生物化學(xué)：2蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)分離純化及蛋白質(zhì)測(cè)定方法及評(píng)價(jià)一、蛋白質(zhì)分離純化方法研究蛋白質(zhì)或酶的物理及化學(xué)性質(zhì),首先需進(jìn)行純化

若要研究蛋白質(zhì)或酶的主體結(jié)構(gòu)及酶的活性中心,催化反應(yīng)機(jī)理等,則還需清除最后殘留在分子中的微量其它蛋白和大分子化合物分離蛋白質(zhì)及酶類要顧及最大的生產(chǎn)量要顧及最大的催化活性要使蛋白及酶純度盡可能達(dá)到最高1.蛋白質(zhì)分離純化的技術(shù)路線設(shè)計(jì)及條件蛋白質(zhì)的分離純化不可能有一個(gè)固定的程序適用于各種蛋白質(zhì)的分離制備工作。蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo)是增加制品的純度（purity）或比活（specificactivity）蛋白質(zhì)分離要點(diǎn):1.爭(zhēng)取時(shí)間2.能簡(jiǎn)則簡(jiǎn)親和層析電泳分離蛋白純品精分離粗分離前處理凝膠層析生物體組織細(xì)胞離心分離鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)粗制品蛋白質(zhì)粗抽提液組織粉碎細(xì)胞裂解蛋白釋放DNA釋放離子交換層析

蛋白質(zhì)分離純化的一般技術(shù)路線2、材料的選擇及預(yù)處理分離純化蛋白質(zhì)應(yīng)先考慮選擇適當(dāng)?shù)牟牧?。選材要依據(jù)研究、診斷的目的及遵循以下原則：一所含靶蛋白量高；二材料易得。進(jìn)行預(yù)處理：剔除不必要的結(jié)締組織、脂肪組織等；取出的組織和器官要迅速處理；精制某些易在體內(nèi)被分解的活性蛋白質(zhì)、酶或蛋白激素時(shí)，一般易用新鮮材料；培養(yǎng)的細(xì)胞中分離純化時(shí)，充分洗滌，離心收集細(xì)胞。3、細(xì)胞破碎的方法除了體液、細(xì)胞外某些靶蛋白不需要破碎細(xì)胞外，對(duì)于胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中各種蛋白質(zhì)的分離純化均需粉碎組織、裂解細(xì)胞，使蛋白質(zhì)充分釋放至裂解液中。各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法應(yīng)用Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞Ⅲ化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2表面活性劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎

使蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)及活性。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有：1.機(jī)械破碎法：利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。2.滲透破碎法：在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。3.反復(fù)凍融法：生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。4.超聲波法：使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。5.酶法：如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。四、蛋白質(zhì)的分離純化方法分離純化的方法一般有：①以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、分配層析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀和結(jié)晶等；②以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過(guò)濾層析等；③以電離性質(zhì)差異為依據(jù)的方法：電泳、離子交換層析等；④以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析。分子大?。?/p>

透析、超濾、離心、凝膠過(guò)濾分子形狀：離心，過(guò)濾主要技術(shù)溶解度：

等電點(diǎn)沉淀、鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑、溫度電荷：

電泳、離子交換層析主要技術(shù)密度：離心親和力：

親和介質(zhì)穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性、蛋白酶解穩(wěn)定性分配系數(shù)：雙水相萃取分離蛋白質(zhì)粗制品的獲得

選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜質(zhì)分離開來(lái)。常用的有下列幾種方法：

1.等電點(diǎn)沉淀法

2.鹽析法

3.有機(jī)溶劑沉淀法樣品的進(jìn)一步分離純化

凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。

有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。4.蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定

1、純度鑒定

2、活性鑒定3、濃度鑒定蛋白質(zhì)樣品的純度鑒定蛋白質(zhì)的純度（purity）：指是不含有其它雜蛋白，但不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內(nèi)。目前常用的鑒定純度的方法有：有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、毛細(xì)管電泳（CE）、等電聚焦電泳（IFE）及高效液相色譜（HPLC）。只用一種方法鑒定蛋白質(zhì)的純度是不夠的，至少應(yīng)用兩種以上的方法，而且是兩種分離原理不同的方法，來(lái)判斷蛋白質(zhì)的純度才比較可靠。最終的純度標(biāo)準(zhǔn)，唯一的氨基酸順序蛋白質(zhì)的活性定量測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定靶蛋白的含量通常要用具有高度特異性的生物學(xué)方法?；钚缘臏y(cè)定和總蛋白量的測(cè)定配合起來(lái)可以用來(lái)表示分離純化過(guò)程中某一特定靶蛋白的純化程度。純化程度常用這一特定成分的含量（一般用活力單位）與總蛋白量（質(zhì)量單位）之比來(lái)表示。定量蛋白質(zhì)有如下假定所有蛋白質(zhì)都是單純的多肽鏈，糖脂類及金屬有機(jī)物等均不計(jì)在內(nèi)，其含氮量平均為16%各種蛋白質(zhì)理化性質(zhì)雖不一樣，但與化學(xué)試劑的反應(yīng)一致采用哪一種方法，一般考慮的是準(zhǔn)確性、操作方便、影響因素少。二、蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法蛋白質(zhì)測(cè)定的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)含氮量16%重復(fù)的肽鍵結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中所含的酪氨酸和色氨酸殘基對(duì)酚試劑反應(yīng)或紫外吸收與色素的結(jié)合能力沉淀后的濁度或光折射改變（上述原理不但適合于總蛋白質(zhì)的測(cè)定，也可用于分離出來(lái)的蛋白質(zhì)組分的測(cè)定）臨床檢驗(yàn)中測(cè)定蛋白質(zhì)的幾種情況測(cè)定血清（漿）總蛋白蛋白質(zhì)電泳以獲取各類蛋白質(zhì)所占比例測(cè)定個(gè)別蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)測(cè)定一般需要一個(gè)已知蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或作為標(biāo)準(zhǔn)管與樣品同時(shí)測(cè)定。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)最古老方法當(dāng)今蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)定值方法由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測(cè)定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量凱氏定氮法

高溫,濃酸OH-蛋白質(zhì)（N）——NH4＋——NH3——硼酸吸收——用酸堿滴定或納氏試劑測(cè)定氮含量——按6.25g蛋白質(zhì)/1g氮計(jì)算蛋白質(zhì)含量

凱氏定氮法樣品消化：消化反應(yīng)方程式如下2NH3（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O蒸餾：在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3↑+Na2SO4+2H2O吸收與滴定：加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定2NH3+4H3BO3

（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3

凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，可用于動(dòng)植物的各種組織、器官及食品等組成復(fù)雜樣品的測(cè)定，但操作比較復(fù)雜，含大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果往往偏高，其他含氮物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾.

該法靈敏，準(zhǔn)確，是目前建立各個(gè)具體方法時(shí)采用的參考標(biāo)準(zhǔn)方法。雙縮脲法（Biuret）臨床上首先推薦的蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)中的肽鍵（－CONH－）在堿性溶液中能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)同兩個(gè)尿素分子縮合后生成的雙縮脲在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)形似，故稱為“雙縮脲反應(yīng)”至少含有兩個(gè)－CONH－基團(tuán)才能反應(yīng)，故二肽以上才有上述現(xiàn)象蛋白質(zhì)和多肽中的肽鍵在堿性溶液中與銅離子共熱，生成紫紅色的絡(luò)合物。顯色強(qiáng)度和蛋白濃度成正比。O=CC=ONHHNR-CHCH-RO=CC=ONHHNR-CHCH-RCu2+標(biāo)本采集病人準(zhǔn)備：無(wú)特殊要求。最好用禁食的標(biāo)本以減少乳糜血的干擾。類型：血清或血漿。標(biāo)本存放20～25℃保存可穩(wěn)定6天；4～8℃保存可穩(wěn)定4周；-20℃保存至少可穩(wěn)定1年。標(biāo)本運(yùn)輸室溫條件下運(yùn)輸參考值范圍[g/L]成人：60～80兒童/青少年男女1～30天42～62

41～631～6個(gè)月44～66

47～676個(gè)月～1歲56～79

55～701～18歲57～80

57～80（注：各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有自己的參考范圍。）參考值因性別、年齡、飲食和地域的不同而有所差別。根據(jù)好的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考值。操作簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性好，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)之間影響小。清、球蛋白產(chǎn)生的顏色反應(yīng)相近；適于自動(dòng)化分析，線形范圍：0.5--150g/L靈敏度較低100ug/ml精密度：批內(nèi)重復(fù)性小于3%，總不精密度小于3%。檢測(cè)限：0.5g/L干擾物質(zhì)：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。靜脈滴注大量右旋糖酐的病人血清或血漿，使用雙縮脲方法的檢測(cè)結(jié)果會(huì)明顯增高；

主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要非常精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

Folin-酚試劑法

（Lowry法）是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一作用機(jī)理主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)后生成藍(lán)色化合酸。蛋白質(zhì)與福林（Folin）-酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物，呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入Folin—酚試劑，以增加顯色量，提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。本法靈敏，受多種還原性物質(zhì)干擾，不同蛋白質(zhì)之間差異大Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。優(yōu)點(diǎn):靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多缺點(diǎn):費(fèi)時(shí)，需精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。注意:進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

干擾物質(zhì)：

雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDT

A，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，無(wú)需昂貴設(shè)備，適于一般實(shí)驗(yàn)室使用。靈敏度：1ug/ml此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。測(cè)定范圍是20~250mg。

干擾物質(zhì)多，反應(yīng)速度慢，不同蛋白質(zhì)間差異大，準(zhǔn)確性差。染料結(jié)合法

（dyeconjugation）酸性環(huán)境中蛋白質(zhì)分子可解離出帶有正電荷的-NH3+基團(tuán)，它可與陰離子的染料產(chǎn)生顏色反應(yīng)，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)溶液比較即可求得樣品中蛋白質(zhì)的含量染料有CBBG-250、氨基黑、麗春紅、鄰苯三酚紅－鉬酸鈉、銀、膠體金等考馬斯亮藍(lán)G-250染料結(jié)合法血清總蛋白測(cè)定最常用的染料是考馬斯亮藍(lán)G-250（CBBG-250），即Bradford法染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。

在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，在酸性條件下，CBBG-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定，最大光吸收從465nm移至595nm,呈色與蛋白質(zhì)濃度成正比。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。

（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

（3）干擾物質(zhì)少。

缺點(diǎn)：

（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。

（2）干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。

本法簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，靈敏度高，但特異性不高，MW大于3000的多肽也參與反應(yīng)，強(qiáng)堿和去垢劑會(huì)影響呈色，清、球蛋白呈色強(qiáng)度不同。紫外吸收法紫外吸收法蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基含有共軛雙鍵，在280nm處有吸收峰蛋白質(zhì)中肽鍵在220-238nm左右存在光吸收應(yīng)用：總蛋白含量測(cè)定與核酸鑒別：生物樣品中?；煊泻怂?，其最大吸收峰在260nm，因此可進(jìn)行鑒別1．A280nm光吸收法原理:蛋白質(zhì)的芳香環(huán)殘基在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)一定波長(zhǎng)的光具有選擇吸收作用。在（280mm波長(zhǎng)下，光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度（3～８mg／mL）成直線關(guān)系，因此，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的吸光度，并參照事先用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品蛋白質(zhì)含量。本法操作簡(jiǎn)便迅速2．A260nm和A280nm比值法原理凡是有共軛雙鍵的物質(zhì)，均具有紫外吸收值。因此，若樣品中含核酸，則嘌呤、嘧啶兩類堿基對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定產(chǎn)生干擾，應(yīng)加以校正。核酸在260nm處的紫外吸收值大于280nm處的紫外吸收值，但蛋白質(zhì)恰恰相反。由于不同的蛋白質(zhì)和核酸對(duì)紫外吸收不同，校正后的測(cè)定結(jié)果還存在一定的誤差。Lowry－kaleker公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260Warburg－Christian公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260Waddell公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=144×

（A215-A225）核酸對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾較正公式3．A215nm和A225nm的吸收差法原理對(duì)于蛋白質(zhì)的稀溶液，由于蛋白質(zhì)含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定，可用215nm和225nm吸收值之差求算蛋白質(zhì)濃度。方法分別測(cè)定樣品A215nm和A225nm，并求出差值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收差值作對(duì)照，求出樣品的蛋白質(zhì)含量。

本法在20～100mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。4．肽鍵紫外光測(cè)定法原理蛋白質(zhì)溶液在238nm下均有光吸收，其吸收強(qiáng)弱與肽鍵多少成正比，根據(jù)這一性質(zhì)，可測(cè)定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照，求出蛋白質(zhì)含量。本法比280nm吸收法靈敏紫外吸收法簡(jiǎn)便快速，樣本可回收再利用，但儀器昂貴，不同蛋白質(zhì)之間差異大（法1-2），且游離酪氨酸、色氨酸、尿酸和膽紅素等也存在紫外光吸收。臨床上極少用于體液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定？幾種方法的比較方法靈敏度化學(xué)干擾不同蛋白質(zhì)間差異快速性與復(fù)雜性雙縮脲100μg中等小快速簡(jiǎn)易

福林-酚1μg嚴(yán)重大較復(fù)雜CBBG-2501μg低大快速簡(jiǎn)單紫外分光光度法10μg較嚴(yán)重大快速簡(jiǎn)單比濁法

（turbiditymethod）某些強(qiáng)酸（三氯醋酸、磺基水楊酸等）能與生物堿結(jié)合而沉淀，稱為生物堿試劑。它們可與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生細(xì)微沉淀，通過(guò)比濁求得蛋白質(zhì)含量在酸性溶液中蛋白質(zhì)帶有正電荷，可與帶負(fù)電荷的生物堿試劑結(jié)合形成細(xì)微沉淀，經(jīng)測(cè)定懸浮液的濁度，與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品比較，即可求得樣品中蛋白質(zhì)的含量此法操作簡(jiǎn)便，試劑易得，但濁度強(qiáng)弱受多種因素影響折光測(cè)定法

（ratioofrefraction）溶解在溶液中的固體可以增加溶液的光折射，通過(guò)測(cè)定血清的折射指數(shù)可以計(jì)算出總固體的含量由于每升正常血清中含有約16g非蛋白固體，它們對(duì)折射指數(shù)的影響必須進(jìn)行校正折射率＝1.3353＋蛋白質(zhì)濃度（g/dl）×

0.00191此法準(zhǔn)確性較差，且清、球蛋白的折射率不同OPA熒光法OPA：o-phthalaldehyde,o-苯二醛在巰基乙醇存在條件下，OPA與主胺發(fā)生反應(yīng)生成一種具有強(qiáng)烈藍(lán)色熒光的物質(zhì)，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為340nm，發(fā)射波長(zhǎng)為455nm。本法靈敏度高，線性范圍廣白蛋白（Albumin）測(cè)定白蛋白是血清中含量最多的蛋白質(zhì)將清、球蛋白分離后測(cè)定：鹽析法不分離清、球蛋白直接測(cè)定：染料結(jié)合法染料結(jié)合法測(cè)定白蛋白含量白蛋白能通過(guò)離子鍵或疏水鍵結(jié)合低分子物質(zhì)（包括生理性代謝物和外源性物質(zhì)）能力強(qiáng)，故可不分離清、球蛋白直接測(cè)定染料多用溴甲酚綠（BCG）、溴甲酚紫（BCP）藥物（青霉素等）、膽色素等能與染料競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合白蛋白，故可干擾測(cè)定結(jié)果靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好溴甲酚綠（BCG）法測(cè)定白蛋白BCG:bromcresolgreen,一種陰離子染料,全稱:3,3’,5,5’-四溴-間-甲酚磺酞在pH4.2及非離子去垢劑Brij-35存在條件下，BCG可與白蛋白緊密結(jié)合形成蘭綠色復(fù)合物，于630nm處有強(qiáng)的光吸收BCG與白蛋白的復(fù)合物會(huì)發(fā)生部分沉淀，且BCG的特異性較差，能與球蛋白反應(yīng)，但呈色強(qiáng)度較弱，同時(shí)反應(yīng)速度較慢標(biāo)本采集：病人：無(wú)特殊要求。最好用禁食的標(biāo)本以減少乳糜血的干擾。血清、肝素或EDTA血漿。標(biāo)本存放：留取標(biāo)本后請(qǐng)盡快分離血清/血漿。在室溫條件下（15～25℃）可以穩(wěn)定一周，在冰箱保存的條件下（2～8℃）穩(wěn)定一個(gè)月，-20℃保存至少可以穩(wěn)定3個(gè)月。線性范圍2～60g/L

精密度：小于3%重復(fù)性：AU1000批內(nèi)重復(fù)性小于3%，總不精密度。靈敏度：2g/L。干擾：當(dāng)樣品中抗壞血酸濃度1704mol/L，膽紅素濃度684mol/L，血紅蛋白濃度

4.00g/L，甘油三酯濃度5.63mmol/L時(shí)沒(méi)有觀察到干擾。溴甲酚紫（BCP）法測(cè)定白蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)與BCG相似在pH5.2及brij-35存在條件下，可與白蛋白形成紫色復(fù)合物，于603nm處有光吸收BCP與白蛋白的反應(yīng)是即時(shí)完全反應(yīng)BCP與白蛋白反應(yīng)特異性高，與血清非蛋白成分反應(yīng)微弱，干擾小球蛋白測(cè)定臨床檢驗(yàn)中多用總蛋白與白蛋白之差計(jì)算乙醛酸直接測(cè)定：在酸性溶液中，蛋白質(zhì)的色氨酸殘基與乙醛酸反應(yīng)，產(chǎn)生紫色化合物，稱Hopkins-Cole反應(yīng)，可于540nm比色，球蛋白中色氨酸約2％～3％，而白蛋白僅0.2％白蛋白與球蛋白比值（A/G比值）：

衡量肝臟疾病的嚴(yán)重程度

正常值：1.5-2.5:1<1,比值倒置，為慢性肝炎或肝硬化的特征之一That’sallThankyou！透析法：根據(jù)分子量的大小，用透析袋將大、小分子物質(zhì)分開。去除溶液中的鹽分、有機(jī)溶劑、小分子抑制劑、過(guò)剩的反應(yīng)物、底物等最常見(jiàn)、最方便的方法。超濾法：利用高壓力或離心力，使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。離心：蛋白質(zhì)在離心通過(guò)溶液運(yùn)動(dòng)時(shí)，或通過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到形狀的影響

凝膠過(guò)濾：根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離.等電點(diǎn)沉淀：蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)其溶解度、導(dǎo)電性、粘度、滲透壓最小，且較不易溶解。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－