杜仲成分的提取與分離

一杜仲是我國(guó)特有的一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、治療心血管疾病等生物活性，其藥用價(jià)值歷來(lái)受到人們的關(guān)注［1］。在早期的報(bào)道中主要是針對(duì)杜仲皮的研究，但是杜仲皮取材困難、成本高。大量現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)了杜仲葉與皮的化學(xué)成分基本一致，具有同等功效，特別是綠原酸和黃酮的含量遠(yuǎn)高于皮中的含量，因此，對(duì)產(chǎn)量高、價(jià)格便宜的杜仲葉中有效成分進(jìn)行研究具有一定的實(shí)用價(jià)值。筆者研究NKA-II樹(shù)脂對(duì)杜仲葉中綠原酸和黃酮類化合物吸附和分離的效果，并對(duì)其分離工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為杜仲葉相關(guān)產(chǎn)品的深開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)提供參考。4二，Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，UNICOUV-2102PC型分光光度計(jì)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），其它試劑均為分析純。1.2樣品預(yù)處理及測(cè)定方法1.2.1樣品預(yù)處理用70%乙醇水溶液作為提取劑，按照料液比1:12,pH值為4,每次提取25min,提取3次，合并濾液并濃縮至無(wú)醇味后，冷凍干燥，得到杜仲葉粗提物，在干燥避光條件下保存。1.2.2綠原酸及總黃酮的測(cè)定紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定綠原酸的含量［3］和總黃酮的含量［2］。1.2.3高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)杜仲葉分離產(chǎn)物色譜條件色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18（100mmX2.1mm,1.7|im）（美國(guó)WATERS公司）；柱溫25°C;流速0.35mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)365nm；進(jìn)樣量5UL；流動(dòng)相采用梯度洗脫。1.3樹(shù)脂的選擇采用9種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)杜仲葉中綠原酸、總黃酮的吸附-解吸分離性能進(jìn)行研究，可為規(guī)?；蛛x綠原酸、總黃酮提供理論依據(jù)。1.4大孔樹(shù)脂預(yù)處理先將各種樹(shù)脂分別用蒸餾水溶脹12h后浮選，然后用95%乙醇浸泡24h后，用蒸餾水洗至無(wú)渾濁現(xiàn)象，無(wú)醇味為止。再用1mol/LNaOH溶液浸泡24h,用蒸餾水洗至中性。然后用1mol/LHCl浸泡24h,用蒸餾水洗至中性。最后用20%乙醇浸泡儲(chǔ)備。1.5靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)首先對(duì)9種大孔樹(shù)脂的吸附量、吸附率和解吸率進(jìn)行測(cè)定［5］,其次分別考察吸附液pH值和不同乙醇濃度對(duì)NKA-11樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響［6］。1.6動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)在室溫下，根據(jù)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)的條件,考察上柱液流速、上柱液濃度、洗脫劑流速對(duì)NKA-II樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能的影響，作動(dòng)態(tài)吸附曲線和洗脫曲線，確定最佳動(dòng)態(tài)吸附-洗脫工藝條件。1.7擴(kuò)大試驗(yàn)及高效液相色譜檢測(cè)稱取5kg杜仲葉，先用NKA-II大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離，將30%、50%、70%的乙醇洗脫液分別濃縮，再用聚酰胺樹(shù)脂和SephadexLH-20樹(shù)脂進(jìn)行純化，最后將分離純化的產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，操作條件見(jiàn)1.2.3。2結(jié)果與分析2.1大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)2.1.1大孔吸附樹(shù)脂對(duì)綠原酸、總黃酮的靜態(tài)吸附效果比較試驗(yàn)所用樹(shù)脂有極性、弱極性、非極性三種類型，這9種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)綠原酸、總黃酮的靜態(tài)吸附-解吸情況見(jiàn)表2。從表2可以看出，NKA-II在靜態(tài)飽和吸附時(shí)對(duì)綠原酸、總黃酮不僅具有較高的吸附量，而且解吸率也較高，所以確定NKA-II為最佳樹(shù)脂，并進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)。NKA-II樹(shù)脂對(duì)綠原酸、總黃酮的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線在給予充分時(shí)間吸附的情況下，由圖1可見(jiàn)，綠原酸和總黃酮在NKA-II樹(shù)脂上的動(dòng)力第12期張玲等：杜仲葉綠原酸總黃酮的分離純化及檢測(cè)123表3上柱液濃度對(duì)NKA-II樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響上樣液濃度1/20C0圖4不同乙醇濃度對(duì)NKA-II樹(shù)脂靜態(tài)解吸的影響學(xué)過(guò)程如下：在起始階段吸附速率較大；但4h之后，樹(shù)脂基本達(dá)到吸附平衡；隨著吸附時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，吸附量的增加速率減小。根據(jù)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，NKA-II樹(shù)脂對(duì)杜仲葉粗提物中綠原酸和總黃酮的吸附屬于快速平衡型樹(shù)脂。2.1.3吸附等溫線將濃度為CO的杜仲葉粗提物溶液（含綠原酸3.734mg/mL和總黃酮14.018mg/mL）分別稀釋成不同濃度的靜態(tài)吸附液，稱取5.000g（干基）的NKA-II樹(shù)脂，振蕩條件同文獻(xiàn)[4],計(jì)算吸附率，作吸附等溫線，結(jié)果見(jiàn)圖2。吸附等溫線的初始階段幾乎呈線性的，表明低濃度上樣液中的活性成分可以在樹(shù)脂中高度擴(kuò)散。當(dāng)樹(shù)脂表面形成分子層吸附飽和后，溶液中的黃酮化合物在外層再以氫鍵的方式與表面吸附的黃酮吸附，但由于孔容的限制，所以存在一個(gè)極限，這與李云志等［7］和李瑩等［8］研究顯示的現(xiàn)象一致。由圖可知，當(dāng)總黃酮的平衡濃度為5.93mg/mL時(shí)達(dá)飽和吸附，總黃酮的飽和吸附量為91.75mg/g樹(shù)脂。2.1.4吸附液的pH值對(duì)NKA-II樹(shù)脂吸附的影響由圖3看出，在pH值為4時(shí)，NKA-II樹(shù)脂對(duì)綠原酸和黃酮類化合物的吸附率均達(dá)到最大，說(shuō)明在此條件下，綠原酸和黃酮類化合物均以分子形式存在，較穩(wěn)定，故吸附效果最好。當(dāng)酸性較強(qiáng)時(shí)，易形成“佯鹽”；在偏堿性時(shí)，分子中酚羥基H+易失去，形成離子結(jié)構(gòu)，不易被吸附。2.1.5不同乙醇濃度對(duì)NKA-II樹(shù)脂靜態(tài)解吸的影響圖4表明，靜態(tài)解吸效果隨著乙醇水溶液體積分?jǐn)?shù)的提高而增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到70%時(shí)，解吸平衡。同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低濃度乙醇溶液有利于綠原酸類化合物的解吸，而高濃度乙醇溶液則有利于黃酮類化合物的解吸，說(shuō)明采用梯度洗脫有利于綠原酸與黃酮類化合物的分離。NKA-II樹(shù)脂對(duì)綠原酸、總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附性能2.2.1NKA-II樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附滲透曲線將含綠原酸和總黃酮濃度分別為0.901mg/mL和3.441mg/mL的上樣液以1.0mL/min流速上柱，直至樹(shù)脂吸附飽和為止。以一個(gè)柱體積為單位收集流出液，測(cè)定流出液中綠原酸、總黃酮的濃度C'，C為上樣液濃度，用C'/C表示滲透系數(shù)，繪制吸附滲透曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。流出液的濃度達(dá)到進(jìn)樣液濃度的1/10時(shí)（即C'/C=0.1）時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到吸附的穿透點(diǎn)，停止進(jìn)樣，表明此條件下，上樣量不應(yīng)超過(guò)10倍的柱體積。2.2.2上柱液濃度對(duì)NKA-II樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響將濃度為C0（含綠原酸9.012mg/mL,含總黃酮34.406mg/mL）的上樣液用水稀釋成不同濃度，分別取等體積的不同濃度的上柱液，在相同的流速下，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，檢測(cè)上柱液濃度對(duì)大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。大孔吸附樹(shù)脂的吸附量通常與上樣液濃度成反比，在相同流速和相同吸附時(shí)間下，若上柱液濃度過(guò)大，由于孔容的限制，存在一個(gè)吸附極限，所以會(huì)有更多的有效物質(zhì)未被充分吸附而流出。考慮到124湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)第12期張玲等：杜仲葉綠原酸總黃酮的分離純化及檢測(cè)表4吸附流速對(duì)NKA-II樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響（％）流速圖6NKA-II樹(shù)脂對(duì)綠原酸、總黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫曲線一般泄漏率不應(yīng)大于10%，因此上柱液濃度應(yīng)小于2/10C0。2.2.3吸附流速對(duì)NKA-II樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響吸附流速主要影響溶質(zhì)向樹(shù)脂表面擴(kuò)散，從而決定了吸附效果。如果吸附流速過(guò)大，就會(huì)使樹(shù)脂的吸附量下降；如果流速過(guò)小，則生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，效率降低。由于泄漏點(diǎn)不應(yīng)大于0.1，根據(jù)表4數(shù)據(jù)顯示，流速選擇0.8?1.5mL/min較好，故試驗(yàn)選擇1.0mL/min,此時(shí)綠原酸的吸附量是13.18mg/g,總黃酮的吸附量是47.66mg/g。NKA-II樹(shù)脂對(duì)杜仲葉粗提物實(shí)際的動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)NKA-II樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附滲透曲線見(jiàn)圖5。根據(jù)已確定的最佳吸附-洗脫條件,采用乙醇-水為洗脫體系,進(jìn)行梯度洗脫,部分收集各段餾分,洗脫曲線見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示：1?6管為水洗洗脫液,其中主要含有多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等大分子物質(zhì)；7?14管為30%乙醇洗脫液,主要含綠原酸類等強(qiáng)極性物質(zhì)；15?32管為50%乙醇洗脫液,主要含與蘆丁極性相似的黃酮類化合物；33?53管為70%乙醇洗脫液，含有大量極性較弱的黃酮類化合物，如槲皮素、槲皮苷等；54?70管為95%的高濃度乙醇洗脫液，將大孔樹(shù)脂中殘留的弱極性脂溶性物質(zhì)去除。2.4杜仲葉有效成分的純化根據(jù)最佳吸附-解吸條件，進(jìn)行擴(kuò)大試驗(yàn)，分別將30%、50%、70%的乙醇洗脫液濃縮，冷凍干燥后，采用聚酰胺樹(shù)脂和SaphadexLH-20樹(shù)脂純化得到4種組分，經(jīng)過(guò)高效液相色譜檢測(cè)，各組分的峰面積比均超過(guò)95%。將杜仲葉分離產(chǎn)物的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間對(duì)照，經(jīng)薄層層析結(jié)果分析、紫外光譜檢測(cè)，參考張培成，田燕［7-8］的報(bào)道，可以判斷筆者研究所分離的4種組分可能為：綠原酸、金絲桃苷或陸地錦苷、槲