細胞工程2講第1節(jié)植物人工繁殖

1896192019872006第二篇

人工繁殖技術

第2講

植物人工繁殖

第1節(jié)

植物組織培養(yǎng)1896192019872006上節(jié)課預習思考題：1.為什么植物組織培養(yǎng)能實現(xiàn)植物大規(guī)模繁殖？2.與傳統(tǒng)繁殖途徑的優(yōu)點在哪里？本講知識點1.組織培養(yǎng)再生植物2.人工種子本節(jié)重要問題1.激素在細胞分化中的調節(jié)作用2.植物經組織培養(yǎng)的再生途徑虎蕊蓬萊蝶好素聞香蝶趙孟堅春蘭圖芝蘭生於深谷，不以無人而不芳君子修道立德，不為困窮而改節(jié)

孔子清馨

淡雅空谷

幽蘭“達摩登錄世界最貴植物”達摩蘭產生臺灣東部，達摩日語即不倒翁的意思，花中帶花。徐木盛先生1971采集自山野，及其稀少，一般每芽百萬元臺幣以上，是蘭花愛好者追求的極品。蘭花組織培養(yǎng)：舊時王榭堂前燕，飛入尋常百姓家。?

1.細胞全能性(totipotency)：是指分化細胞保留著全部的核基因組，具有生物個體生長、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體的潛能。?

2.細胞分化（Differentiation）：是指細胞在形態(tài)、結構和功能上發(fā)生差異的過程，包括時間上和空間上的分化。重要知識回顧?

3.脫分化（Dedifferentiation）：又稱去分化，是指分化細胞失去特有的結構和功能變?yōu)榫哂形捶只毎匦缘倪^程，即分化的細胞在適當條件下轉變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過程。?

脫分化后的植物細胞經過細胞分裂，產生無組織結構、無明顯極性的松散的細胞團，稱之為愈傷組織（Callus）。?

4.再分化（Redifferentiation）：是指在離體條件下，無序生長的脫分化的細胞在適當條件下重新進入有序生長和分化狀態(tài)的過程。?

脫分化與再分化的關系：?

離體培養(yǎng)植物組織或細胞再生植株就是通過細胞脫分化和再分化實現(xiàn)的。?

脫分化是細胞全能性表現(xiàn)的前提，再分化是細胞全能性的最終體現(xiàn)，是再生的基礎。一

植物組織培養(yǎng)（Plant

tissue

culture）

定義：植物組織培養(yǎng)是將植物器官、組織、細胞或原生質體等外植體材料無菌條件下培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，在適當條件下誘發(fā)長成完整植株的一種技術。

（一）植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點?

1.周期短，便于人工控制培養(yǎng)條

件。繁殖速度快，經濟效益高。?

2.占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)

限制。?

3.繁殖珍稀、瀕危苗木和突變體

，是優(yōu)良品種培育的有效途徑。?

4.利于保持原來品種的特性。形象稱為“試管植物”（二）植物組織培養(yǎng)的應用1.快速繁殖：例如一株蘭花一年可以繁殖到400萬株。2.種苗脫毒：可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉等。3.突變育種：可以直接誘變篩選出具抗病、抗鹽以及高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。4.基因工程育種：基因轉導后通過組織培養(yǎng)途徑實現(xiàn)植株再生。5.遠緣雜交：利用離體受精技術和組織培養(yǎng)結合可以實現(xiàn)遠緣雜交，培育一些罕見的新物種。例如蘋果與梨的雜交種。（三）植物組織培養(yǎng)技術1.生物條件外植體（Explant）主要指用于離體培養(yǎng)的植物或組織切段。因素：不同植物品種同一品種不同取材部位、發(fā)育階段。一般：生長點、幼嫩組織2.物理條件：培養(yǎng)環(huán)境、組織培養(yǎng)室無菌環(huán)境，人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。需要一定的設備、器材和用具，同時還需要。?

3.化學條件：培養(yǎng)基?

（1）無機鹽?

培養(yǎng)基中無機鹽的濃度通常在

25mmol/L左右。?

根據(jù)添加量多少分為大量元素（濃度大于

0.5mmol/L）和微量元素(濃度低于0.5mmol/L)。?

大量元素：主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂。氮

、硫、磷是蛋白質、氨基酸、核酸和酶的主要成

分。?微量元素：主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬等。這些微量元素對于蛋白或酶的生物活性十分重要，并參與生物過程的調節(jié)。（2）有機物?

常用的有機物：糖類、氨基酸、維生素、醇類等。?

糖類：既可以作為碳源，又可以維持滲透壓。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應用。蔗糖使用濃度在2%—3%。?

氨基酸：是很好的有機氮源。最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白質水解產物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。?

維生素：對植物生長、分化等有促進作用。大多數(shù)植物組織

培養(yǎng)通常需加入一至數(shù)種維生素：鹽酸硫胺素（Thiamine,VB1

）、鹽酸吡哆醇（Pyridoxin,VB6）、Vc（抗壞血酸）、有時

還使用生物素、葉酸、VB12等。VB1對愈傷組織的產生和生活力

有重要作用，VB6能促進根的生長。Vc有防止組織變褐的作用。?

肌醇：對糖類的相互轉化有促進作用。能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。?

腺嘌呤：是合成細胞分裂素的前體物質之一。添加腺嘌呤能促進細胞合成分裂素，有利于細胞的分裂和分化，促進芽的形成。（3）調節(jié)物質?

植物激素(Phytohormone)：是植物自然狀態(tài)下產生的、對生長發(fā)育有顯著作用的微量有機物。能影響生長和分化。?

在個體發(fā)育中，不論是種子發(fā)芽、營養(yǎng)生長、繁殖器官形成以至整個成熟過程，主要由激素控制。?

植物體內的激素與細胞內某種稱為激素受體的蛋白質結合后，影響DNA、RNA和蛋白質的合成，并對特殊酶的合成起調控作用，從而表現(xiàn)出調節(jié)代謝的功能。生長素(auxin)?

生長素是由色氨酸通過一系列中間產物形成的。?

在植物組織培養(yǎng)中，生長素主要用來刺激細胞分裂和誘導根的分化。?

常用的生長素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA活力較弱。NAA、IBA是促進發(fā)根能力較強的生長調節(jié)物質，廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。2，4—D起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成。細胞分裂素（Cytokinin）?

細胞分裂素大多是嘌呤族衍生物，自然狀態(tài)下分裂素主要在根中形成；莖端、種子、果實也能合成分裂素。?

分裂素的生理作用主要是誘導芽的分化促進側芽萌發(fā)生長、促進細胞分裂與擴大。多用于誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖。在生根培養(yǎng)時使用較少或用量較低。?

主要有激動素（KT）、6-芐基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基腺嘌呤。其中ZT活性最強，但昂貴；常用的是6—BA。植物激素控制器官形成1956年米勒（Miller）與斯庫格（Skoog）提出生長素分裂素高：利于根和愈傷組織形成低:

有利于芽的形成適中：有利于根芽的分化（4）培養(yǎng)基及分類?

富鹽平衡培養(yǎng)基：是目前使用最廣泛的一類，代表性的培養(yǎng)基有MS、LS、BL、BM、ER等。特點是：無機鹽濃度高，微量元素種類齊全，濃度高；元素間比例適當，離子平衡性好，具有較強的緩沖能力、穩(wěn)定性好、營養(yǎng)豐富，一般培養(yǎng)時無需再加入有機成分。?

中鹽培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有Nitsch、Miller、Blaydes、H。大多是在MS培養(yǎng)基基礎上進行改良設計。特點是：大量元素無機鹽為MS的一半，微量元素種類減少、含量增高。維生素種類比MS增多，例如增加了生物素、葉酸等。?

低鹽培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有

White、WS、HE、HB。特點是：無機鹽、有機成分含量濃度低，多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。?

高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有B5、N6、SH。特點是：硝酸鉀濃度高，氨態(tài)氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（VB1）。

4.植物組織培養(yǎng)再生植株的途徑?

（1）器官發(fā)生途徑：成熟細胞→愈傷組織→出根出芽→

完整植株。?

（2）體細胞胚發(fā)生途徑：成熟細胞→分生細胞→胚狀體

→完整植株。以胡蘿卜為例器官發(fā)生途徑?

（1）啟動期：啟動誘導外植體細胞脫分化和分裂。培養(yǎng)基中添加一定濃度、種類和比例的外源激素刺激外植體細胞改變原來的代謝途徑來誘導細胞活化，重新獲得分裂能力。需要選擇合適的較高濃度的生長素誘導劑（如NAA、IAA、2-4D等）或細胞分裂素啟動誘導外植體細胞脫分化和分裂。?

（2）愈傷組織誘導：即細胞開始分裂并不斷增生子細胞的過程。這個階段一般需要降低激素濃度，有些情況下甚至不需要生長素和分裂素。?

（3）擬分生組織的形成：將愈傷組織轉移到有利于有序生長的條件下培養(yǎng)，細胞內部開始發(fā)生一系列形態(tài)和生理變化，分化出形態(tài)和功能不同的細胞。在若干部位出現(xiàn)類似形成層的細胞群，通常稱為“生長中心”，又可稱為“擬分生組織”。該過程是器官發(fā)生的一個轉變時期。?

（4）器官原基和器官的形成：擬分生組織形成后，一些細胞分化成為管狀細胞，進而形成維管組織，形成不同的器官原基，進一步分化出相應的組織和器官。調節(jié)激素比例，促進生根、發(fā)芽。體細胞胚發(fā)生途徑?

體細胞胚（Somatic

embryo）又叫胚狀體，是指離體培養(yǎng)條件下沒有經過受精過程而形成的胚胎類似物。?

體細胞胚發(fā)生途徑：是指體細胞在離體培養(yǎng)過程中經過了胚胎發(fā)育過程。體細胞胚起源于非合子細胞，因此不同于合子胚。（1）器官外植體直接發(fā)生途徑?

莖表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體分化細胞經過脫分化后均可以產生胚狀體。以葉片為外植體直接形成體細胞胚為例，一般經過兩個階段：?

1）誘導期。葉片表皮細胞或亞表皮細胞感受刺激后進入分裂狀態(tài)，形成小的瘤狀突起；?

2）胚胎發(fā)育期。瘤狀物繼續(xù)發(fā)育，經過球形胚、心形胚等階段最后形成體細胞胚

。?

（2）懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生途徑：在懸浮培養(yǎng)的細

胞中一些細胞可以產生胚性細胞團，一個胚性細

胞團可以發(fā)育成一個胚狀體，也可以產生多個胚

狀體。這種方式可以得到大量的胚狀體。?

（3）愈傷組織發(fā)生途徑：愈傷組織內部或表面

細胞均可以產生胚狀體。包括三個階段：???1）誘導外植體形成愈傷組織；2）誘導愈傷組織胚性化；3）體細胞胚形成。

5.植物組織培養(yǎng)存在的問題?

（1）玻璃化問題?

植物組織培養(yǎng)中，常會出現(xiàn)一些半透明狀的畸形

試管植物，這類植物體被稱為“玻璃苗”，這種

現(xiàn)象稱為玻璃化（Vitrification）現(xiàn)象，又稱過

度水化現(xiàn)象。?由于玻璃苗的組織結構和生理功能異常，因此分

化能力低，難以增殖成芽，也難以生根成苗，移

栽大田更難成活，已成為組培的一大問題。?

組織培養(yǎng)過程中試管苗的玻璃化現(xiàn)象主要是適應

性的生理問題，是不能很好適應培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)

境的結果。?

（2）褐變問題?

褐變（Browning）可分為酶促褐變和非酶促褐變，主要是酶促褐變。?

酶促褐變是由多酚氧化酶(Polyphenol

oxidase,PPO)催化多酚類化合物，使其發(fā)生氧化形成棕褐色的醌類物質和水；醌類物質經過非酶促聚合，形成黑褐色物質(羥醌與黑色素等)，引起褐變的發(fā)生。?

（3）微生物污染?

造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和內源菌。?

外部污染菌：主要由外植體帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底以及操作人員操作不慎造成。?

內源菌：外植體帶菌引起的污染與外植體的種類、取材季節(jié)、部位、預處理及消毒方法等密切相關。?

應該嚴格按照無菌操作，取材時應選擇嫩梢、新芽或胚作為外植體材料，對外植體進行徹底消毒。（4）品種限制目前被子植物組織培養(yǎng)成功的比較多。裸子植物很難脫分化誘導成具有全能性的細胞，因此組織培養(yǎng)成功的比較少。對于人工誘導體細胞的脫分化，不同生物的細胞脫分化能力不同，決定了組織培養(yǎng)再生的難以。6.

植物組織培養(yǎng)應用舉例寒蘭葉姿碧綠清秀、香氣沁人，是秋冬不可多得的名花，花期35－50天培養(yǎng)技術注意愈傷組織誘導、發(fā)芽、生根過程中激素等調節(jié)