第七章發(fā)酵工程技術(shù)概論

生物制藥第七章發(fā)酵工程技術(shù)概論第一節(jié)概述第二節(jié)優(yōu)良菌種的選育第三節(jié)發(fā)酵的基本過(guò)程第四節(jié)發(fā)酵方式第五節(jié)發(fā)酵工藝控制第六節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的提取第七節(jié)發(fā)酵設(shè)備第八節(jié)基因工程在發(fā)酵工程中的應(yīng)用第九節(jié)發(fā)酵工程的發(fā)展展望第一節(jié)概述一、發(fā)酵工程（fermentationengineering），又稱(chēng)微生物工程：通過(guò)微生物完整的細(xì)胞自催化完成生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，微生物既能正常生長(zhǎng)又能過(guò)量積累目的產(chǎn)物，提供工業(yè)產(chǎn)品。包括：抗生素、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、酶制劑、蛋白質(zhì)、基因工程藥物、核酸類(lèi)物質(zhì)等。抗生素、氨基酸、酶制劑等產(chǎn)品為什么能通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)？這與微生物的生長(zhǎng)和代謝特點(diǎn)有什么關(guān)系？某些微生物因爭(zhēng)奪生存環(huán)境或營(yíng)養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生抗生素將其他種類(lèi)的微生物殺死。微生物會(huì)產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水解成可吸收的小分子多肽或氨基酸、葡萄糖。微生物細(xì)胞會(huì)通過(guò)合成或分解代謝生產(chǎn)它必需的一些物質(zhì)，包括氨基酸、核苷酸等。二、發(fā)酵工程發(fā)展的4個(gè)階段第一階段---天然發(fā)酵階段：發(fā)酵技術(shù)開(kāi)始于家庭小制作，傳統(tǒng)的釀酒、制醬等。技術(shù)進(jìn)步緩慢，完全是經(jīng)驗(yàn)式的，并不知道其中的原理。1675年荷蘭人列文虎克發(fā)明了顯微鏡。法國(guó)巴斯德在1857~1876持續(xù)研究發(fā)酵作用。第二階段---傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)階段：開(kāi)始了解發(fā)酵現(xiàn)象的本質(zhì)，采用開(kāi)放式的發(fā)酵方式，生產(chǎn)過(guò)程及設(shè)備較為簡(jiǎn)單，規(guī)模不大。1900~1940人工控制微生物發(fā)酵過(guò)程（純培養(yǎng)階段），新產(chǎn)品酵母、甘油、乳酸、檸檬酸、丙酮和丁醇（第一個(gè)工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品）第三階段---現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)階段：通氣攪拌技術(shù)階段（深層通氣培養(yǎng)法），技術(shù)要求高、發(fā)展速度快；生產(chǎn)規(guī)模大；菌種生產(chǎn)能力大幅提高，新產(chǎn)品、新技術(shù)、新設(shè)備的應(yīng)用達(dá)到前所未有的程度。1942年青霉素工業(yè)化生產(chǎn)。第四階段---生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)階段：利用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵。三、發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)和選育（菌種）培養(yǎng)基制備和滅菌（培養(yǎng)基）發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制（通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵及條件的優(yōu)化、發(fā)酵過(guò)程參數(shù)控制、反應(yīng)器的設(shè)計(jì)）產(chǎn)物的分離、提取與精制等（純化）發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個(gè)要素：

生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝、發(fā)酵設(shè)備第二節(jié)優(yōu)良菌種的選育一、菌種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)：遺傳物質(zhì)（DNA）二、自然選育不經(jīng)過(guò)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程正變菌株：生長(zhǎng)良好、生產(chǎn)水平提高、對(duì)生產(chǎn)有利的變異個(gè)體負(fù)變菌株：生產(chǎn)能力下降、形態(tài)出現(xiàn)異性，生產(chǎn)水平下降，菌種退化特點(diǎn)：純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)水平、提高產(chǎn)物產(chǎn)量；但效率低、進(jìn)展慢，通常將自然選育和誘變育種交替使用三、誘變育種

用人工方法來(lái)誘發(fā)突變是加速基因突變的重要手段，突變部位一般是在遺傳物質(zhì)DNA上，因此突變后性狀能穩(wěn)定的遺傳。（一）方法和原理1.誘變機(jī)制（1）微小損傷突變：堿基置換、移碼突變（2）染色體畸變：由于遺傳物質(zhì)的缺失或重排造成（易位、倒位、缺失、重復(fù)）（3）染色體組突變：指由有絲分裂或減數(shù)分裂異常而產(chǎn)生的染色體數(shù)目或組數(shù)的變化。2.誘變劑及作用方式：誘變劑：能誘發(fā)基因突變并使突變率提高到超過(guò)自發(fā)突變水平的物理化學(xué)因子。（1）物理誘變劑

紫外線(xiàn)、x射線(xiàn)、γ射線(xiàn)、快中子、α射線(xiàn)、β射線(xiàn)和超聲波等。（2）化學(xué)誘變劑金屬離子、一般化學(xué)試劑、生物堿、抗代謝物、生長(zhǎng)刺激素、抗生素、高分子化合物、殺菌劑、染料等。對(duì)DNA的作用形式：與一個(gè)或多個(gè)核酸堿基起化學(xué)反應(yīng)，引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致變異；如亞硝酸、硫酸二乙酯等與天然堿基相似的類(lèi)似物摻入到DNA分子上引起的；如5-溴尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤等DNA分子上減少或增加一兩個(gè)堿基引起堿基突變點(diǎn)以下的全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯的錯(cuò)誤---移碼突變。如吖啶類(lèi)物質(zhì)三、誘變育種（二）誘變和篩選誘變---以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液包括：出發(fā)菌株的選擇---誘變劑種類(lèi)和誘變劑劑量的選擇---合理的使用方法篩選---用合適的方法淘汰負(fù)變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株包括：初篩---重復(fù)篩選---突變株性能檢測(cè)---直到獲得新的優(yōu)良菌株實(shí)用意義較大的初篩方法有以下幾種：自身耐藥突變株：耐受自身分泌的抗生素；開(kāi)始合成抗生素的時(shí)間提早，產(chǎn)量也有所提高結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或前體類(lèi)似物的耐受突變株：解除反饋抑制，積累過(guò)量產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株及其回復(fù)突變株：解除反饋抑制、阻斷分支途徑四、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體：除去細(xì)胞壁的細(xì)胞，或是被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。原生質(zhì)體融合：指通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。1.原生質(zhì)體融合的一般程序：溶壁作用：細(xì)菌、放線(xiàn)菌（溶菌酶）、真菌（蝸牛酶）、霉菌（蝸牛酶、纖維素酶）原生質(zhì)體在高滲溶液下用PEG作助融劑，將兩種親株原生質(zhì)體進(jìn)行融合在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑出融合重組子2.影響融合的因素

菌齡：一般采用對(duì)數(shù)前期的菌體，原生質(zhì)體形成率較高培養(yǎng)基成分：在限制性培養(yǎng)基上比在于完全培養(yǎng)基上原生質(zhì)體形成效果好，可能是由于完全培養(yǎng)基中的有機(jī)成分或某些金屬離子會(huì)引起細(xì)胞壁成分的改變，導(dǎo)致對(duì)溶壁酶敏感性的改變。PEG：相對(duì)分子質(zhì)量（4000或6000）、濃度（30~40%）外界因素：高滲溶液配制、再生培養(yǎng)基中加入酵母膏促進(jìn)再生速度、原生質(zhì)體密度要適當(dāng)3.原生質(zhì)體融合育種意義：打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)。去除了細(xì)胞壁屏障，融合重組頻率比較高。可與其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個(gè)單株中。用途：改良菌株，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，打破種屬界限、產(chǎn)生重組子，有可能產(chǎn)生新的化合物。第三節(jié)發(fā)酵的基本過(guò)程

菌種---種子制備---發(fā)酵---發(fā)酵液預(yù)處理---提取精制

一、菌種對(duì)生產(chǎn)菌種的要求：產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快、性能穩(wěn)定、容易培養(yǎng)生產(chǎn)菌種的保存：0~4℃休眠保存，砂土管或冷凍干燥管二、種子的制備使菌種繁殖，獲得足夠數(shù)量的菌體，以便接入發(fā)酵罐中三、發(fā)酵使微生物產(chǎn)生大量的目的產(chǎn)物，是發(fā)酵的關(guān)鍵階段。參數(shù)：通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、罐溫、培養(yǎng)基總體積、黏度、泡沫、菌絲形態(tài)、pH、溶氧濃度、排氣中二氧化碳含量等四、產(chǎn)物提取發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾，提取，精制第四節(jié)發(fā)酵方式一、分批發(fā)酵將全部物料一次投入到反應(yīng)器中，經(jīng)滅菌、接種、發(fā)酵后再將發(fā)酵液一次放出的操作過(guò)程。特點(diǎn)：（1）整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒(méi)有其他物質(zhì)交換（O2、CO2、消泡劑、酸堿除外）（2）整個(gè)過(guò)程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化，是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法

分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點(diǎn)：產(chǎn)率低應(yīng)用廣泛，改善中（在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，計(jì)算機(jī)控制）二、連續(xù)發(fā)酵微生物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在發(fā)酵罐中不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)不斷放出代謝物，使微生物在近似恒定狀態(tài)下生長(zhǎng)的培養(yǎng)方式。特點(diǎn)：菌濃度、產(chǎn)物濃度、限制性基質(zhì)濃度均處于恒定狀態(tài)。應(yīng)用在廢水處理、葡萄糖酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵等工業(yè)中連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作穩(wěn)定，利于機(jī)械化、自動(dòng)化；控制稀釋速率可以使發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化，發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)量高缺點(diǎn)：長(zhǎng)期連續(xù)發(fā)酵會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量，染菌機(jī)會(huì)增加，對(duì)產(chǎn)品類(lèi)型的適應(yīng)性不廣，對(duì)設(shè)備及附件要求高三、補(bǔ)料分批發(fā)酵將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。應(yīng)用廣泛，用于氨基酸、抗生素等工業(yè)補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與分批發(fā)酵相比延長(zhǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間可避免在分批培養(yǎng)過(guò)程中因一次性投糖過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)，耗氧過(guò)多的狀況達(dá)到高濃度細(xì)胞培養(yǎng)稀釋有毒代謝產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)：與連續(xù)發(fā)酵相比因?yàn)椴僮鲿r(shí)間有限，降低了染菌，避免了遺傳不穩(wěn)定性最終產(chǎn)物濃度較高，有利于產(chǎn)物的分離使用范圍廣，在生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物和細(xì)胞高濃度培養(yǎng)中普遍采用。

缺點(diǎn)：由于沒(méi)有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致生產(chǎn)速率的下降由于物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)第五節(jié)發(fā)酵工藝控制一、培養(yǎng)基的影響及其控制碳源：占菌體干物質(zhì)的50%以上是碳主要功能：提供能源、菌體成分、產(chǎn)物碳架來(lái)源：糖類(lèi)、脂肪、有機(jī)酸、碳?xì)浠衔锼傩荚矗喝缙咸烟牵茌^迅速的參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，有利于菌體的生長(zhǎng)，但有的分解代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用；遲效碳源：如淀粉、乳糖、油脂等，被菌體緩慢利用，有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長(zhǎng)抗生素的分泌期，為許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。氮源：占菌體干物質(zhì)的10%主要功能：構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)、構(gòu)成蛋白質(zhì)等產(chǎn)物的成分來(lái)源：無(wú)機(jī)氮源、有機(jī)氮源（速效氮源氨基酸、玉米漿、遲效氮源黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉）速效氮源：如氨基酸、玉米漿等，有利于菌體的生長(zhǎng)；遲效氮源：如黃豆餅粉、花生餅粉等，有利于代謝代謝產(chǎn)物的形成無(wú)機(jī)鹽和微量元素主要功能：構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分（S、P）、作為酶的組成部分或維持酶的活性（鎂、鐵、鋅、鈣、磷等）、調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓（NaCl、KCl等）和pH，參與產(chǎn)物的合成水：物質(zhì)溶解和生化反應(yīng)的基礎(chǔ)功能：機(jī)體的重要組成成分、參加一些代謝反應(yīng)、良好溶劑和熱導(dǎo)體二、溫度的影響及其控制1.影響發(fā)酵溫度變化的因素

（1）生物熱：微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的熱能；與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間、呼吸強(qiáng)度有關(guān)（2）攪拌熱：攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)引起的液體之間和液體與設(shè)備之間摩擦所產(chǎn)生的產(chǎn)生的熱量（3）蒸發(fā)熱：水分蒸發(fā)所需熱能（4）輻射熱：罐內(nèi)外氣溫差使熱能向大氣輻射的熱量2.溫度的選擇與控制（1）最適發(fā)酵溫度的選擇：最適生長(zhǎng)溫度、最適生產(chǎn)溫度變溫發(fā)酵，如青霉素發(fā)酵30℃5h---25℃35h---20℃85h---25℃40h---放罐；青霉素產(chǎn)量比25℃恒溫發(fā)酵高14.7%（2）溫度控制一般不需加熱，冷卻水（冷凍鹽水）通過(guò)夾層循環(huán)冷卻三、溶氧的影響及其控制1.溶氧的影響最適氧濃度：菌體生長(zhǎng)或產(chǎn)物合成最適濃度范圍臨界氧濃度：滿(mǎn)足微生物呼吸的最低氧濃度2.發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化溶氧異常下降（污染好氣雜菌，菌體代謝異常，設(shè)備故障）溶氧異常升高（污染噬菌體，菌體代謝異常）3.溶氧濃度的控制溶氧濃度決定因素：供氧和需氧兩方面。供氧方面：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)通氣速率需氧方面：菌體濃度：耗氧量、氧傳遞速率基質(zhì)種類(lèi)和濃度培養(yǎng)條件：如溫度、中間補(bǔ)水等四、pH的影響及其控制1.pH對(duì)發(fā)酵的影響影響酶的結(jié)構(gòu)和活性影響微生物對(duì)基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)影響微生物細(xì)胞膜的電荷狀況影響代謝方向2.pH的變化取決于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)條件3.發(fā)酵pH的確定和控制（1）發(fā)酵pH的確定：菌種、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、溫度微生物發(fā)酵的最適pH范圍一般在5~8之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，即配制不同初始pH的培養(yǎng)基，考察發(fā)酵情況。（2）發(fā)酵pH的控制常用的控制方法有：調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方達(dá)到適當(dāng)配比，使pH變化在合適范圍內(nèi)通過(guò)加酸堿：硫酸銨、氨水采用中間補(bǔ)料的方法：如尿素第六節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的提取一、吸附法利用適當(dāng)?shù)奈絼ɑ钚蕴?、白陶土、氧化鋁等），在一定的pH條件下，使發(fā)酵液中的抗生素被吸附劑吸附，然后改變pH，以適當(dāng)?shù)南疵搫ㄒ话闶怯袡C(jī)溶劑）把抗生素從吸附劑上解吸下來(lái)，以達(dá)到濃縮和純化的目的。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，原料易解決，成本低缺點(diǎn)：吸附劑吸附性能不穩(wěn)定，選擇性不高，不能連續(xù)操作，影響環(huán)境衛(wèi)生，所以一般不采用二、沉淀法是指利用某些抗生素具有兩性的性質(zhì)，使其在等電點(diǎn)時(shí)從溶液中沉淀出來(lái)或在一定pH條件下，能與某些酸、堿或金屬離子形成不溶性或溶解度很小的復(fù)鹽，使抗生素從發(fā)酵濾液中沉淀下來(lái)，以及改變pH等條件時(shí)，此種復(fù)鹽又易分解或重新溶解的特性，來(lái)提取抗生素的一種方法。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，原料易解決，節(jié)省溶劑，成本低，收率高缺點(diǎn)：過(guò)濾較困難，往往和溶劑法結(jié)合使用

三、溶劑萃取法利用抗生素在不同的pH條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)存在，以及它們?cè)谒芭c水不互溶的溶劑中溶解度的不同的特性，使抗生素從一種液體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)液體中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品純度高，濃縮倍數(shù)大，能連續(xù)生產(chǎn)，周期短缺點(diǎn)：溶劑耗量大，成本高，設(shè)備要求高（溶劑回收，防火防爆）四、離子交換法利用某些抗生素能離解成陽(yáng)離子或陰離子的特性，使其與離子交換樹(shù)脂進(jìn)行選擇性交換作用，再用洗脫劑從樹(shù)脂上將抗生素洗脫下來(lái)，以達(dá)到濃縮和提純的目的。優(yōu)點(diǎn)：成本低，設(shè)備簡(jiǎn)單，節(jié)省溶劑，操作方便缺點(diǎn)：周期長(zhǎng)，pH變化大，不適于穩(wěn)定性差的抗生素第七節(jié)發(fā)酵設(shè)備理想的微生物細(xì)胞生物反應(yīng)器的基本要求生物反應(yīng)器的材料無(wú)毒，穩(wěn)定性好，一般用不銹鋼制成密封良好，避免污染生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)：滿(mǎn)足傳質(zhì)、傳熱、混合的性能容器內(nèi)表面光滑，無(wú)死角，利于清潔滅菌任何接口處都不能有泄漏攪拌器轉(zhuǎn)速和通氣應(yīng)適當(dāng)能自動(dòng)控制和調(diào)節(jié)多種理化參數(shù)第八節(jié)基因工程在發(fā)酵工程中的應(yīng)用一、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用（一）提高抗生素產(chǎn)量1.

增加生物合成中限速階段酶系基因的拷貝數(shù)2.

通過(guò)調(diào)節(jié)基因的作用：增加正調(diào)節(jié)基因或降低負(fù)調(diào)節(jié)基因的作用3.

增加抗性基因：有些抗性基因是和抗生素的生物合成基因連鎖，它們的轉(zhuǎn)錄有可能也是緊密相連的，是激活生物合成基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的必需成分。（二）改善抗生素組分應(yīng)用基因工程方法可以定向的改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種。（三）改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝?yán)弥亟MDNA技術(shù)，把血紅蛋白基因克隆到生產(chǎn)菌種，提高傳氧速率，解除供氧水平對(duì)高產(chǎn)發(fā)酵的限制。（四）產(chǎn)生雜合抗生素雜合抗生素是通過(guò)遺傳重組技術(shù)產(chǎn)生的新的抗菌活性化合物。1.生物合成途徑中某個(gè)酶基因突變：會(huì)使中間產(chǎn)物積累，也可能使合成途徑越過(guò)變異的酶直接由后續(xù)酶作用進(jìn)行生物合成，從而產(chǎn)生一系列新的抗生素衍生物。2.在生物合成途徑中引入一個(gè)酶基因3.利用底物特