全血基因組DNA的提取

全血基因組DNA提取地中海貧血基因檢測概述地中海貧血是由于某類珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性貧血。地中海貧血主要分為α-地中海貧血和β-地中海貧血。α-地中海貧血基因診斷操作流程β-地中海貧血基因診斷操作流程實驗目的1掌握離心柱法提取全血DNA的檢測方法2了解DNA濃度及純度的檢測實驗原理(離心柱法)獨特的緩沖液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，使蛋白與DNA分離,然后基因組DNA在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內硅膠膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅膠膜上洗脫。樣品準備用含抗凝劑的采血管進行采血，抗凝劑一般有EDTA和枸櫞酸鈉,肝素對酶反應有可能起抑制作用,如沒有特殊要求一般不采用。加入抗凝劑混勻后2-8℃保存一周；－20℃保存一個月；－70℃長期保存。盡可能保證樣本不經過反復凍融。設備和材料56℃水浴箱臺式高速離心機微量移液器(200μl,1000μl)1.5ml離心管,離心管架高壓槍頭及盒衛(wèi)生紙

試劑準備

血液DNA提取試劑盒主要成分包括：

緩沖液GB緩沖液GD

漂洗液PW洗脫緩沖液TB

蛋白酶K無水乙醇（自備）其他材料：吸附柱CB3收集管1.5ml離心管實驗步驟

每組做兩個標本，先準備兩個1.5ml離心管，編號Ⅰ

樣本裂解加20ul蛋白酶加200ul全血加200ulGB顛倒混勻56℃水浴10分鐘裂解后樣本實驗步驟裂解后樣本沉淀核酸核酸吸附吸附柱放入收集管中，編號將上一步所有溶液和絮狀沉淀分別加入吸附柱中；13000rpm離心30sec倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中加200ul無水乙醇顛倒混勻注意:動作輕柔實驗步驟裂解后樣本.漂洗去雜向吸附柱中加入500ulGD,13000rpm離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中

向吸附柱中加入600ulPW,13000rpm離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中

向吸附柱中加入600ulPW,13000rpm離心2min,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中柱子開蓋室溫放置數分鐘,以徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液沉淀核酸核酸吸附實驗步驟裂解后樣本.漂洗去雜將吸附柱轉于干凈1.5ml離心管中;向吸附柱中間位置懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TB,于室溫放置2-5min;13000rpm離心2min,將溶液收集到離心管中,得到基因組DNA,棄去吸附柱編號保存沉淀核酸核酸吸附洗脫DNADNA檢測方法1%的瓊脂糖電泳檢測DNA分子大小及完整性紫外分光光度法鑒定DNA純度在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸收

OD260/OD280<1.7有蛋白的污染

OD260/OD280＝1.7～1.9純度很好

OD260/OD280>1.9有部分降解或有RNA污染

DNA濃度計算：紫外分光光度計進行測量

OD260×50ng/ul（雙鏈DNA）×稀釋倍數DNA的保存提取的DNA作好標記（標注名稱，日期），交上來一起保存與冰箱-20℃。(短期可置于4℃，長期于-70℃分裝保存，應避免反復凍融)注意事項使用時注意緩沖液GD和漂洗液PW中有無加入無水乙醇加入乙醇顛倒混勻后可能會出現絮狀沉淀，動作要輕柔。

用去蛋白液、漂洗液將膜上的核酸漂洗后，將不加溶液的吸附柱離心（或靜置）以去除殘留的液體及揮發(fā)乙醇成分。注意事項因為進行的是PCR實驗，所以要注意防止污染，開蓋要輕柔，防止液體