免疫細胞分離及表面標志檢測專業(yè)課件

免疫細胞的分離及免疫細胞功能檢測及應(yīng)用1歡迎下載可修改2免疫細胞的分離及檢測※檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定※方法：體外法為主※目的：判斷機體免疫狀態(tài)※意義：探討疾病的發(fā)病機制、發(fā)展、預(yù)后、療效免疫細胞的分離是指將各種參與免疫反應(yīng)的細胞從血液或組織中分離出來歡迎下載可修改第一節(jié)免疫細胞的分離外周血單個核細胞分離淋巴細胞的分離T細胞和B細胞的分離T細胞亞群的分離3歡迎下載可修改細胞分離基本原理不同細胞密度不同不同細胞生物學特性不同不同細胞表面分化抗原不同4歡迎下載可修改一、外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞（monocyte）。

聚蔗糖-泛影葡胺聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒5歡迎下載可修改原理：外周血中各細胞的比重不同，PBMC的比重為1.075～1.090，紅細胞和多核細胞分別為1.093和1.092，選擇比重為1.077±0.001的介質(zhì)，細胞與介質(zhì)混合后離心，比重比介質(zhì)大的紅細胞和多核細胞沉降在下層，而PBMC位于Ficoll分離液上層。

6歡迎下載可修改

用1.077±0.001的分層液可分離人外周血單個核細胞Ficoll分離液２份6%聚蔗糖蒸餾水溶液１份34%泛影葡胺生理鹽水溶液(聚蔗糖-泛影葡胺）Ficoll外周血7歡迎下載可修改對分離介質(zhì)的要求：對細胞無毒；等滲；與血漿和分離細胞不相溶；有特定的比重。不同動物的PBMC比重有差異：小鼠：1.085大鼠：1.087

人：1.075～1.0908歡迎下載可修改方法學評價：分離得到的PBMC純度可達９５％，淋巴細胞占９０％～９５％；操作簡便；易于無菌。

9歡迎下載可修改二、淋巴細胞分離貼壁粘附法吸附柱過濾法Percoll分離液法（連續(xù)密度梯度離心）10歡迎下載可修改9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:49PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/39、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:49PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3

利用單核細胞具有貼壁生長的特點，將已制備的單個核細胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平培養(yǎng)瓶，37℃溫箱靜置1h，單核細胞將貼附于平皿壁上，而未貼壁的細胞幾乎全為純淋巴細胞。橡皮棒刮下貼壁的細胞，可得純單核細胞(無活性）。1.貼壁黏附法PBMC37℃°1hour上清液單核單核淋巴細胞注意：B細胞也可粘附13歡迎下載可修改9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:49PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3

利用單核細胞具有貼壁生長的特點，將單個核細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的層析柱中，凡有黏附能力的細胞絕大部分被吸附而黏滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細胞主要是淋巴細胞。2.吸附柱過濾法PBMC洗脫

洗脫液淋巴細胞單核細胞>DC>B細胞>T細胞細胞的粘附能力：15歡迎下載可修改3.Percoll分離液法Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。采用預(yù)先形成的密度梯度，分離的細胞輕輕疊加到液面上Percoll液經(jīng)離心后可形成一個從管底到液面逐漸遞減的連續(xù)的密度梯度，不同密度的細胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細胞分離純化。死細胞血小板單核細胞淋巴細胞粒細胞紅細胞16歡迎下載可修改三、T、B細胞和T細胞亞群

的分離磁性微球分離法熒光激活細胞分離儀分離法

17歡迎下載可修改1.磁性微球分離法磁性微球：金屬小顆粒（Fe2o3,Fe3o4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基團（氨基、羧基和羥基），可結(jié)合生物大分子物質(zhì)（抗原，抗體，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物質(zhì)稱免疫磁珠。18歡迎下載可修改19歡迎下載可修改20歡迎下載可修改流式細胞分析儀2.熒光激活細胞分離儀分離法21歡迎下載可修改E花環(huán)沉降法尼龍毛柱分離法T細胞和B細胞的分離22歡迎下載可修改1.E花環(huán)沉降法（E受體/CD2與綿羊紅細胞結(jié)合）B細胞T細胞Ficoll液離心溶解紅細胞T細胞B細胞23歡迎下載可修改2.尼龍毛柱分離法此法簡便快速，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，T細胞純度可達90%以上。24歡迎下載可修改25歡迎下載可修改四、不同細胞分離方法的綜合評價早期細胞物理屬性細胞生物屬性分辨率和靈敏度不高現(xiàn)在（根據(jù)細胞表面標志）免疫磁珠流式細胞儀分辨率和靈敏度高缺點：不適用于細胞表面分子不清的細胞分離，試劑和儀器昂貴26歡迎下載可修改五、分離細胞的保存和活力檢測1.分離細胞的保存

對保存液的要求：等滲，具pH緩沖作用，并對細胞無毒性（Hanks、Tc-199、RPMI1640）。如需短期保存，置4℃放置較好，可減低細胞代謝活動。如需長期保存，應(yīng)放入液氮罐中在深低溫(-196℃)條件下保存細胞。27歡迎下載可修改2.細胞活力測定細胞活力常用活細胞占總細胞的百分比表示，細胞活力的測定常用的簡便方法是臺盼藍(trypanblue)染色法。死細胞著色，染成藍色；活細胞拒染。

用血細胞計數(shù)器在顯微鏡下觀察到著色和不著色的細胞，計數(shù)200個細胞，以不著色細胞的百分率即代表細胞的活力。28歡迎下載可修改一、T細胞表面標志的檢測二、B細胞表面標志的檢測四、細胞表面標志檢測的意義

三、自然殺傷細胞表面標志的檢測

第二節(jié)淋巴細胞標志及亞群分類29歡迎下載可修改一、T細胞表面標志及其亞群CD3+CD4+CD8-輔助性T細胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatoryTcell,TrorTreg）30歡迎下載可修改二、B細胞表面標志

SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標。CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。31歡迎下載可修改CD19+CD5-:B2細胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD19（B細胞的標志）CD21CD32(FcRⅡ)CD35（C3b/C4b受體）CD40（成熟B細胞）CD80/86（活化的B細胞）CD19+CD5+:B1細胞CD22和CD23二、B細胞表面標志

32歡迎下載可修改三、NK細胞表面標志

人類NK細胞表面標志主要以CD16、CD56來認定，臨床上將CD3-CD56+CD16+淋巴細胞認定為NK細胞。33歡迎下載可修改淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義淋巴細胞表面標志檢測是評價免疫功能的重要指標。對CD4+和CD8+T細胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。34歡迎下載可修改臨床常見疾病中的T淋巴細胞的變化

35歡迎下載可修改小結(jié)外周血單個核細胞的分離淋巴細胞分離T細胞亞群分離36歡迎下載可修改9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。***2/3/20234:42:49PM11、人總是珍惜為得到。03-2月-23**Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。***Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。03-2月-2303-2月-23**03February202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月2023**03-2月-2315、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月23*03-2月-23*03February202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。**2/