植物細(xì)胞SOD的提取與分離

植物細(xì)胞SOD的提取與分離陳翰200913007012梁羽200913007011原理超氧化物歧化酶(SOD)是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子(O-2)進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫:2O-2+H2=O2+H2O2。植物葉片細(xì)胞中有較豐富的SOD,通過組織或細(xì)胞破碎后,可用PH7.8的磷酸緩沖液提取。由于不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。二材料和試劑1)新鮮植物葉片磷酸緩沖液：0.05mol/L,PH7.8的磷酸緩沖液。氯仿一乙醇混合溶劑：氯仿：無水乙醇=3:5(v/v).丙酮：用前冷卻至4?10°C。碳酸鹽緩沖液：0.05mol/L,PH10.2.EDTA溶液：0.1mol/L。腎上腺素液：2mol/L。2．主要儀器:(1)可見分光光度計(jì)(2)萬分之一分析天平(3)離心機(jī)(4)冰箱(5)光照箱：4500Lux(6)帶蓋瓷盤1個/處理(7)移液管架(8)研缽(9)離心管5mL數(shù)個(10)微燒杯10?15mL8個/處理(11)移液管或加樣器0.5mLX4；1mLX2；2mLX2；5mLX1(12)微量進(jìn)樣器50口LX2；100口LX2(13)燒杯50mLX3；100mLX5；500mLX1；1000mLX2(14)量筒50mLX1；100mLX2(15)容量瓶50mLX1；100mLX5；250mLX1；1000mLX2(16)細(xì)口瓶125mLX5三操作方法組織或細(xì)胞破碎稱取5g左右植物新鮮葉片，置于研磨器中研磨，使組織或細(xì)胞破碎。2SOD的提取將上述破碎組織或細(xì)胞,、加入2~3倍體積的0.05mol/L,PH7.8的磷酸緩沖液，繼續(xù)研磨攪拌20min,使SOD充分溶解到緩沖液中，然后用離心機(jī)在5000r/min下，離心15min,棄沉淀，得提取液。3除雜蛋白提取液加入0.25倍體積的氯仿一乙醇混合溶劑攪拌15min,5000r/min,離心15min,去雜蛋白沉淀，的粗酶液。4SOD的沉淀分離將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，5000r/min離心15min，得沉淀SOD。將沉淀溶于0.05mol/L,PH7.8的磷酸緩沖液中，于55?60°C熱處理15min,離心棄沉淀，得到SOD酶液。5SOD活力測定取3根小試管，按下表分別加進(jìn)各種試劑和樣品液。ml)試劑空白管對照管樣品管磷酸緩沖液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5蒸餾水0.50.5——樣品液————0.5混合均勻腎上腺素液——0.50.5在加入腎上腺素前，充分搖勻并在30C水浴中預(yù)熱5min至恒溫。加入腎上腺素(空白管不加)，繼續(xù)保溫反應(yīng)2min,然后立即測定各管在480nm處的光密度。對照管于樣品管的光密度值分別為A和B。在上述條件下，SOD抑制腎上腺素自氧化的50%所需要的酶量定義為一個酶活力單位。即：酶活力(單位)=(2*(A-B)*N)/A式中N——樣品稀釋倍數(shù)2——抑制腎上腺素自氧化50%的換算系數(shù)(100%/50%)。若以每毫升樣品液的單位數(shù)表示，則按一下計(jì)算酶活力單位/ml={[2*(A-B)*N]/A}*(V/Vi)=[26*(A-B)*