實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌涂片的制備和染色鏡檢

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌涂片的制備和染色鏡檢第一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌染色的目的意義：細(xì)菌菌體微小、而且折光率低，在顯微鏡下特別是在油浸物鏡下幾乎與背景無(wú)反差，很難看清楚，如將其染色，使折光率增大，便容易觀察。由于菌體的性質(zhì)及各部分對(duì)某些染料的著色性不同，因此可以利用不同的染色方法來(lái)區(qū)別不同的細(xì)菌及其結(jié)構(gòu)。第二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日染色劑分類：堿性染色劑：（電離后分子帶正電荷）；堿性染色劑主要用于染核和異染顆粒等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。酸性染色劑：（電離后分子帶負(fù)電荷）；酸性染色劑主要用于染細(xì)胞質(zhì)。復(fù)合染色劑：（在電離后分子不帶電荷，故也稱為中性染色劑）；復(fù)合染色劑主要用來(lái)染螺旋體和立克次體。第三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

涂片染色程序：

涂片自然干燥固定染色干燥鏡檢

第四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌涂片示例：

水第五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、

細(xì)菌抹片的制備：玻片準(zhǔn)備：透明、潔凈、無(wú)油漬。抹片：液體材料、非液體材料、組織臟器材料的抹片方法講解、示范。干燥固定：火焰固定和化學(xué)固定的示范。講解其目的及注意事項(xiàng)。2、

細(xì)菌涂片的制備：講解并示范涂片、干燥、固定的方法。3、

細(xì)菌常用染色方法：革蘭氏染色法

細(xì)菌涂（抹）片的制備和革蘭氏染色

細(xì)菌抹片的制備第六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日革蘭氏染色法：

1.制片：取待檢病料或細(xì)菌培養(yǎng)物常規(guī)抹（涂）片、干燥、固定。

2.初染：滴加結(jié)晶紫，染色1-2分鐘，水洗。

3.媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1分鐘，水洗。

4.脫色：用濾紙吸取或甩去載玻片上的殘水，將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)（20—30秒），立即水洗。

5.復(fù)染：用復(fù)紅液復(fù)染約2分鐘，水洗。

6.鏡檢：用濾紙吸水，干燥后，顯微鏡油鏡觀察。第七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日革蘭染色步驟涂片草酸銨結(jié)晶紫

碘液95%酒精稀釋的石炭酸復(fù)紅自然干燥媒染2-3min脫色20~30s固定初染1-2min復(fù)染10~30s干燥

鏡檢接種環(huán)蒸餾水滴水第八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日革蘭染色時(shí)注意事項(xiàng)：

1、要用幼齡培養(yǎng)物作革蘭染色；

2、涂片不宜太厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性第九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日革蘭陽(yáng)性菌：細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，經(jīng)乙醇處理發(fā)生脫水作用，使孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫與碘形成的大分子復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。

革蘭陰性菌：細(xì)胞壁肽聚糖層薄，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，類脂含量較高，經(jīng)乙醇處理后，類脂被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大，通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁，因而細(xì)菌細(xì)胞被脫色，再經(jīng)石炭酸復(fù)紅復(fù)染后細(xì)胞呈紅色。

第十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日革蘭氏染色法原理：

革蘭氏染色法將細(xì)菌分為G＋和G-，這由兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成的不同而決定。用結(jié)晶紫初染后，所有的細(xì)菌都染上藍(lán)紫色。碘作為媒染劑能與結(jié)晶紫結(jié)合形成結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物，增強(qiáng)了染料與菌體的結(jié)合力。用乙醇脫色處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。G＋細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，且壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色時(shí)使細(xì)胞壁脫水、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，通透性降低，使得結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)。雖經(jīng)洗脫和復(fù)染仍然保持初染劑的藍(lán)紫色。G-細(xì)菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以在脫色處理時(shí)，類脂被乙醇溶解，細(xì)胞壁的通透性增大，使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來(lái)，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的顏色。

第十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日革蘭氏染色法過(guò)程示意圖革蘭氏染色法動(dòng)畫第十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日第十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日第十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日涂片干燥固定染色1~2min水洗、吸干鏡檢細(xì)菌的單染色第十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日顯微鏡放大法——細(xì)菌形體微小，肉眼不能直接看到，必須借助顯微鏡（普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡）放大后才能觀察。染色法——細(xì)菌體小半透明，經(jīng)染色后才能觀察較清楚。細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查法第十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日普通光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.25um。一般細(xì)菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀察。普通光學(xué)顯微鏡(lightmicroscope)顯微鏡放大法第十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日電子顯微鏡的分辨率為1nm。不僅能看清細(xì)菌的外形，內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)可一覽無(wú)余。電子顯微鏡(electronmicroscope)肺炎鏈球菌莢膜莢膜顯微鏡放大法第十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日透射電鏡掃描電鏡第十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌的大小與形態(tài)觀察細(xì)菌常用光學(xué)顯微鏡，其大小用測(cè)微尺在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)量，以微米(μm)為單位。不同種類的細(xì)菌大小不一，同一種細(xì)菌也因菌齡和環(huán)境因素的影響而有差異。細(xì)菌按其外形，主要有球菌桿菌螺形菌第二十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日球菌(coccus)腦膜炎奈瑟菌雙球菌(diplococcus)肺炎鏈球菌第二十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日鏈球菌(streptococcus)球菌(coccus)第二十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日球菌(coccus)葡萄球菌(streptococcus)第二十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日球菌(coccus)四聯(lián)球菌(tetrad)第二十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日球菌(coccus)八疊球菌(sarcina)第二十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日桿菌(bacillus)不同桿菌的大小、長(zhǎng)短、粗細(xì)很不一致。炭疽芽胞桿菌3-10μm大中大腸埃希菌2-3μm小布魯菌0.6-1.5μm第二十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日桿菌的形態(tài)多樣桿菌(bacillus)兩端齊平炭疽芽胞桿菌兩端尖細(xì)白喉棒狀桿菌第二十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日桿菌(bacillus)桿菌的形態(tài)多樣分枝桿菌雙歧桿菌第二十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日螺形菌(spiralbacterium)弧菌螺菌螺桿菌第二十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌抗酸性染色第三十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日特殊染色法

是對(duì)細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色的方法。包括芽胞染色、莢膜染色、鞭毛染色等。第三十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日芽胞染色原理：細(xì)菌的芽孢壁比營(yíng)養(yǎng)體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且致密，透性低，著色和脫色都比營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞困難。第三十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日方法：采用堿性染料微加熱著染或延長(zhǎng)染色時(shí)間，使?fàn)I養(yǎng)體（菌體）和芽胞都著色后，再脫去營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的顏色而