《水體中微囊藻基因的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》編制說明

《水體中微囊藻基因的測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》（征求意見稿）編制說明二零二三年一月

目錄1項(xiàng)目背景 《水體中微囊藻基因的測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》編制說明1項(xiàng)目背景近年，水體富營養(yǎng)化已成為一個(gè)全球關(guān)注的環(huán)境問題，在富營養(yǎng)化水體中存在高濃度的營養(yǎng)性物質(zhì)，如氮、磷等，可促使藻類大量生長(zhǎng)形成水華。早在19世紀(jì)末，就有動(dòng)物飲用含有藍(lán)藻污染物的水而出現(xiàn)死亡的相關(guān)報(bào)道。因此，湖泊富營養(yǎng)化和藍(lán)藻水華是同前全世界共同面臨的重大環(huán)境問題之一。在水華期間，會(huì)使湖泊生物多樣性下降，而且產(chǎn)毒藍(lán)藻會(huì)釋放大量生物毒素，其中藍(lán)藻產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物—微囊藻毒素（Microcystin,MC）危害程度較強(qiáng)，它是一種在藍(lán)藻水華污染中產(chǎn)生量最大、出現(xiàn)頻率最高和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類之一。這些毒素可在魚、蝦、蟹等水生動(dòng)物富集，經(jīng)食物鏈可影響人類健康，既能影響漁業(yè)養(yǎng)殖，也可造成飲用水安全等問題。產(chǎn)生微囊藻毒素的藻類主要有藍(lán)藻門微囊藻屬、魚腥藻屬、顫藻屬，藍(lán)藻毒素通過其危害方式可分為肝毒素和神經(jīng)毒素，它們是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑，另一類毒素對(duì)皮膚有刺激作用。當(dāng)藍(lán)藻細(xì)胞破裂或死亡時(shí)，毒素就會(huì)被釋放到水中，常規(guī)的水處理工藝不能有效的將它去除。許多水體爆發(fā)的“水華”是由藍(lán)藻的瘋狂生長(zhǎng)引起的，而在水華藍(lán)藻中又以微囊藻為優(yōu)勢(shì)種，常見的微囊藻中既有產(chǎn)毒株也有不產(chǎn)毒株，常規(guī)的藍(lán)藻監(jiān)測(cè)以顯微鏡下形態(tài)觀察、計(jì)數(shù)為主，方法粗略，易漏檢或誤檢。并且產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株在顯微鏡下的形態(tài)是一樣的，肉眼無法分辨，因此常規(guī)顯微鏡鏡檢法準(zhǔn)確度不高，有待于發(fā)展既快又準(zhǔn)確的產(chǎn)毒微囊藻的檢測(cè)方法。2項(xiàng)目來源由嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院2022年1月向浙江省質(zhì)量合格評(píng)定協(xié)會(huì)提出立項(xiàng)申請(qǐng)，經(jīng)省質(zhì)量合格評(píng)定協(xié)會(huì)論證通過。2022浙江省質(zhì)量合格評(píng)定協(xié)會(huì)團(tuán)體會(huì)員轉(zhuǎn)入浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)，標(biāo)準(zhǔn)由浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)歸口。3標(biāo)準(zhǔn)制定工作概況3.1標(biāo)準(zhǔn)制定相關(guān)單位及人員3.1.1本標(biāo)準(zhǔn)牽頭組織制定單位：浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)。3.1.2本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院。3.1.3本標(biāo)準(zhǔn)參與起草單位：川源（中國）機(jī)械有限公司、南京山普羅特有限公司3.1.4本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)比對(duì)單位：嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院、寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院、寧波海關(guān)技術(shù)中心、南京山普羅特有限公司、云南方源科技有限公司3.1.5本標(biāo)準(zhǔn)起草人為：*3.2主要工作過程3.2.1前期準(zhǔn)備工作。（1）2020年6月至今，嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院同川源（中國）機(jī)械有限公司合作開展藻類快速檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)研究。（2）2020年至2022年完成嘉興市市本級(jí)水源地藻毒素的采樣與檢測(cè)12批次，完善檢測(cè)方法。標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)組建了標(biāo)準(zhǔn)工作組，確了負(fù)責(zé)人和各編寫人員和分工職責(zé)，如表3-1所示。表3-1人員情況序號(hào)姓名工作單位職稱分工1史少禮浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)主任會(huì)議組織2程坡浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)職員會(huì)議組織3郭俊明寧波大學(xué)主任/教授立項(xiàng)評(píng)審專家組長(zhǎng)4吳國祥嘉興市方圓檢測(cè)技術(shù)有限公司正高立項(xiàng)評(píng)審專家5連加俤中國計(jì)量大學(xué)副教授立項(xiàng)評(píng)審專家6夏志勇浙江舜虞達(dá)環(huán)境科技集團(tuán)有限公司高級(jí)工程師立項(xiàng)評(píng)審專家7呂升浙江省嘉興生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心正高工立項(xiàng)評(píng)審專家8周仰原嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院常務(wù)副院長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)總負(fù)責(zé)9孟祥周嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院副院長(zhǎng)/教授標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)負(fù)責(zé)10靳立民嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院主任/高工標(biāo)準(zhǔn)編寫11王乾川源（中國）機(jī)械有限公司總經(jīng)理標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)接12張秋曉川源（中國）機(jī)械有限公司職員實(shí)驗(yàn)13章夏蕓川源（中國）機(jī)械有限公司職員實(shí)驗(yàn)14鄭博之川源（中國）機(jī)械有限公司董事長(zhǎng)特別助理標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)落實(shí)15章躍龍寧波海關(guān)技術(shù)中心職員實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)16章勝喬寧波海關(guān)技術(shù)中心職員實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)17張鈞旸南京山普羅特有限公司博士實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)18魯闖寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院副研究員實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)19黃偉初昆明金澤實(shí)業(yè)有限公司正高級(jí)工程師實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)20余秋宏云南方源科技有限公司總經(jīng)理助理/工程師實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)21雷鋒良云南方源科技有限公司主任/工程師實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比對(duì)3.2.2標(biāo)準(zhǔn)草案研制必要性微囊藻毒素的檢測(cè)分析方法主要有生物分析法（如小鼠腹腔注射）、物理化學(xué)分析法（如高效液相色譜法HPLC）和生物化學(xué)分析法（如酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)ELISA，蛋白磷酸酶抑制分析PPIA等）。上述方法均不能在毒素從藻細(xì)胞內(nèi)釋放出來之前對(duì)水體中微囊藻的產(chǎn)毒能力進(jìn)行判斷，因此無法對(duì)潛在的產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行預(yù)檢以預(yù)防產(chǎn)毒微囊藻對(duì)人體健康及環(huán)境的危害?？尚行允褂脤?shí)時(shí)熒光定量PCR法可以在水華爆發(fā)之前對(duì)水體中產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行檢測(cè)，為水體富營養(yǎng)化的預(yù)防預(yù)警提供了可靠的數(shù)據(jù)和方法，而且其操作更簡(jiǎn)單、快速，有效監(jiān)測(cè)預(yù)警水體安全和健康。方法檢測(cè)不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，與傳統(tǒng)的檢測(cè)產(chǎn)毒微囊藻的方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。但由于沒有關(guān)于微囊藻與產(chǎn)毒微囊藻qPCR測(cè)定方法的國家標(biāo)準(zhǔn)/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，使微囊藻與產(chǎn)毒微囊藻qPCR的測(cè)試沒有統(tǒng)一、規(guī)范的方法，本標(biāo)準(zhǔn)的制定可以規(guī)范、統(tǒng)一產(chǎn)毒微囊藻qPCR的試驗(yàn)方法，為水體環(huán)境的安全和健康發(fā)展提供支撐。編制草案情況本標(biāo)準(zhǔn)編制基于前期的工作內(nèi)容與數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)中固定了分析方法，形成了內(nèi)部的規(guī)范操作。再經(jīng)過1年的實(shí)踐驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和可行性，形成編制草案。實(shí)驗(yàn)室比對(duì)找到了4家實(shí)驗(yàn)室寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院、寧波海關(guān)技術(shù)中心、南京山普羅特有限公司、云南方源科技有限公司，嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院有2臺(tái)qPCR設(shè)備，分別由不同人員進(jìn)行操作，做為2個(gè)數(shù)據(jù)比對(duì)實(shí)驗(yàn)室，符合《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ168-2020）中的要求。3.2.3征求意見2023年*月*日標(biāo)準(zhǔn)開始在面向公眾發(fā)布征求意見稿，。3.2.4專家評(píng)審2022年12月7日，省質(zhì)量協(xié)會(huì)組織專家召開了《水體中微囊藻基因測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)評(píng)審會(huì)，評(píng)審委員會(huì)由浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)、嘉興市方圓檢測(cè)技術(shù)有限公司、浙江省嘉興生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、浙江舜虞達(dá)環(huán)境科技集團(tuán)有限公司、中國計(jì)量大學(xué)、寧波大學(xué)的7名專家組成。評(píng)審委員會(huì)審查了送審材料和標(biāo)準(zhǔn)的全部?jī)?nèi)容，并形成了評(píng)審意見。3.2.5標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批202*年*月*日，標(biāo)準(zhǔn)形成送審稿提交省質(zhì)量協(xié)會(huì)。4標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及確定依據(jù)4.1編制原則（1）科學(xué)性原則。規(guī)范應(yīng)在統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)下制定，并按照公開、公正、科學(xué)的評(píng)判原則開展充分論證和同行評(píng)估。（2）先進(jìn)性原則。規(guī)范應(yīng)充分借鑒國內(nèi)外已有技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和最新政策文件，確保技術(shù)先進(jìn)、原理正確、內(nèi)容可靠。（3）實(shí)用性原則。規(guī)范應(yīng)充分考慮我國現(xiàn)階段環(huán)境管理需求并與之相適應(yīng)，具有較好的可操作性。4.2主要內(nèi)容及確定依據(jù)4.2.1技術(shù)框架本文件按《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ168-2020）中的要求和參照《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法制定指南》（農(nóng)業(yè)部2259號(hào)公告-5-2015）中的要求編寫。4.2.2內(nèi)容結(jié)構(gòu)本文件共9章。第1章為適用范圍，第2章為規(guī)范性引用文件，第3章為術(shù)語和定義，第4章為方法原理，第5章為試劑和材料，第6章為儀器與設(shè)備，第7章為樣品，第8章為分析步驟，第9章為質(zhì)量保證與控制。4.2.3適用范圍的內(nèi)容及論據(jù)本文件規(guī)定了實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定水體中總微囊藻基因和產(chǎn)毒微囊藻基因的條件與詳細(xì)步驟。本文件適用于飲用水、地表水中總微囊藻基因和產(chǎn)毒微囊藻基因的測(cè)定。4.2.4規(guī)范性引用文件的內(nèi)容及論據(jù)本文件的規(guī)范性引用文件包括：GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)本文件涉及的規(guī)范性引用文件主要用于水樣的采集。4.2.5術(shù)語和定義的內(nèi)容及論據(jù)Ct值cyclethreshold每個(gè)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4.2.6方法原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。本方法運(yùn)用TaqMan探針法，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，使系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度或者熒光種類發(fā)生變化，通過檢測(cè)這種變化可測(cè)出PCR反應(yīng)體系中產(chǎn)物的種類和量。4.2.7試劑和材料樣品分析過程所需的試劑和材料，并按qPCR方法的要求，加入了引物和探針的序列。4.2.8儀器與設(shè)備在測(cè)定過程中所需的儀器和設(shè)備，并提出參數(shù)上的要求。4.2.9樣品（1）水樣的采集都有相關(guān)的采樣標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范-點(diǎn)位布設(shè)、采樣頻次及采樣方法按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。-使用采樣瓶時(shí)用水樣充分潤洗3次，再采集水樣。-使用采水器采集1L樣品至采樣瓶中。若水體透明度較高，浮游植物數(shù)量較少時(shí)，應(yīng)酌情增加采樣體積。樣品采集時(shí)采樣瓶不應(yīng)裝滿，以便搖勻。（2）水樣的運(yùn)送和保存運(yùn)輸過程應(yīng)在保溫箱中保持水樣溫度1℃～5℃，應(yīng)在24h內(nèi)完成過濾，過濾后的樣品在-20℃冰箱中保存待檢。4.2.10分析步驟（1）準(zhǔn)備樣品提取前的材料準(zhǔn)備工作。（2）過濾按操作要求過濾水樣。（3）DNA提取不同廠家的提取試劑盒的操作要求可能會(huì)不一樣，需按廠家要求的步驟提取，提取成功后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.11測(cè)定測(cè)定步驟分為標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制、反應(yīng)體系配制、加樣、計(jì)算等。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制標(biāo)準(zhǔn)品源液要放在-20℃冰箱中保存，一般濃度為1011copies/μL～1012copies/μL，室溫融解。同一標(biāo)準(zhǔn)品源液反復(fù)凍融不要超過3次，否則易產(chǎn)生改性。移取適量標(biāo)準(zhǔn)品原液至0.5mL離心管，用無菌水稀釋至1×108copies/μL，將稀釋過標(biāo)準(zhǔn)品在震蕩器上震蕩約10秒，使用迷你離心機(jī)離心約5秒。以10倍重復(fù)稀釋步驟，逐級(jí)稀釋制作7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，其系列濃度分別為：1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。（2）反應(yīng)體系配制操作前開啟生物安全柜過濾吸氣口5min～10min、UV燈開啟20min～30min。將所有的耗材與實(shí)驗(yàn)工具噴上75%酒精消毒并擦拭，在生物安全柜內(nèi)使用在操作前將試劑解凍并使用震蕩器混合約10s，使用迷你離心機(jī)離心約5s。反應(yīng)體系在生物安全柜內(nèi)配制，建議在冰盒中進(jìn)行。設(shè)qPCR反應(yīng)管數(shù)為n×3，n為待檢樣品數(shù)＋空白＋核驗(yàn)樣品數(shù)，qPCR反應(yīng)體系配制，見表2。將配好的反應(yīng)體系，震蕩混合約10s，再離心約5s，轉(zhuǎn)移到qPCR試管中。qPCR反應(yīng)體系試劑用量無菌DI水8.0μL酶混合液12.5μLF引子（10μmol/L）1.0μLR引子（10μmol/L）1.0μL探針（10μmol/L）0.5μL總體積23.0μL在開始操作前，將燈光關(guān)閉(探針必須要避光)（3）加樣加入2.0μL的無菌水、樣品或標(biāo)準(zhǔn)品DNA，蓋好蓋子，離心機(jī)混勻。按qPCR儀器說明書操作步驟上機(jī)檢測(cè)，并記錄結(jié)果。（4）熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95℃活化、180s；95℃變性、5s，退火延長(zhǎng)60℃、20s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后設(shè)置采集熒光。5，端選擇FAM熒光通道，3，端選擇無（none）熒光。不同的儀器設(shè)置會(huì)有所不同，退火延長(zhǎng)最短時(shí)間設(shè)不到20s，從對(duì)比實(shí)驗(yàn)時(shí)各單位所用型號(hào)的設(shè)備，有設(shè)備退火延長(zhǎng)可設(shè)的最短時(shí)間為31s。（5）擴(kuò)增效率計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)系列以稀釋標(biāo)準(zhǔn)液副本數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Cq值為縱坐標(biāo)，作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)R2≥0.98，擴(kuò)增效率（E）應(yīng)在80％～120％。擴(kuò)增效率按式（1）計(jì)算。E=（式中：b——斜率/線性系數(shù)，范圍應(yīng)在-3.08～-3.59。（6）結(jié)果計(jì)算水樣中總微囊藻基因和微囊藻產(chǎn)毒基因的含量（C）,單位為copies/mL表示，按式（2）計(jì)算。 QUOTEC=10Cq-ab×V1式中：Ct——取得DNA數(shù)據(jù)/量化周期；a——常數(shù)項(xiàng)；b——斜率/線性系數(shù)；V1——提取液體積，μL；V0——過濾樣品體積，mL。4.2.12質(zhì)量保證與控制空白檢驗(yàn):每10個(gè)樣品，做一個(gè)樣品空白核查，不得檢測(cè)出Ct值。校準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)≥0.995。每10個(gè)樣品應(yīng)測(cè)定標(biāo)線中濃度點(diǎn)，與標(biāo)線中同濃度點(diǎn)Ct值差絕對(duì)值應(yīng)小于1。平行樣:每個(gè)樣品至少做1個(gè)平行樣，平行測(cè)定結(jié)果Cq值最大值與最小值差應(yīng)小于1。加標(biāo)樣:每10個(gè)樣品，做1個(gè)樣品加標(biāo)樣，接受的加標(biāo)回收率范圍為80%～120%。5標(biāo)準(zhǔn)先進(jìn)性體現(xiàn)通過TaqMan探針法，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，使系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度或者熒光種類發(fā)生變化，通過檢測(cè)這種變化可測(cè)出PCR反應(yīng)體系中產(chǎn)物的種類和量。其方法是一種檢測(cè)核酸片段擴(kuò)增能力強(qiáng)、靈敏度高、通量高、可同時(shí)擴(kuò)增不同基因表達(dá)不同片段的技術(shù)。具有特異性高、靈敏、快速檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成已知序列的探針，再通過探針進(jìn)行核酸靶序列的檢測(cè)，同時(shí)具有更低的成本和更容易控制的反應(yīng)條件，能直接捕獲出目標(biāo)基因。6與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)性6.1目前國內(nèi)執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)和文件目前國內(nèi)有現(xiàn)行有效關(guān)于藻類毒素測(cè)定方法一般使用的高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜法或酶聯(lián)免疫吸附法，發(fā)布有國標(biāo)、地標(biāo)和食品、水產(chǎn)漁業(yè)等行標(biāo)，生態(tài)環(huán)境部目前還沒有制訂藻類相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。如國家標(biāo)準(zhǔn)：《水中微囊藻毒素的測(cè)定》（GB/T20466-2006）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中微囊藻毒素的測(cè)定》（GB5009.273-2016）；地方標(biāo)準(zhǔn)：《水質(zhì)藻類計(jì)數(shù)視野計(jì)數(shù)法》（DB37/T4163—2020）、《藻類產(chǎn)品中微囊藻毒素測(cè)定高效液相色譜法》DB32/T1481-2009、《水源水中微囊藻毒素測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法DB31/T1178—2019》、《生活飲用水源水中11種藻毒素的測(cè)定高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》（DB34/T3300-2018）、《淡水浮游藻類監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（DB32/T4005-2021）；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：《水質(zhì)甲萘威、臭氰菊酯、微囊藻毒素-LR的測(cè)定高效液相色譜法》（SL/T740-2016）、《出口水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測(cè)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T4319-2015）、《出口水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測(cè)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T4319-2015）。目前沒有微囊藻與產(chǎn)毒微囊藻QPCR測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO《Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfornucleicacidtargetsequences—qPCRanddPCR》（ISO20395）中對(duì)生物目標(biāo)核酸定量qPCR測(cè)定做了通用要求，沒有查到有微囊藻與產(chǎn)毒微囊藻qPCR測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布。6.2本標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)相沖突情況本規(guī)范不存在標(biāo)準(zhǔn)低于相關(guān)國標(biāo)、行標(biāo)和地標(biāo)等推薦性標(biāo)準(zhǔn)的情況。6.3本標(biāo)準(zhǔn)引用了以下文件：（1）GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)（2）HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范（3）HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)引用文件均現(xiàn)行有效。7社會(huì)效益制定本標(biāo)準(zhǔn)可以規(guī)范、統(tǒng)一產(chǎn)毒微囊藻qPCR的試驗(yàn)方法，為水體環(huán)境的安全和健康發(fā)展提供支撐。8重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)本文件在專家評(píng)審過程中不存在重大分歧意見，歷次專家咨詢及修改說明見附錄*和附錄*9廢止現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議無廢止現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的建議10提出標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制實(shí)施或推薦實(shí)施的建議和理由本標(biāo)準(zhǔn)為浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。11貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議本標(biāo)準(zhǔn)將在全國團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)信息平臺(tái)（/）上自我聲明采用本標(biāo)準(zhǔn)，其他采用本標(biāo)準(zhǔn)的單位也應(yīng)在信息平臺(tái)上進(jìn)行自我聲明。本標(biāo)準(zhǔn)為檢測(cè)水中微囊藻基因的測(cè)定提供了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)化的方式，能夠有效的規(guī)范市場(chǎng)和保障土壤工作的質(zhì)量。建議先以團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的形式發(fā)布，實(shí)施一段時(shí)間后轉(zhuǎn)化為地方標(biāo)準(zhǔn)、區(qū)域性標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議如下：1、用于藻類爆發(fā)預(yù)警研究使用。2、國家或地方相關(guān)主管部門推動(dòng)使用。12其他應(yīng)予說明的事項(xiàng)本規(guī)范不涉及專利的使用?！端w中微囊藻基因的測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR》標(biāo)準(zhǔn)研制工作組2021年XX月XX日附錄A方法驗(yàn)證報(bào)告方法名稱：水體中微囊藻基因的測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR法項(xiàng)目主編單位：嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院驗(yàn)證單位：同濟(jì)川源實(shí)驗(yàn)室、寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院、寧波海關(guān)技術(shù)中心南京山普羅特有限公司、云南方源科技有限公司項(xiàng)目負(fù)責(zé)人及職稱：靳立民高級(jí)工程師通訊地址：浙江省嘉興市南湖區(qū)凌公塘路1994號(hào)電話告編寫人及職稱：靳立民高級(jí)工程師報(bào)告日期：2022年1月18日1原始測(cè)試數(shù)據(jù)A1.1實(shí)驗(yàn)室基本情況表A1-1參加驗(yàn)證的人員情況登記表姓名性別年齡職務(wù)或職稱所學(xué)專業(yè)從事相關(guān)分析工作年限實(shí)驗(yàn)室及編號(hào)靳立民男43高級(jí)工程師環(huán)境監(jiān)測(cè)21同濟(jì)川源實(shí)驗(yàn)室張秋曉女32／生物工程9同濟(jì)川源實(shí)驗(yàn)室A蔣寶玉女26／環(huán)境工程4林安迪男27／環(huán)境安全衛(wèi)生系6B章夏蕓女30／工業(yè)分析與檢驗(yàn)7魯闖男42副研究員化學(xué)工程19寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室C邱從平男50副研究員生物化學(xué)25申芳嫡女34副研究員遺傳育種12章躍龍男30工程師8寧波海關(guān)技術(shù)中心梅山實(shí)驗(yàn)室D章勝喬男48高級(jí)工程師25張鈞旸男40博士生物工程10南京山普羅特有限公司實(shí)驗(yàn)室E唐婷女38高級(jí)工程師應(yīng)用化學(xué)13劉玲梅女27初級(jí)工程師環(huán)境工程4余秋宏男36工程師環(huán)境科學(xué)10云南方源科技有限公司實(shí)驗(yàn)室F雷鋒良男29工程師環(huán)境科學(xué)7蔡宇涵男28/微生物工程6白萍珍女29/環(huán)境工程6

表A1-2使用儀器情況登記表儀器名稱規(guī)格型號(hào)儀器出廠編號(hào)性能狀況（計(jì)量/校準(zhǔn)狀態(tài)、量程、靈敏度等）實(shí)驗(yàn)室編號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀MICPOCDx48MIC2102002/A熒光定量PCR儀Q1000+031-00268/B高速冷凍離心機(jī)HeraeusFresco2142572117（0～14800）rpmA、B實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀QuantStudio3272322412/C高速冷凍離心機(jī)HeraeusFresco21S204728（0～15000）rpmC實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀AB7500275006199/D實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀CFXConnect788BR07065E高速冷凍離心機(jī)HeraeusFresco2140712747E全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96PSN220324L7/F高速冷凍離心機(jī)MultifugeX1R20180585（0~15200）rpmF表A1-3使用試劑及溶劑登記表名稱生產(chǎn)廠家、規(guī)格純化處理方法實(shí)驗(yàn)室編號(hào)植物提取試劑盒QiagenDNeasyPlantMiniKit(50)/A、B、C、D、E、F探針和引物自制/A、B、C、D探針和引物南京山普羅特有限公司/E、FA1.2方法檢出限、測(cè)定下限測(cè)試數(shù)據(jù)表A1-4產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）方法檢出限、測(cè)定下限測(cè)試數(shù)據(jù)表平行樣品編號(hào)產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）（對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液10copies/mL的測(cè)定）ABCDEF測(cè)定結(jié)果copies/mL138.925.180.848.631.348.7235.543.871.143.327.836.2364.425.385.844.323.733.3457.638.378.949.627.430.9548.334.072.942.430.351.4655.625.389.444.637.732.4平均值copies/mL50.532.079.845.529.738.8標(biāo)準(zhǔn)偏差Scopies/mL11.38.007.122.944.738.91t值0.982-4.2811.6-39.2-8.43-1.97方法檢出限copies/mL3826.924.09.8915.930.0測(cè)定下限copies/mL15210895.839.663.7120表A1-5總微囊藻基因（micr）方法檢出限、測(cè)定下限測(cè)試數(shù)據(jù)表平行樣品編號(hào)總微囊藻基因（micr）（對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液10copies/mL的測(cè)定）ABCDEF測(cè)定結(jié)果copies/mL136.211037.849.721.626.6262.110341.444.626.222.9356.614440.545.522.934.8454.311337.846.424.826.4540.512744.344.918.633.0634.611324.6平均值copies/mL47.411839.646.422.328.0標(biāo)準(zhǔn)偏差Scopies/mL11.714.83.001.882.964.76t值-61.611.2-8.77-5.13-23.2-11.5方法檢出限copies/mL39.449.810.16.339.9616.0測(cè)定下限copies/mL15719940.425.339.864.1A1.3方法精密度測(cè)試數(shù)據(jù)表A1-6產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）精密度測(cè)試數(shù)據(jù)平行樣品編號(hào)產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）測(cè)定結(jié)果copies/mL19.01E+015.60E+067.82E+045.46E+063.68E+047.44E+062.93E+034.05E+06NA2.09E+067.89E+034.16E+0626.80E+015.00E+067.98E+045.35E+064.23E+046.54E+063.24E+034.41E+06NA2.06E+068.40E+033.99E+0637.19E+014.80E+068.26E+045.73E+063.46E+046.21E+062.69E+034.26E+06NA1.97E+068.63E+033.58E+0646.66E+014.57E+068.37E+045.17E+063.72E+047.72E+062.81E+034.57E+06NA1.94E+061.15E+043.89E+0657.66E+015.48E+067.88E+045.17E+063.45E+046.77E+063.15E+034.20E+06NA2.01E+061.10E+043.86E+0666.95E+015.22E+068.37E+045.57E+063.22E+049.12E+062.87E+034.08E+06NA2.00E+068.58E+034.28E+06平均值copies/mL7.38E+015.11E+068.11E+045.41E+063.63E+047.30E+062.95E+034.26E+06NA2.01E+069.24E+033.96E+06標(biāo)準(zhǔn)偏差Scopies/mL8.733.97E+052.50E+032.23E+053.46E+031.05E+062.08E+021.99E+05-5.56E+041.52E+032.46E+05相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）11.87.773.084.139.5514.47.084.68-2.7716.26.21表A1-7總微囊藻基因（micr）精密度測(cè)試數(shù)據(jù)平行樣品編號(hào)總微囊藻基因（micr）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）測(cè)定結(jié)果copies/mL11.92E+021.68E+074.02E+052.26E+079.86E+041.89E+076.83E+042.13E+079.10E+011.25E+071.82E+048.34E+0621.78E+022.05E+074.54E+052.40E+071.04E+051.45E+076.43E+041.78E+079.99E+019.59E+061.55E+048.56E+0632.56E+021.70E+074.80E+052.21E+071.02E+051.66E+076.69E+041.86E+078.13E+011.37E+071.51E+048.29E+0642.17E+021.82E+074.42E+052.39E+078.12E+041.56E+076.17E+041.65E+071.48E+028.68E+061.63E+048.13E+0652.10E+021.64E+074.67E+052.40E+079.29E+041.58E+077.02E+041.78E+071.12E+021.01E+071.50E+047.76E+0662.15E+021.74E+074.58E+052.40E+079.36E+041.89E+076.69E+041.98E+071.32E+021.11E+071.55E+048.13E+06平均值copies/mL2.11E+021.77E+074.51E+052.34E+079.54E+041.67E+076.64E+041.86E+071.11E+021.09E+071.59E+048.20E+06標(biāo)準(zhǔn)偏差Scopies/mL26.61.49E+062.46E+048.55E+058.23E+031.82E+063.00E+031.70E+0625.41.88E+061.20E+032.69E+06相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）12.68.445.463.658.6310.94.529.1122.917.27.543.27A1.4方法正確度測(cè)試數(shù)據(jù)表A1-8共同樣品測(cè)試數(shù)據(jù)平行號(hào)共同樣（試樣2）產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）總微囊藻基因（micr）ABCDEFABCDEF測(cè)定結(jié)果（copies/mL）15.60E+065.46E+067.44E+064.05E+065.36E+064.16E+061.68E+072.26E+071.89E+072.13E+071.25E+078.34E+0625.00E+065.35E+066.54E+064.41E+064.04E+063.99E+062.05E+072.40E+071.45E+071.78E+079.59E+068.56E+0634.80E+065.73E+066.21E+064.26E+063.85E+063.58E+061.70E+072.21E+071.66E+071.86E+071.37E+078.29E+0644.57E+065.17E+067.72E+064.57E+063.80E+063.89E+061.82E+072.39E+071.56E+071.65E+078.68E+068.13E+0655.48E+065.17E+066.77E+064.20E+064.50E+063.86E+061.64E+072.40E+071.58E+071.78E+071.01E+077.76E+0665.22E+065.57E+069.12E+064.08E+065.04E+064.28E+061.74E+072.40E+071.89E+071.98E+071.11E+078.13E+06平均值x（copies/mL）5.11E+065.41E+067.30E+064.26E+064.43E+063.96E+061.77E+072.34E+071.67E+071.86E+071.09E+078.20E+06驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室平均值（copies/mL）5.08E+061.62E+07相對(duì)誤差RE（%）0.59%6.50%43.70%-16.14%-12.80%-22.05%9.26%44.44%3.09%14.81%-32.72%-49.38%

表A1-9產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）實(shí)際樣品加標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)平行號(hào)產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)測(cè)定結(jié)果copies/mL19.01E+012.39E+035.60E+062.58E+077.82E+041.70E+055.46E+063.08E+073.68E+049.57E+047.44E+062.16E+072.93E+033.13E+034.05E+062.37E+07NA1.25E+025.36E+062.35E+077.89E+036.64E+044.16E+062.53E+0726.80E+012.94E+035.00E+062.28E+077.98E+041.79E+055.35E+063.23E+074.23E+041.40E+056.54E+062.61E+073.24E+033.74E+034.41E+061.86E+07NA2.16E+024.04E+061.65E+078.40E+037.16E+043.99E+061.91E+0737.19E+012.61E+034.80E+062.50E+078.26E+041.74E+055.73E+062.98E+073.46E+049.81E+046.21E+062.26E+072.69E+033.24E+034.26E+062.72E+07NA1.84E+023.85E+062.53E+078.63E+035.44E+043.58E+061.87E+0746.66E+012.00E+034.57E+062.17E+078.37E+041.75E+055.17E+063.21E+073.72E+049.03E+047.72E+062.42E+072.81E+033.61E+034.57E+062.78E+07NA1.71E+023.80E+061.98E+071.15E+044.84E+043.89E+063.03E+0757.66E+012.65E+035.48E+062.12E+077.88E+041.81E+055.17E+062.98E+073.45E+048.50E+046.77E+062.20E+073.15E+033.41E+034.20E+062.90E+07NA2.01E+024.50E+062.83E+071.10E+045.22E+043.86E+061.73E+0766.95E+012.78E+035.22E+062.18E+078.37E+041.78E+055.57E+063.27E+073.22E+041.21E+059.12E+062.83E+072.87E+033.10E+034.08E+062.04E+07NA1.91E+025.04E+062.59E+078.58E+034.97E+044.28E+061.81E+07平均值、copies/mL7.38E+012.56E+035.11E+062.31E+078.11E+041.76E+055.41E+063.15E+073.61E+041.03E+057.24E+062.40E+072.93E+033.36E+034.26E+062.41E+07NA1.79E+024.39E+062.29E+079.24E+035.65E+043.95E+062.10E+07加標(biāo)量μcopies10^3/210^7/210^5/210^7/210^5/210^7/210^3/210^7/210^2/210^6/210^3/210^7/2加標(biāo)回收率%）1008281114858211388828311186

表A1-10總微囊藻基因（micr）實(shí)際樣品加標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)平行號(hào)總微囊藻基因（micr）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)濃度加標(biāo)測(cè)定結(jié)果copies/mL11.92E+022.14E+031.68E+073.79E+074.02E+051.76E+062.26E+073.33E+079.86E+041.29E+051.89E+073.29E+073.32E+046.83E+042.13E+073.51E+079.10E+012.30E+021.25E+073.83E+071.82E+046.75E+048.34E+062.82E+0721.78E+022.19E+032.05E+073.64E+074.54E+051.79E+062.40E+073.93E+071.04E+051.45E+051.45E+073.90E+072.94E+046.43E+041.78E+073.91E+079.99E+012.77E+029.59E+062.57E+071.55E+044.62E+048.56E+06246E+0732.56E+022.22E+031.70E+073.62E+074.80E+052.27E+062.21E+073.27E+071.02E+051.38E+051.66E+074.07E+073.43E+046.69E+041.86E+074.03E+078.13E+011.94E+021.37E+072.89E+071.51E+045.73E+048.29E+062.32E+0742.17E+022.12E+031.82E+073.69E+074.42E+051.90E+062.39E+073.98E+078.12E+041.15E+051.56E+073.63E+072.86E+046.17E+041.65E+073.40E+071.48E+022.33E+028.68E+062.01E+071.63E+045.03E+048.13E+062.97E+0752.10E+022.43E+031.64E+073.64E+074.67E+051.65E+062.40E+073.40E+079.29E+041.47E+051.58E+073.18E+072.94E+047.02E+041.78E+073.63E+071.12E+021.89E+021.01E+073.26E+071.50E+044.53E+047.76E+062.23E+0762.15E+021.89E+031.74E+073.71E+074.58E+051.90E+062.40E+073.64E+079.36E+041.36E+051.89E+074.27E+073.50E+046.69E+041.99E+073.18E+071.32E+022.40E+021.11E+072.43E+071.55E+046.16E+048.13E+062.41E+07平均值、copies/mL2.11E+022.17E+03E+073.68E+074.51E+051.87E+062.34E+073.59E+079.50E+041.35E+051.66E+073.70E+073.16E+041.59E+041.86E+073.60E+071.86E+072.25E+021.09E+072.83E+071.59E+045.41E+048.20E+062.52E+07加標(biāo)量μcopies10^3/210^7/210^6/210^7/210^5/210^7/210^3/210^7/210^2/210^6/210^3/210^7/2加標(biāo)回收率%）841129996871159610782839284A2方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)匯總A2.1方法檢出限、測(cè)定下限匯總表A2-1方法檢出限測(cè)定下限數(shù)據(jù)匯總表實(shí)驗(yàn)室號(hào)產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）總微囊藻基因（micr）檢出限（copies/mL）測(cè)定下限（copies/mL）檢出限（copies/mL）測(cè)定下限（copies/mL）A3815239.4157B26.910849.8199C2495.810.140.4D9.8939.66.3325.3E15.963.79.9639.8F301201664.1結(jié)論：各驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)編制組提供的統(tǒng)一方法，按操作步驟及流程進(jìn)行分析操作，最終的方法檢出限為各驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室所得數(shù)據(jù)的最高值。產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）檢出限為38copies/mL，測(cè)定下限為152copies/mL；總微囊藻基因（micr）檢出限為50copies/mL，測(cè)定下限為200copies/mL。A2.2方法精密度數(shù)據(jù)匯總表A2-2共同樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)匯總表實(shí)驗(yàn)室號(hào)產(chǎn)毒微囊藻基因（mcyb）總微囊藻基因（micr）xi（copies/mL）Si（copies/mL）RSDi（%）xi（copies/mL）Si（copies/mL）RSDi（%）A5.11E+063.97E+057.771.77E+071.49E+068.44B5.41E+062.23E+054.132.34E+078.55E+053.65C7.30E+061.05E+0614.41.67E+071.82E+0610.9D4.26E+061.99E+054.681.86E+071.70E+069.11E2.01E+065.56E+042.771.09E+071.88E+0617.2F3.96E+062.46E+056.218.20E+062.69E+063.27x（copies/mL）