臨床免疫學(xué)檢驗：10 免疫細(xì)胞功能檢測

第十三章免疫細(xì)胞分離與免疫細(xì)胞功能檢測

P134免疫細(xì)胞分離技術(shù)外周血單個核細(xì)胞分離---密度梯度離心法

原理：不同血細(xì)胞由于體積、形態(tài)、比重的不同，將其置于同一種離心力作用下，經(jīng)過一定時間離心，它們就會分在不同的層次中。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞比重為1.092左右；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（統(tǒng)稱為單個核細(xì)胞PBMC）比重為1.075~，為此，利用比重介于二者之間的淋巴細(xì)胞分離液（1.077±0.001）做密度梯度離心，可將單個核細(xì)胞分離出來。

常用的分離液－淋巴細(xì)胞分離液由聚蔗糖（Ficoll)和泛影葡胺（Hypaque)組成，故又稱為Ficoll-Hypaque分離液或Ficoll分離液。

Ficoll液的比重為1.077±0.001。稀釋血淋巴細(xì)胞分離液血漿+Hanks液淋巴細(xì)胞分離液RBC+粒細(xì)胞單個核細(xì)胞離心20分鐘2000轉(zhuǎn)

Ficoll液密度梯度離心分離單個核細(xì)胞示意圖密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞T/B細(xì)胞及T細(xì)胞亞群的分離---

免疫磁珠法原理：基于細(xì)胞表面Ag與連接有磁珠的特異性McAb結(jié)合，形成細(xì)胞-Ab-磁珠復(fù)合物，與磁珠相連的細(xì)胞在外加磁場作用下被吸附而滯留于磁場；而無該種表面Ag的細(xì)胞由于不能與連接有磁珠的特異性McAb結(jié)合而沒有磁性，不能在磁場停留，從而使細(xì)胞分離。免疫磁珠分離細(xì)胞原理示意圖

淋巴細(xì)胞功能檢測

一.非特異性免疫應(yīng)答（固有性免疫應(yīng)答，innateimmuneresponse)（一）概念

：人類在種系發(fā)展過程中形成的并可遺傳給后代的免疫力，它是天生具有的，不專門針對某種Ag物質(zhì)。（二）特點：

1.先天獲得，人人皆有；比較穩(wěn)定，并可遺傳給下一代

2.不因同一抗原進(jìn)入機(jī)體次數(shù)多少改變反應(yīng)強(qiáng)弱

3.發(fā)揮作用迅速

免疫應(yīng)答的類型及組成分兩種類型一.非特異性免疫應(yīng)答二.特異性免疫應(yīng)答（三）組成1.皮膚、黏膜的機(jī)械阻擋作用及局部分泌的抑菌、殺菌物質(zhì)2.吞噬細(xì)胞的吞噬作用3.NK(naturekiller)細(xì)胞對病毒感染靶細(xì)胞的殺傷作用4.血液、體液中的抗菌分子：補(bǔ)體、溶菌酶二.特異性免疫應(yīng)答（適應(yīng)性免疫應(yīng)答，adaptiveimmuneresponse)（一）概念：具有特異性，即針對某一特定的Ag物質(zhì)而發(fā)生反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫（二）特點：

1.后天獲得

2.有明顯的個體差異

3.免疫發(fā)生強(qiáng)弱與抗原進(jìn)入次數(shù)有關(guān)（三）組成細(xì)胞免疫：由TLC主導(dǎo)完成，其效應(yīng)物質(zhì)是致敏TLC(CTL/Th1)體液免疫：由BLC主導(dǎo)完成，其效應(yīng)物質(zhì)是Ab第二節(jié)人體免疫功能檢測非特異免疫功能體液中殺菌物質(zhì)——補(bǔ)體、溶菌酶吞噬細(xì)胞——大、小吞噬細(xì)胞（數(shù)量、功能）

特異性免疫功能細(xì)胞免疫功能T細(xì)胞數(shù)量功能體液免疫功能B細(xì)胞數(shù)量功能人特異免疫功能的檢測一.T細(xì)胞數(shù)量的檢測二.T細(xì)胞功能的檢測三.B細(xì)胞數(shù)量的檢測四.B細(xì)胞功能的檢測一.T細(xì)胞的計數(shù)（T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測）（一）特異性抗原的檢測

淋巴細(xì)胞表面有一些特異的CD抗原，根據(jù)不同的CD抗原可鑒定出不同的細(xì)胞群體CD抗原：淋巴細(xì)胞群（簇）分化抗原：不同群淋巴細(xì)胞在分化成熟過程中，細(xì)胞表面出現(xiàn)或消失的抗原分子T細(xì)胞表面主要CD抗原及其特異性

CD抗原特異性

CD2

E受體、全部T細(xì)胞和部分NK細(xì)胞

CD3

成熟T細(xì)胞

CD4

Th（輔助）細(xì)胞、M、HIV受體

CD8

Tc（殺傷）細(xì)胞、NK細(xì)胞的亞型

CD25活化T細(xì)胞、IL-2受體

檢測T淋巴細(xì)胞表面CD抗原中:CD3+的數(shù)量表示成熟的總T淋巴細(xì)胞的數(shù)量CD4+的數(shù)量表示是Th細(xì)胞的數(shù)量CD8+的數(shù)量表示是Ts/CTL細(xì)胞的數(shù)量CD4+/CD8+≥1.5免疫功能差或者免疫功能紊亂，該比值往往小于1。檢測方法：

用已標(biāo)記的抗CD抗原的單克隆抗體檢測1.免疫熒光法：用熒光素標(biāo)記的單抗作為試劑染色淋巴細(xì)胞，計算出染上熒光的淋巴細(xì)胞百分率如：熒光標(biāo)記的抗CD4單抗

淋巴細(xì)胞

染上熒光的為CD4+細(xì)胞

染色2.免疫細(xì)胞化學(xué)法：

用酶標(biāo)記的單抗檢測淋巴細(xì)胞

淋巴細(xì)胞印片

淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞表面CD抗原與相應(yīng)單抗結(jié)合

加底物細(xì)胞上有顏色即為陽性細(xì)胞

用酶標(biāo)記的單抗洗滌染色（二）T細(xì)胞特異性受體（E受體）的檢測

E花環(huán)形成試驗(ErythrocyteRosetteformingtest)原理：

T淋巴細(xì)胞表面含有綿羊紅細(xì)胞（SRBC)受體（CD2)，當(dāng)T淋巴細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞相遇時，T細(xì)胞通過該受體吸附綿羊紅細(xì)胞而形成花環(huán)。

E:erythrocyte,紅細(xì)胞E花環(huán)形成試驗據(jù)實驗條件不同又分兩種：

Et花環(huán)形成試驗（total,總E花環(huán)）

Ea花環(huán)形成試驗（active,活性E花環(huán)）1.Et花環(huán)形成試驗淋巴細(xì)胞+SRBC(1:50~100)37°C

、5min低速離心4°C、2h

計數(shù)形成花環(huán)百分率意義：代表T細(xì)胞總數(shù)（凡是T細(xì)胞均能形成花環(huán)），數(shù)量低于正常，說明細(xì)胞免疫功能差。

正常值：60%~80%2.Ea花環(huán)形成試驗淋巴細(xì)胞+SRBC(1:8-20)37C、5min低速離心4°C、10min

計數(shù)形成花環(huán)百分率意義：能形成Ea花環(huán)的T細(xì)胞是活性強(qiáng)的T細(xì)胞，Ea花環(huán)形成率更能反映細(xì)胞免疫功能。正常值：20%~30%

二.T細(xì)胞功能的檢測

檢測T細(xì)胞功能的試驗有：（一）T細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗（二）T細(xì)胞分泌功能測定（細(xì)胞因子檢測）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測（一）T細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗1.原理

淋巴細(xì)胞在某些物質(zhì)刺激下，細(xì)胞增殖、分化（如細(xì)胞變大、胞漿增多、出現(xiàn)空泡）DNA合成增加（核染色質(zhì)疏松，核仁出現(xiàn)），轉(zhuǎn)化成為淋巴母細(xì)胞。

2.刺激物

一般分有絲分裂原（非抗原）和抗原兩類：（1）非抗原刺激物（有絲分裂原）可刺激相關(guān)淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖轉(zhuǎn)化，與機(jī)體是否曾受過某一抗原致敏無關(guān)。

非抗原刺激物

刺激物能刺激發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞

植物血凝素（PHA)T

刀豆素A(ConA)T

脂多糖(LPS)、SPAB

商陸絲裂原(PWM)T、B（2）抗原刺激物

只能使曾經(jīng)被相應(yīng)抗原刺激（致敏）過的淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖轉(zhuǎn)化。3.試驗方法（1）形態(tài)學(xué)檢測法

抽取待測者血，加入PHA進(jìn)行培養(yǎng)，3天后涂片染色，計數(shù)100個LC中轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞即淋巴母細(xì)胞（根據(jù)形態(tài)）百分率。正常值60%～80%操作過程：試驗管:抗凝血2-3ml+PHA2mg+培養(yǎng)液對照管：抗凝血+培養(yǎng)液37°C

5%co2培養(yǎng)3天涂片染色計數(shù)100個LC中轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的百分率轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的區(qū)別轉(zhuǎn)化細(xì)胞未轉(zhuǎn)化細(xì)胞特點母細(xì)胞過渡型小淋巴細(xì)胞細(xì)胞大小（直徑）12~20μ12~16μ6~8μ

胞核染色質(zhì)疏松疏松致密核仁1~3個有或無無分裂相有或無無無量豐富稍寬窄嗜堿性強(qiáng)、深蘭色蘭色天青蘭空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無

胞漿形態(tài)學(xué)方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便、不需特殊儀器，無有害物質(zhì)（放射性物質(zhì)）污染。缺點：判斷結(jié)果不客觀，受主觀因素影響，結(jié)果判斷難以規(guī)范化。（2）同位素?fù)饺敕ǎ?/p>

3H-TdR摻入法）原理：

T細(xì)胞受PHA刺激后，細(xì)胞進(jìn)入增殖期發(fā)生有絲分裂合成DNA。實驗中當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時，在培養(yǎng)液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，細(xì)胞攝入合成DNA，根據(jù)摻入細(xì)胞內(nèi)的同位素量，可推測細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化程度。步驟：外周血分離淋巴細(xì)胞洗滌3次計數(shù)并配成1×106/ml0.1ml細(xì)胞+16400.1ml+PHA0.5mg/ml37°C

54-56h5%co2加3H-TdR1μci/孔37°C

16-18h5%co2收集細(xì)胞于濾膜上80~85°C

30min置有閃爍液的閃爍瓶中用閃爍計數(shù)儀測cpm（每分鐘脈沖數(shù)）結(jié)果：計算刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)=

實驗組cpm對照組cpm正常值：SI3.0同位素?fù)饺敕ǖ膬?yōu)缺點優(yōu)點：結(jié)果客觀準(zhǔn)確，有取代形態(tài)學(xué)法的趨勢缺點：技術(shù)要求高，操作中每個因素的改變都可影響實驗結(jié)果；需要特殊儀器檢測；存在同位素污染問題（3）MTT比色法

MTT—四甲基偶氮唑鹽

淋巴細(xì)胞受PHA刺激培養(yǎng)中，細(xì)胞增殖活躍，在細(xì)胞培養(yǎng)終止前4~6h（66-68h)加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)。

原理：MTT在細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，被還原成藍(lán)黑色的MTT-甲瓚顆粒，形成的MTT-甲瓚量與細(xì)胞增殖程度呈正相關(guān)。終止培養(yǎng)后加入二甲亞砜，使其溶解。在酶標(biāo)儀上測A570nm，可反映細(xì)胞增殖水平。結(jié)果：以刺激指數(shù)SI判斷淋巴細(xì)胞增殖程度。

SI=試驗孔A570nm/對照孔A570nm本法敏感性不及3H-TdR摻入法，但操作簡單，無放射性污染。（二）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗

細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL)具有殺傷靶細(xì)胞的功能，它是評價機(jī)體細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)。檢測該殺傷作用的試驗稱為細(xì)胞毒試驗。CTL與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合通過脫顆粒，釋放穿孔素、顆粒酶；FasL/Fas介導(dǎo)，使靶細(xì)胞溶解、凋亡。CTLCD8+靶細(xì)胞穿孔素、顆粒酶FasL/Fas介導(dǎo)靶細(xì)胞溶解、凋亡致敏淋巴細(xì)胞CTL殺傷靶細(xì)胞的顆粒外排途徑和Fas-FasL途徑聯(lián)合殺傷靶細(xì)胞的過程CTL殺傷具有高度的抗原特異性及嚴(yán)格的MHC限制性CTL連續(xù)殺傷靶細(xì)胞

CTL的殺傷特點：抗原特異性、MHC限制性、高效性與連續(xù)性

方法1.形態(tài)學(xué)檢測法

淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例加在一起培養(yǎng)一定時間，染色后計數(shù)殘留靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）數(shù)，計算淋巴細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。對照組（不加LC，只有腫瘤細(xì)胞）：對照組平均殘留腫瘤細(xì)胞數(shù)實驗組（LC+腫瘤細(xì)胞）：實驗組平均殘留腫瘤細(xì)胞數(shù)抑制率%=對照組-實驗組對照組100%2.同位素法：常用51Cr釋放試驗原理：用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞（一般為腫瘤細(xì)胞），將它與待測淋巴細(xì)胞（效應(yīng)CTL細(xì)胞）一起培養(yǎng)，效應(yīng)細(xì)胞破壞靶細(xì)胞，51Cr釋放出來，測定釋放的51Cr數(shù)量，便可推知效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力。方法：效應(yīng)細(xì)胞：受檢者外周血單個核細(xì)胞靶細(xì)胞：用鉻酸鈉（Na251Cr)標(biāo)記傳代腫瘤細(xì)胞分三組：1.最大釋放組：50μl靶C+150μlDW(靶細(xì)胞全溶)2.自發(fā)釋放組：50μl靶C+150μl培養(yǎng)液3.實驗組：50μl靶C+150μl培養(yǎng)液+100μl效應(yīng)C效：靶分別為100：1；50：1；25：1培養(yǎng)后取上清測cpm計算特異溶解百分率：實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm

最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm100%特異溶解百分率大于50%為陽性細(xì)胞免疫功能體內(nèi)檢測法（體內(nèi)試驗）

—Ⅳ型超敏反應(yīng)皮試原理：Ⅳ型超敏反應(yīng)的本質(zhì)是細(xì)胞免疫，因此Ⅳ型超敏反應(yīng)為陽性，可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能好。1.特異性抗原皮膚試驗：所用Ag:OT或PPD以O(shè)T為例：OT1:20000.1ml皮內(nèi)注射，48—72h觀察結(jié)果，紅腫硬結(jié)直徑大于0.5cm為陽性

該試驗設(shè)計是基于人群中96%的人均感染過結(jié)核菌（被結(jié)核抗原致敏），致敏淋巴細(xì)胞再次接觸抗原（如OT)后，釋放細(xì)胞因子，使局部產(chǎn)生以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)（表面為紅腫硬結(jié)）。陽性（直徑>0.5cm)：表明曾感染過結(jié)核菌，細(xì)胞免疫功能好陰性(直徑<0.5cm)

：表明細(xì)胞免疫功能差或從未感染過結(jié)核菌強(qiáng)陽性（直徑>2.5cm)：表明現(xiàn)處于結(jié)核的活動期

2.PHA皮膚試驗：

將定量PHA注射到受試者前臂皮內(nèi)，6~12h后出現(xiàn)紅斑和硬結(jié)，24~48h達(dá)高峰，直徑>15mm為陽性反應(yīng)。

該法敏感性高，安全可靠。

三.B細(xì)胞數(shù)量的檢測（一）B細(xì)胞表面識別抗原受體（BCR）（SmIg,SurfacemembraneIg)的檢測1.SmIg是B細(xì)胞表面膜免疫球蛋白，存在于成熟B淋巴細(xì)胞膜上，為B細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白。類型為：IgM、IgD型。作用及意義：

a.是B細(xì)胞的表面標(biāo)志

b.是B細(xì)胞識別抗原的受體

c.檢測外周血淋巴細(xì)胞時，表面有SmIg者為B細(xì)胞，故可作為檢測B細(xì)胞數(shù)量的方法。2.方法（常用免疫熒光法）（1）試劑：熒光標(biāo)記的抗人IgM、IgD抗體（2）外周血淋巴細(xì)胞涂片，熒光抗體染色（3）觀察：陽性細(xì)胞呈均染上熒光3.正常值：15%~25%（二）B細(xì)胞表面抗原的檢測

B細(xì)胞表面特有的CD抗原有：CD19、CD20、CD21等。B細(xì)胞亞群：B1群（CD19+、CD5+）

B2群（CD19+、CD5-

）用抗CD21的單抗（免疫熒光法、酶免疫組化法）檢測外周血淋巴細(xì)胞，陽性細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞，約占總淋巴細(xì)胞的10%~15%。

四.B細(xì)胞功能的檢測（一）血清中Ig的測定

檢測人免疫球蛋白常用方法單向瓊脂擴(kuò)散實驗、免疫比濁法正常值：IgG12g/L(7.6~16.6)

IgM1.3g/L(0.4~2.2)