ApoE敲除小鼠研究計(jì)劃

dldhierarch2013.06.22Lrp5/6在高血脂所致?lián)p傷時(shí)所扮演的角色的探究計(jì)劃01、用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠建立高脂損傷模型ApoE基因敲除小鼠模擬高血脂損傷模型的機(jī)理/ApoE基因的作用用何種指標(biāo)或手段確認(rèn)高血脂損傷模型的建立02、Lrp5/6在高脂損傷時(shí)表達(dá)水平的探索體外用Ox-LDL刺激huv-ec細(xì)胞，看膜上的Lrp5/Lrp6水平的表達(dá)取小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，重復(fù)OX-LDL刺激實(shí)驗(yàn)03、Lrp5/6在高脂損傷時(shí)所起作用的探索取已建立好ApoE基因敲除小鼠高脂損傷模型的小鼠各臟器觀察Lrp5/6及βCatenin的表達(dá)水平的變化如Lrp5/6在其中扮演角色，則研究其內(nèi)在機(jī)制（何種通路等）體內(nèi)探索Lrp5/6在高血脂損傷時(shí)所扮演的角色ApoE（apolipoproteinE/載脂蛋白E）載脂蛋白是血漿脂蛋白（脂-蛋白復(fù)合物）中的蛋白部分。載脂蛋白是構(gòu)成血漿脂蛋白的蛋白質(zhì)組分，主要在肝臟（部分在小腸）合成，主要分類由A、B、C、D、E五類?；竟δ苁沁\(yùn)載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)，某些載脂蛋白還有激活脂蛋白代謝酶、識(shí)別受體等功能。ApoE結(jié)構(gòu)及功能簡(jiǎn)介血漿脂蛋白是哺乳動(dòng)物血漿中的脂—蛋白復(fù)合物，能夠和脂類（甘油三酯、磷脂、膽固醇等）結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)在血漿中運(yùn)輸脂類（跨器官運(yùn)輸）（1）脂—蛋白的結(jié)合機(jī)制脂蛋白中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)之間沒(méi)有共價(jià)鍵結(jié)合，多數(shù)是通過(guò)脂質(zhì)的非極性部分與蛋白質(zhì)組分之間以疏水性相互作用而結(jié)合在一起。一般認(rèn)為血漿脂蛋白都具有類似的結(jié)構(gòu)，呈球狀，在顆粒表面是極性分子，如蛋白質(zhì)、磷脂，故具有親水性；非極性分子如甘油三酯、膽固醇酯則藏于其內(nèi)部。磷脂的極性部分可與蛋白質(zhì)結(jié)合，非極性部分可與其它脂類結(jié)合，作為連接蛋白質(zhì)和脂類的橋梁，使非水溶性的脂類固系在脂蛋白中。（2）脂蛋白的分類及功能dldhierarch脂蛋白的分類及功能：01、乳糜微粒（chylomicron，CM）——顆粒最大，密度最低約為500nm大小，脂類含量高達(dá)98%，蛋白質(zhì)含量少于2%，因此密度極低。主要功能為運(yùn)輸外源性甘油三酯。02、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，VLDL）VLDL中脂類占85%-90%，其中甘油三酯（TG）占55%，其密度也很低；VLDL的功能為運(yùn)輸內(nèi)源性甘油三酯（肝臟中由脂肪酸和葡萄糖合成）。03、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）04、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）dldhierarch03、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）主要功能是把膽固醇（是攜帶膽固醇最多的脂蛋白）從肝臟運(yùn)輸?shù)饺砀魈幖?xì)胞，經(jīng)代謝進(jìn)行清除。（1）受體介導(dǎo)途徑清除（主要是Apo蛋白配體+LDL受體）——約2/3體內(nèi)2/3的LDL是通過(guò)受體介導(dǎo)途徑吸收入肝和肝外組織，經(jīng)代謝而清除的。在血管運(yùn)輸過(guò)程中，當(dāng)LDL，尤其是OX-LDL（氧化修飾的低密度脂蛋白）過(guò)量時(shí)，它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈壁上，長(zhǎng)期積累容易引起動(dòng)脈硬化。因此LDL被稱為“壞的膽固醇”。（2）非受體通路（巨噬細(xì)胞吞噬LDL）——約1/3巨噬細(xì)胞與LDL結(jié)合，吸收LDL中的膽固醇，這樣膽固醇就留在細(xì)胞內(nèi)，變成“泡沫”細(xì)胞。因此，LDL能夠進(jìn)人的動(dòng)脈壁細(xì)胞，并帶入膽固醇。所以LDL水平過(guò)高能夠?qū)е聞?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。dldhierarch04、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）

顆粒最小密度最高的血漿脂蛋白，其直徑為7.5～10nm，密度為1.21g/cm3，含有6%膽固醇、13%膽固醇酯與50%蛋白質(zhì)，其載脂蛋白大多為ApoA（載脂蛋白A）。生理功能和意義主要功能為將內(nèi)源性膽固醇從組織向肝臟進(jìn)行逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接轉(zhuǎn)化為膽汁從腸道中排出。降低了膽固醇在血管中沉積的風(fēng)險(xiǎn)。因此HDL能夠抵抗血管粥樣硬化的形成，是“好的膽固醇”被譽(yù)為“血管清道夫”。同時(shí)HDL具有逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能不良、刺激PIG2（前列環(huán)素，具有擴(kuò)血管和抗血栓形成作用）生成，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、減少血小板聚集、抑制LDL氧化（即減少OX-LDL生成）等許多功能。1985年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)成果——膽固醇代謝調(diào)節(jié)機(jī)制美國(guó)德克薩斯大學(xué)的Michael·S·Brown和Joseph·L·GoldsteindldhierarchApoE蛋白結(jié)構(gòu)及功能簡(jiǎn)介ApoE主要由肝臟合成，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)腦，腎，骨骼，腎上腺及巨噬細(xì)胞也能合成。ApoE生理功能：①是LDL受體的配體，也是肝細(xì)胞CM殘粒受體的配體，它與脂蛋白代謝有密切相關(guān)性；②ApoE具有多態(tài)性，多態(tài)性是決定個(gè)體血脂水平與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；③參與激活水解脂肪的酶類，參與免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)組織的再生。ApoE基因敲除小鼠構(gòu)建AS（動(dòng)脈粥樣硬化）的模型的機(jī)制ApoE基因敲除小鼠構(gòu)建AS（動(dòng)脈粥樣硬化）的模型的機(jī)制ApoE蛋白能夠是通過(guò)不同機(jī)制對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到一定的抑制作用。模擬機(jī)理ApoE是構(gòu)成CM

(乳糜微粒)、VLDL

(極低密度脂蛋白)及HDL

(高密度脂蛋白)的重要成分，它作為一種清除配體，參與受體介導(dǎo)的載脂蛋白清理過(guò)程，主要介導(dǎo)血漿脂蛋白特別是乳糜微粒和低密度脂蛋白的代謝與清除，在脂蛋白代謝巾發(fā)揮重要作用。因此當(dāng)ApoE基因敲除后，可導(dǎo)致TC（總膽固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）升高，誘發(fā)動(dòng)脈內(nèi)膜損傷及脂質(zhì)沉積，最終發(fā)展成動(dòng)脈粥樣硬化。

SpontaneoushypercholesterolemiaandarteriallesionsinmicelackingapolipoproteinE.Science,1992

Oct16;258(5081):468-71.模型優(yōu)點(diǎn)以往的As動(dòng)物模型大多以高脂肪、高膽固醇膳食負(fù)荷喂養(yǎng)，其As病理變化機(jī)制與人類As的形成有較大的差異。dldhierarch高血脂損傷模型建立確認(rèn)的指標(biāo)脂質(zhì)代謝異常與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系。載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠可出現(xiàn)高脂血癥并形成動(dòng)脈粥樣硬化，因而成為理想的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)模型。SeverehypercholesterolernicaandatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmicecreatedbyhomoIogousrecombinationinEScells.Cell,

Volume71,Issue2,343-353,16October1992血脂生化分析指標(biāo)血管超聲檢查病理切片指標(biāo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指標(biāo)CT血管造影檢查dldhierarch總膽固醇（TC）甘油三酯（TG）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）血脂生化分析指標(biāo)dldhierarchApoE-/-小鼠As病變通常是從主動(dòng)脈根部、升主動(dòng)脈開(kāi)始形成，并在冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓及其分叉處、頸總動(dòng)脈及其分叉處、胸主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈、雙腎動(dòng)脈等處均可形成斑塊，與人類As好發(fā)處相近。由于ApoE-/-小鼠As病變是從主動(dòng)脈根部開(kāi)始發(fā)生，為了觀測(cè)早期As的病變特征，可以采用UBM（超聲生物顯微鏡，ultrasoundbiomicroscopy）成像觀察ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部的形態(tài)學(xué)和IMT（主動(dòng)脈后壁內(nèi)-中膜厚度）變化。Non-invasivereal-timeimagingofatherosclerosisinmiceusingultrasoundbiomicroscopy.Atherosclerosis.2007.190(2)

Ultrasoundbiomicroscopynoninvasiveassessmentofatherosclerosisinapolipoprotein-Eknockoutmice.UltrasoundinMed&Bio,2011dldhierarch血管超聲檢查dldhierarch用Ox-LDL刺激huv-ec細(xì)胞和體外培養(yǎng)的小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞以探究細(xì)胞膜上的Lrp5/6的表達(dá)水平huv-ec

cell（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，HumanUmbilicalVeinEndothelialCells）HUV-EC-C(ATCC?

CRL-1730?)OX-LDL（Oxidizedlow-densitylipoprotein,氧化型低密度脂蛋白）OX-LDL喜好在血管內(nèi)皮受損部位即血管斑塊部位聚集，它能夠誘導(dǎo)血管壁內(nèi)巨噬細(xì)胞泡沫化，并在其局部引發(fā)一連串的多種細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致不同程度的動(dòng)脈粥樣硬化。dldhierarchApoE基因敲除小鼠模型的建立及對(duì)照組的設(shè)置看時(shí)間梯度結(jié)合高血脂損傷的諸項(xiàng)指標(biāo)觀察Lrp5/6表達(dá)水平的變化及差異dldhierarchLrp5/6在高脂損傷時(shí)所扮演角色的的探索用Lrp5/