(上課用)高效液相-(2011年3月)10-11-6

第十三章高效液相色譜法第一節(jié)概述

高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差別三、高效液相色譜儀流程圖四、特點(diǎn)一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）分析周期長(zhǎng)無(wú)法在線檢測(cè)2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動(dòng)相柱效高（H↓，n↑）分析時(shí)間大大縮短可以在線檢測(cè)二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)占有機(jī)物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%續(xù)前2．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤?、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置續(xù)前四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）第二節(jié)基本理論和條件選擇熱力學(xué)理論：塔板理論——平衡理論基礎(chǔ)動(dòng)力學(xué)理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇一、塔板理論二、速率理論（與GC對(duì)比）

1.續(xù)前1）渦流擴(kuò)散項(xiàng)及其影響next2.討論：

續(xù)前2）傳質(zhì)阻抗項(xiàng)及其影響

越大,流動(dòng)相傳質(zhì)阻力越大,因?yàn)榻M分接近兩相界面的阻力增大.比如:湍急的河水把小船送到離既定目標(biāo)更遠(yuǎn)的地方.圖示3）流動(dòng)相流速對(duì)HPLC板高的影響（與GC對(duì)比）圖示back三、HPLC法中分離條件的選擇1.固定相與裝柱方法的選擇：

選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm）首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2.流動(dòng)相及其流速的選擇：選粘度小、低流速的流動(dòng)相——甲醇，1ml/min

3.柱溫的選擇：

選室溫250C左右第三節(jié)各類高效液相色譜法

一、液固吸附色譜法（LSC）二、液液分配色譜法（LLC）三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）一、液固吸附色譜法（LSC）

流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑

1．分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異分離前提：K不等或k不等續(xù)前2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝膠作用特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物（1）硅膠表孔硅膠（薄殼硅膠）全多孔硅膠無(wú)定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108

堆積硅珠YQG3~4μm8×108理想

原理：吸附特點(diǎn)：峰易拖尾適用：分離極性化合物續(xù)前3．流動(dòng)相：底劑（烷烴）+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時(shí)間5．出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱6．硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液二、液液分配色譜法（LLC）1．分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法）缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失

固定液——極性→NLLC固定液——非極性→RLLC3．正相色譜——固定液極性>流動(dòng)相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱

適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動(dòng)相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分三、化學(xué)鍵合相色譜法（一）化學(xué)鍵合相（二）反相鍵合相色譜（三）正相鍵合相色譜（四）離子對(duì)色譜和離子抑制色譜(bondedphasechromatography,BPC)（一）化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面1．分離機(jī)制：分配+吸附（以LLC為基礎(chǔ)）2．特點(diǎn)：1）不易流失2）熱穩(wěn)定性好3）化學(xué)性能好4）載樣量大5）適于梯度洗脫（二）反相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：疏溶劑理論:非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)分子中的非極性部分與極性溶劑接觸時(shí),產(chǎn)生斥力,使溶質(zhì)分子中的非極性基取向,導(dǎo)致在溶劑中形成”空腔”,這種效應(yīng)稱為疏溶劑效應(yīng)或疏水效應(yīng).由于溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力,促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合,且締合反應(yīng)是可逆的.續(xù)前2．固定相：極性小的烷基鍵合相C8柱，C18柱(十八烷基硅烷鍵合相,octadecylsilyl,ODS柱——HPLC約80%問(wèn)題）3．流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性>固定相極性底劑+有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF(四氫呋喃)4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑P534表20-5，反相洗脫溶劑的強(qiáng)度因子（水-0，甲醇-3.0，乙腈-3.2），有機(jī)溶劑量增加，流動(dòng)相的溶劑強(qiáng)度增加，洗脫能力增強(qiáng)，組分的k降低5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問(wèn)題）7.必須注意烴類鍵合相適用的pH范圍為2-8pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合pH<2.0腐蝕柱子（三）正相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動(dòng)相：極性?。ㄍ琇SC）底劑+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇續(xù)前4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等（四）離子對(duì)色譜和離子抑制色譜1．反相離子對(duì)色譜法2．反相離子抑制色譜1．反相離子對(duì)色譜法（IPC或PIC）反相色譜中，在極性流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使被測(cè)組分與其中的反離子形成中性離子對(duì)，增加k和tR，以改善分離1）離子對(duì)試劑：P522烷基磺酸鈉→分析陽(yáng)離子和堿類（平衡離子選陰離子）四丁基季胺鹽→分析陰離子和酸類（平衡離子選陽(yáng)離子）2）影響k的因素a．與m的極性有關(guān)（同反相色譜）b．與R的鏈長(zhǎng)有關(guān)：R↑長(zhǎng)，極性↓小，tR↑，k↑3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿2．反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過(guò)加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達(dá)到改善分離的目的1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)pH一定的緩沖溶液2）k的影響因素：與流動(dòng)相極性有關(guān)，還與pH值有關(guān)選擇流動(dòng)相：應(yīng)同時(shí)考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——加入酸HActR↑，k↑堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0

pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合pH<3.0腐蝕柱子3）適用：極弱酸堿物質(zhì)pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物第四節(jié)影響分離的因素1．續(xù)前2．對(duì)流動(dòng)相的要求：1）與固定液不反應(yīng)2）對(duì)樣品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）與檢測(cè)器匹配：UV（常用，測(cè)定波長(zhǎng)應(yīng)大于溶劑的截止波長(zhǎng)）熒光，電化學(xué)4）使用粘度小、純度高的流動(dòng)相（甲醇，乙腈）使用前過(guò)濾、脫氣(超聲波脫氣）續(xù)前

3．洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個(gè)泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動(dòng)相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個(gè)泵）適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長(zhǎng)樣品）圖示第五節(jié)高效液相色譜儀1．泵：恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵：常用2．進(jìn)樣裝置1）隔膜進(jìn)樣（高分子有機(jī)硅膠墊→進(jìn)樣室）GC系統(tǒng)壓力較小，可以HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期）2）閥進(jìn)樣：不必停泵，六通閥輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→記錄輸液泵：——往復(fù)泵

缺點(diǎn):脈動(dòng)雙泵補(bǔ)償:克服脈動(dòng)(并聯(lián),串)(P536)六通進(jìn)樣閥(P537)續(xù)前3．色譜柱：直徑4~6mm,柱長(zhǎng)10~30cm柱效評(píng)價(jià)：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)R，n，fs（拖尾因子）柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗裝柱是一項(xiàng)技巧性很強(qiáng)的技術(shù)，它直接影響柱效。當(dāng)填料>20μm，較易裝，干法，輕叩。粒度<20μm，勻漿裝柱。（先將填料用等密度的有機(jī)溶劑勻漿，再高壓裝柱。無(wú)論裝柱還是買柱，要進(jìn)行柱效檢查。測(cè)度條件根據(jù)柱類型不同而選用不同的檢測(cè)。測(cè)出各組分的W，tR，求出n和R≥1.54．檢測(cè)器1）紫外檢測(cè)器：適于吸收紫外光的物質(zhì)可變波長(zhǎng)型max光電二極管陣列型2）熒光檢測(cè)器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)靈敏度高3）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器4）示差折光檢測(cè)器：利用折光率的差別靈敏度低，溫度要求嚴(yán)格5）電化學(xué)檢測(cè)器第七節(jié)定性、定量分析一、定性分析：

1、tR:γ12——相對(duì)保留值=

2、化學(xué)鑒定：對(duì)HPLC流出組分收集，用專屬性化學(xué)反應(yīng)對(duì)收集的分離物質(zhì)組分進(jìn)行定性。

3、聯(lián)機(jī)技術(shù)：HPLC—MS、HPLC—FTIR

質(zhì)譜縛立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜二、定量分析：與氣相色譜同。

1、外標(biāo)法：以試樣的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照物質(zhì)，相對(duì)比較求含量。（1）工作曲線法：用待測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液(Ci)s，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測(cè)量峰面積(Ai)s或峰高(hi)s，與(Ci)s繪制工作曲線，利用此曲線或它的回歸方程，計(jì)算樣品溶液的含量。（2）外標(biāo)一點(diǎn)法：（與氣相同）

mi=2、內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)選擇同氣相。（1）工作曲線法：在待標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中，同體積加入相同量的內(nèi)標(biāo)物、進(jìn)樣，分別測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的A或h，以Ai/As~(Ci)s作圖。（2）內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：在藥物分析中，校正因子常常不知，則先配已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品，加入一定內(nèi)標(biāo)，再將內(nèi)標(biāo)按同量加入同體積樣品中，分別進(jìn)樣。（Ci%）樣品=(3)、校正因子法：第一步：精稱被