c、d

3.對比吸收光譜的一致性

同一測定條件下，與標(biāo)準(zhǔn)對照物譜圖或標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照比較。

二、純度檢查1．雜質(zhì)檢查1）峰位不重疊：

找λ→使主成分無吸收，雜質(zhì)有吸收→直接考察雜質(zhì)含量2）峰位重疊：

主成分強(qiáng)吸收，雜質(zhì)無吸收/弱吸收→與純品比較，ε↓；

雜質(zhì)強(qiáng)吸收>>主成分吸收→與純品比較，ε↑，光譜變形2．雜質(zhì)限量檢測：例：腎上腺素中微量雜質(zhì)——腎上腺酮含量計算

2mg/mL—0.05mol/L的HCl溶液，λ310nm下測定.規(guī)定A310≤0.05,即符合要求的雜質(zhì)限量≤0.06%。已知，腎上腺酮為435，比色皿厚度為1cm。？三、定量分析依據(jù)：Lambert-Beer定律

波長選擇原則：

①最大吸收峰；

②無其他雜質(zhì)干擾的吸收峰；

③不選靠短波長末端的吸收峰；

（一）單組分分析1、吸光系數(shù)法（絕對法）例：精密稱取VB12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測定吸光度為0.507，求VB12的百分含量？已知，VB1在361nm的為207.解:

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法AC在同條件下，分別測量其吸光度值。3、標(biāo)準(zhǔn)對照法例：VB12的含量測定精密吸取VB12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對照液，精密稱定對照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測定吸光度為0.508和0.518，求VB12注射液注射液的濃度以及標(biāo)示量的百分含量（該B12注射液的標(biāo)示量為100μg/mL）解:（二）多組分分析

由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測定多個組份。1、解線性方程組法步驟：

消除a的影響測b2.雙波長法---等吸收波長法消去b的影響測a

注：須滿足兩個基本條件選定的兩個波長下干擾組分具有等吸收點選定的兩個波長下待測物的吸光度差值應(yīng)足夠大2.雙波長法---系數(shù)倍率法步驟：b曲線上任找一點→λ1

另一點→λ2優(yōu)點：同時將待測組分和干擾組分放大信號K倍，提高了待測組分測定靈敏度abλ1

λ2系數(shù)倍率3.導(dǎo)數(shù)光譜法

根據(jù)Lambert-Beer定律A=εbc，因僅只有A和ε是波長λ的函數(shù)，故對波長λ進(jìn)行n階求導(dǎo)后可得

隨導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，峰形越來越尖銳，因而導(dǎo)數(shù)光譜法分辨率高（右圖）。吸收峰數(shù)為：導(dǎo)數(shù)階數(shù)+1，即n+1導(dǎo)數(shù)光譜曲線峰值的測量有基線法、峰谷法及峰零法。①基線法（切線法）：測量相鄰兩峰（或谷）中間峰谷到其公切線的距離（t）；②峰谷法：測量相鄰峰谷間的距離p；③峰零法：測量峰到基線之間的垂直距離（z）

(三)顯色反應(yīng)及其顯色條件的選擇(可見分光光度法)有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測定UV-VIS官能團(tuán)弱吸收衍生化反應(yīng)UV-VIS顯色反應(yīng)無機(jī)物質(zhì)通常通過顯色反應(yīng)生成吸光系數(shù)大的有色物質(zhì)進(jìn)行測定，以提高靈敏度可見分光光度法—能夠吸收可見光的有色溶液的測定方法，又稱比色法。+選用的顯色劑應(yīng)只與被測組分發(fā)生顯色反應(yīng)，在測定波長處無明顯吸收；顯色反應(yīng)產(chǎn)物的組成及性質(zhì)要穩(wěn)定，ε要相對較大。顯色反應(yīng)條件的選擇：顯色劑用量、溶液酸度的控制、測量波長的選擇、空白溶液的選擇

注意：顯色劑的用量M+nR=MRn定量反應(yīng)實際工作中，作A~cR曲線，尋找適宜cR范圍。cRcRcR酸度的選擇酸度的影響副反應(yīng)M+nR=MRnOH-H+存在型體的變化RH=R-

+H+

12生成不同配比的絡(luò)合物例，磺基水楊酸–Fe3+pH=2~3FeR紫紅色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黃色酸度的選擇理論計算以作圖可得適宜pH范圍實際工作中，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。ApHM+nR=MRnOH-H+測量波長的選擇選擇適當(dāng)?shù)臏y量波長

原則：吸收最大，干擾最小，準(zhǔn)確度高

選擇沒有吸收干擾、吸光度較大而且峰頂比較平坦的最大吸收波長。

選擇適宜空白溶液

I0It參比樣品IrI0′I0′Ir參比溶液Ia空白溶液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進(jìn)行討論M+R=M-Rmax試液 顯色劑溶劑吸光物質(zhì)參比液組成無吸收無吸收光學(xué)透明溶劑基質(zhì)吸收無吸收吸收不加顯色劑的試液無吸收吸收吸收顯色劑+溶劑基質(zhì)吸收吸收吸收吸收試劑空白若欲測M-R的吸收maxA（樣）=A（待測吸光物質(zhì)）

+

A（干擾）+A（池）A（參比）

=

A（干擾）+A（池）

選擇適當(dāng)?shù)娜軇?/p>

紫外-可見光譜一般是在相當(dāng)稀的溶液(10-2～10-6mol/L)中測定的。在選擇溶劑時需注意：

(1)溶質(zhì)易溶，兩者不發(fā)生化學(xué)作用；(2)具有適當(dāng)?shù)姆悬c，在測量過程中溶劑的揮發(fā)不至于明顯影響樣品的濃度；(3)具有適當(dāng)?shù)耐腹夥秶?，不影響樣品吸收曲線的測定。(4)價廉易得，使用后易回收。溫度的選擇實際工作中，作A~T曲線，尋找適宜反應(yīng)溫度。反應(yīng)時間的選擇實際工作中，作A~t曲線，尋找適宜反應(yīng)時間。習(xí)題：1.雙波長分光光度計的輸出信號是（）2.在比色法中，顯色反應(yīng)的顯色劑選擇原則錯誤的是（）3.用分光光度法測定KCl中的微量I-時，可在酸性條件下，加入過量的KMnO4將I-氧化為I2，然后加入淀粉，生成I2-淀粉藍(lán)色物質(zhì)。測定時參比溶液應(yīng)選擇（）

4.今有A和B兩種藥物的復(fù)方制劑溶液，其吸收曲線相互不重疊，下列有關(guān)敘述正確的是（）

5.精密稱取試樣0.0500g，用0.02mol/LHCl稀釋，配制成250mL。準(zhǔn)確吸取2.00mL，稀釋至100mL，以0.02mol/LHCl為空白，在253nm處用1cm吸收池測得T＝41.7％，其ε＝12000L/molcm)，被測組分的分子質(zhì)量＝100.0，試計算（263nm）和試樣中被測組分的百分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。？四、結(jié)構(gòu)分析（一）有機(jī)化合物的紫外吸收

1、飽和碳?xì)?/p>

σ→σ*

200nm~400nm無吸收

2、含孤立助色團(tuán)和生色團(tuán)的飽和有機(jī)化合物

孤立助色團(tuán):-X、-OH，n→σ*吸收峰比σ→σ*長移。

如：CH3X（Cl、Br、I的λmax分別為173、204和258nm）

孤立生色團(tuán):-C=C、-C=O，-C=N，-COOH，π→π*，λmax：150~180nm，ε大

n→π*，λmax：240nm~400nm，ε小3.共軛烯烴

共軛雙鍵π→π*吸收峰長移，ε增加4.α,β不飽和醛、酮、酸、酯

雙鍵和羰基未共軛

π→π*200nmn→π*280nmπ→π*200左右α，β不飽和醛、酮共軛使：π→π*長移至200~260nm，ε約104

n→π*長移至310~350nm，ε＜100溶劑極性增加：π→π*

長移

n→π*

藍(lán)移α,β不飽和酸、酯

羰基碳連有未共用電子對的助色團(tuán)(-CO-OH,-CO-OR)，使π，π*軌道能級提高，但π軌道提高更大，n軌道能量不變。則：π→π*長移，n→π*短移K

K

R

R

n

5、芳香族化合物

⑴苯、取代苯

苯：E1、E2、B帶(氣態(tài)或在非極性溶劑中，呈現(xiàn)精細(xì)結(jié)構(gòu))

取代苯：絕大多數(shù)取代基都使E1、E2、B帶長移，ε增大，B帶精細(xì)結(jié)構(gòu)減少。取代基紅移影響的順序：供電子基：CH3＜Cl＜Br＜OH＜OCH3＜NH2＜O＜NHCOCH3＜NCH3

吸電子基：

NH3+＜SO2NH2

＜COO-

＜CN-

＜COOH＜CHO＜NO2

助色團(tuán)取代：n－π共軛，E2、B帶明顯長移，ε增加

生色團(tuán)取代：π－π共軛，200~250nm處出現(xiàn)K帶，可能出現(xiàn)R帶.

⑵芳雜環(huán)化合物

五元芳雜環(huán)化合物：相當(dāng)于環(huán)戊二烯的CH2被雜原子取代，其UV譜與環(huán)戊二烯相似，在200nm和238nm有兩個吸收峰。六元芳雜環(huán)化合物：與苯相似,但溶劑的極性對苯影響較小，對六元雜環(huán)化合物影響較強(qiáng)。(3)稠環(huán)化合物稠環(huán)芳烴均顯示苯的三個吸收帶，與苯本身相比，這三個吸收帶均發(fā)生紅移，且ε增大。

隨著苯環(huán)數(shù)目的增多，吸收波長紅移越多，ε相應(yīng)增大。紫外—可見吸收光譜中有機(jī)物結(jié)構(gòu)分析的一般規(guī)律是：

⑴若在200～750nm波長范圍內(nèi)無吸收峰，則可能是直鏈烷烴、環(huán)烷烴、飽和脂肪族化合物或僅含一個雙鍵的烯烴等。⑵若在240～350nm波長范圍內(nèi)有低強(qiáng)度吸收峰(ε＝10～100L·mol-1·cm-1),（n→π*躍遷），則可能含有一個簡單非共軛且含有n電子的生色團(tuán)，如-C=O。（二）有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)研究了解可能的存在基團(tuán)，不能確定結(jié)構(gòu)；可對飽和與不飽和化合物、異構(gòu)體及構(gòu)象進(jìn)行判別(特點)。1.從吸收光譜中初步推斷官能團(tuán)

⑶若在250～300nm波長范圍內(nèi)有中等強(qiáng)度的吸收峰，伴有振動精細(xì)結(jié)構(gòu)，說明含苯環(huán)。⑷若在210～250nm波長范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，則可能含有2個共軛雙鍵；若在260～300nm波長范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，則說明該有機(jī)物含有3個或3個以上共軛雙鍵。⑸若該有機(jī)物的吸收峰延伸至可見光區(qū)，則該有機(jī)物可能是長鏈共軛或稠環(huán)化合物。(6)加NaOH紅移→酚類化合物，烯醇；加HCl藍(lán)移→苯胺類化合物。2、異構(gòu)體的推斷（1）順反異構(gòu)體

順式二苯乙烯λmax

208nm反式二苯乙烯λmax295.5nmλmax＝214＋5＋4×5＝239nm（實測238nm)λmax＝253＋5×5＝278nm（實測273nm)Woodward-Fieser規(guī)則？（2）互變異構(gòu)體互變異構(gòu)：

酮式：λmax=272nm，ε：16

烯醇式：λmax=243nm

,ε：16000？3、化合物骨架的推測維生素K11，4-萘醌λmax：249nm（lgε為4.28）；260nm（lgε為4.26）；325nm（lgε為3.28）λmax：250nm（lgε為4.60）；330nm（lgε為3.8）未知化合物與已知化合物的UV-Vis吸收光譜一致時，可認(rèn)為兩者具有同樣的發(fā)色基團(tuán)。很據(jù)這個原理可以推斷一些未知化合物的骨架。一、工作原理及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源碘鎢燈氘燈單色器測量池參比池樣品池光電管數(shù)據(jù)處理和儀器控制光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制10-5紫外-可見分光光度計紫外-可見分光光度計組件光源單色器樣品池檢測器信號輸出氫燈，氘燈，185~350nm；鹵鎢燈，250~2000nm.基本要求：光源強(qiáng)，能量分布均勻，穩(wěn)定作用：將復(fù)合光色散成單色光棱鏡光柵

玻璃，350~2500nm,石英，185~4000nm平面反射光柵玻璃，光學(xué)玻璃，石英作用：將光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并放大光電管，光電倍增管，光電二極管，光導(dǎo)攝像管（多道分析器）表頭、記錄儀、屏幕、數(shù)字顯示二、主要部件1.光源（輻射源）（1）光源的要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜;光輻射強(qiáng)度隨波長的變化小;有足夠的使用壽命．鎢燈（鎢的熔點為3680K）；波長范圍：320~2500nm；工作溫度：3000K；

Ihv∝

V3~4．（2）白熾光源常用類型：白熾光源與氣體放電光源．鹵鎢燈：250~2500nm，在鎢燈中加入鹵化物提高白熾燈的使用壽命．（3）氣體放電光源氫弧燈（氫燈）：波長范圍：165~350nm；氫氣壓力：0.2~5mmHg。氘燈：內(nèi)充氣為氘輻射強(qiáng)度比氫燈強(qiáng)3~5倍。2.單色器

單色器是將光源輻射的復(fù)合光分成單色光的光學(xué)裝置。它是分光光度計的心臟部分。單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統(tǒng)組成。關(guān)鍵是色散元件，最常見的色散元件是棱鏡和光柵。狹縫：將單色器的散射光切割成單色光。直接關(guān)系到儀器的分辨率。狹縫越小，光的單色性越好。分為入射狹縫和出射狹縫。棱鏡:玻璃350～3200nm，石英185～4000nm。光柵:波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便。

1.入射狹縫2.準(zhǔn)直透鏡3.棱鏡4.聚焦棱鏡5.出射狹縫3.樣品池：吸收池、比色皿。

吸收池的材料玻璃360nm2.25mm石英200nm2.5mm吸收池的形狀波長范圍使用注意事項容易破碎可拆卸圓形測量池兩面透光圓形測量池兩面透光1cm長方形測量池兩面透光氣體測量池兩面透光微量測量池兩面透光流動測量池兩面透光4.檢測器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。要求靈敏度