常用培養(yǎng)基制備滅菌與消毒

常用培養(yǎng)基制備滅菌與消毒第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，PH7.0～7.2(后調(diào))第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日高氏1號培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。

第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日查氏合成培養(yǎng)基查氏合成培養(yǎng)基是用來分類和培養(yǎng)霉菌的培養(yǎng)基,其配方如下：NaNO33g,K2HPO41g,KCl0.5g,MgSO4.7H2O0.5g,FeSO40.01g,蔗糖30g,H2O1000ml,pH自然第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日麥芽汁培養(yǎng)基用來培養(yǎng)酵母菌,干麥芽粉加4倍水,在50-60℃保溫糖化3-4小時(shí)，用碘液試驗(yàn)檢查至糖化完全為止,調(diào)整糖液濃度,煮沸后，過濾，調(diào)pH為6.0。第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日消毒與滅菌消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加熱、過濾、輻射化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。

第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日加熱法：干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160－170C）加熱滅菌1－2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。3、注意事項(xiàng)：

1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；

2）溫度控制在<180°；

3）物品不能太擠；

4）溫度降至70°時(shí)才開箱門。

第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日濕熱法：原理：因?yàn)闈駸嶂芯w吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。高壓蒸汽滅菌法：1、設(shè)備：高壓滅菌鍋2、時(shí)間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。4、注意事項(xiàng)：

1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時(shí)方可打開。

第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見表2第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

常壓蒸汽滅菌：

對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。

煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時(shí)間10－15min，

超高溫殺菌

135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品滅菌。優(yōu)點(diǎn)：保持食品價(jià)值和營養(yǎng)成分。第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

過濾除菌：

原理：介質(zhì)在有壓力時(shí)阻隔微生物。適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。設(shè)備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。優(yōu)缺點(diǎn)：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。注意事項(xiàng)：1、壓力適當(dāng)；

2、無菌條件下進(jìn)行；

3、防止?jié)B透現(xiàn)象。

第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日

輻射滅菌：

原理：紫外線波長在200－300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強(qiáng)。此段波長易被細(xì)胞中核酸吸收；可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。

缺點(diǎn)：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。應(yīng)用：無菌室，醫(yī)院。

注意事項(xiàng)：對眼睛和皮膚有刺激作用。

第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

化學(xué)藥品滅菌：

原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。殺菌劑如重金屬離子；

抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。注意：與藥品的濃度高低，時(shí)間長短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸

福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日

分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。為什么要進(jìn)行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。常用的分離、純化方法：單細(xì)胞挑取法、稀釋涂布平板法稀釋混合平板法、平板劃線法

實(shí)驗(yàn)四微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日稀釋涂布平板法：

步驟：1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60℃時(shí)，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。

2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。

3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。

4、培養(yǎng)：高氏I號和查氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2days。

5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一致，保存。第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日

平板劃線法：

1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號和實(shí)驗(yàn)日期。2、劃線方法稀釋混合平板法：1、先加菌2、倒平板時(shí)注意培養(yǎng)基溫度3、混合均勻第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

微生物培養(yǎng)技術(shù)1、斜面接種2、液體培養(yǎng)基接種3、穿刺接種將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日觀察菌落形態(tài)并記錄序號來源大小形狀邊緣顏色表面代謝物種類第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)五：放線菌及霉菌形態(tài)觀察目的要求1.了解放線菌、霉菌的形態(tài)觀察的原理。2.學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法。3.初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征。第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理放線菌是一群絲狀，G+的細(xì)菌，在氣生菌絲末端形成孢子。細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，最適pH與細(xì)菌相似。主要以孢子方式進(jìn)行無性繁殖。其DNA堿基組成中GC含量特別高。超過任何已知的細(xì)菌。許多臨床應(yīng)用的抗生素都由鏈霉菌種產(chǎn)生。

放線菌(Actinomycetes)第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日分生孢子絲瓊脂表面基內(nèi)菌絲氣生菌絲Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基內(nèi)菌絲）andaerialmycelium（氣生菌絲）withchainsofconidiospores（分生孢子）第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日分生孢子絲瓊脂表面基內(nèi)菌絲氣生菌絲Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基內(nèi)菌絲）andaerialmycelium（氣生菌絲）withchainsofconidiospores（分生孢子）第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日放線菌生長到一定階段，大部分氣生菌絲分化成孢子絲，通過橫割分列的方式產(chǎn)生成串的分生孢子。孢子絲形態(tài)多樣，有直、彎曲、鉤狀、螺旋狀、輪生等多種形態(tài)。孢子也有球形、橢圓形、桿狀和瓜子狀等等。它們的形態(tài)構(gòu)造都是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。放線菌的菌落早期絨狀同細(xì)菌菌落月牙狀相似，后期形成孢子菌落呈粉狀、干燥，有各種顏色呈同心圓放射狀。第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日鏈霉菌的各種孢子絲結(jié)構(gòu)第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日鏈霉菌的分離：

pH中性偏堿

喜干（含水少）采用含各種無機(jī)鹽的選擇性培養(yǎng)基第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日已知放線菌能夠產(chǎn)生500多種抗生素。大多數(shù)抗生素對不同的細(xì)菌有獨(dú)特的療效有50多種被實(shí)際應(yīng)用Antibiotics放線菌Actinomycetes第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日霉菌(molds)

是絲狀真菌的總稱,即“發(fā)霉的真菌”。通常指菌絲體比較發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型子實(shí)體的真菌。常在潮濕的氣候下大量生長繁殖。第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)特征（Morphologicalcharacteristics）屬異養(yǎng)型真核生物，具有絲狀或管狀結(jié)構(gòu)，單個(gè)分支稱為菌絲。菌絲形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)稱為菌絲體。營養(yǎng)菌絲（vegetativemycelium）：汲取營養(yǎng)氣生菌絲（aerialmycelium）繁殖菌絲:孢子絲，進(jìn)行繁殖。第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日分類（classification）有隔菌絲：有隔菌絲中有橫隔膜將菌絲分隔成多個(gè)細(xì)胞，在菌絲生長過程中細(xì)胞核的分裂伴隨著細(xì)胞的分裂，每個(gè)細(xì)胞含有一至多個(gè)細(xì)胞核。橫隔膜可以使相鄰細(xì)胞之間的物質(zhì)相互溝通。如曲霉和青霉。無隔菌絲：菌絲中無橫膈膜，整個(gè)細(xì)胞是一個(gè)單細(xì)胞，菌絲內(nèi)有許多核，在生長過程中只有核的分裂和原生質(zhì)體質(zhì)量的增加，沒有細(xì)胞數(shù)目的增多。如毛霉和根霉。第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日nonseptate(2)septate第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日繁殖方式無性繁殖：芽生孢子節(jié)孢子孢囊孢子后垣孢子分生孢子有性繁殖：卵孢子接合孢子子囊孢子第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日Sporangiospores

孢囊孢子（Sporangiosporesareformedwithinasporangium）第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日節(jié)孢子Arthrospores第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日分生孢子Conidiospores第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日卵孢子（Oospores）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOosporesformation第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日接合孢子Zygospores第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日接合孢子形成過程第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日子囊孢子Ascospores第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日幾種常見霉菌屬主要特征分布作用與用途根霉屬菌絲無隔,單細(xì)胞迅速蔓延,有假根,孢子囊呈黑色,產(chǎn)生孢子囊和接合孢子常長在淀粉類食品上如饅頭、面包、甘薯等能將淀粉轉(zhuǎn)化為糖，用于生產(chǎn)糖化酶，釀造甜酒等曲霉屬菌絲分隔，分生孢子梗頂端膨大，頂囊上生輻射狀小梗菌落疏松、顏色多樣空氣、谷物、土壤和各種有機(jī)物上分解淀粉和蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，用于制曲、制醋、生產(chǎn)檸檬酸、酶制劑及糖化飼料等青霉屬菌絲分隔，孢子梗呈掃帚形，菌落由緊密到疏松，多呈藍(lán)綠色空氣、土壤及物品上，腐爛的柑橘上更多青霉素產(chǎn)生菌，也用于制備農(nóng)用抗生素和發(fā)酵飼料第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日根霉第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

根霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日曲霉第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日曲霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)左側(cè)分生孢子梗具有一層小梗；右側(cè)分生孢子梗具有二層小梗第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日

青霉第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日

青霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)

A單輪型B非對稱型C對稱二輪型第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)內(nèi)容人們設(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌和霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征。本實(shí)驗(yàn)采用插片法。第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日插片法:

倒平板→插片→接種→培養(yǎng)→鏡檢→記錄繪圖壓印法:

倒平板→劃線接種→挑取菌落→加蓋玻片→鏡檢→記錄繪圖埋片法:

倒瓊脂→切槽→接種→培養(yǎng)→鏡檢→記錄繪圖

第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日倒平板

將培養(yǎng)基熔化后，倒10-12毫升左右于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后使用.

插片

將滅菌的蓋玻片以45度角插入培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基中，插入深約為1/2或1/3。接種與培養(yǎng)

用接種環(huán)將菌種接種在蓋玻片與瓊脂相接的沿線，放置28℃培養(yǎng)3～7天。觀察

培養(yǎng)后菌絲體生長在培養(yǎng)基及蓋玻片上，小心用鑷子將蓋玻片抽出，輕輕擦去生長較差的一面的菌絲體，將生長良好的菌絲體面向的載玻片，壓放于載玻片上。直接在顯微鏡下觀察。

第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)

倒平板要厚一些，接種時(shí)劃線要密。插片時(shí)要有一定角度并與劃線垂直。觀察時(shí)，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，更換高倍鏡觀察。如果用0.1%美藍(lán)對培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察，效果會(huì)更好。

第五十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日思考題鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?你認(rèn)為霉菌和放線菌菌絲的主要區(qū)別是什么？第五十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)六、菌種保藏

幾種常用的保藏方法：

1、傳代培養(yǎng)法保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進(jìn)一步延長保存期。

2、載體法使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。第五十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日