第二章-分子克隆工具酶

2分子克隆工具酶概述限制性內(nèi)切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）其他分子克隆工具酶工具酶的定義o在生物技術(shù)中常用的各種工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。o工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。o自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復制和修復等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進而降解非己DNA的防御工具。o本章主要介紹用于基因工程的各種工具酶。常用的工具酶o工具酶名稱主要功能限制性核酸內(nèi)切酶restrictionendonucleasesDNA連接酶DNAligase

在DNA分子內(nèi)部的特異性的 堿基序列內(nèi)部進行切割將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體通過向3’端逐一增加核苷酸以填補雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性 催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的

5’－OH末端上 以RNA或DNA鏈為模板合成互補的cDNA鏈 將寡聚物尾巴加到了線性雙鏈 或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端DNA聚合酶IDNApolymeraseI多核苷酸激酶DNApolymerasekinease反轉(zhuǎn)錄酶reversetranscriptaseDNA末端轉(zhuǎn)移酶DNAterminalDeoxynucleatidy

transferase

(接下表格)o常用的工具酶(續(xù)上表格)工具酶名稱主要功能

去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團 降解DNA3’－OH末端的核苷酸殘基降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時也可切割雙鏈核酸分子的單鏈降解雙鏈DNA,RNA的5’及3’末端，高專一性單鏈核苷酸 能在高溫（72℃）下的單鏈DNA為模板， 從5’→3’方向合成新生的互補鏈

專一性降解RNA

內(nèi)切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA堿性磷酸酶BAPorCIP核酸外切酶IIIexonucleaseIII降解酶S1nucleaseS1核酸酶Bal31nucleaseBal31TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase核糖核酸酶RNase脫氧核糖核酸酶DNase2.1限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme)ooooooooooo限制與修飾（Restrictionandmodification）限制酶識別的序列限制酶產(chǎn)生的末端DNA末端長度對限制酶切割的影響位點偏愛（Sitepreference）酶切反應(yīng)條件星星活性（staractivity）單鏈DNA的切割酶切位點的引入影響酶活性的因素酶切位點在基因組中分布的不均一性Phageλ(k)（K菌株上生長的Phageλ）感染感染頻率下降許多

E.colikE.coliB【E.coliB限制λ(k)】2.1.1限制與修飾（Restrictionandmodification）

1.限制與修飾現(xiàn)象

①50年代后Luria和Human(1952),Bertani

和

Weigle(1953)發(fā)現(xiàn)細菌的“限制”現(xiàn)象：E.coliB修飾λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)細菌如何對λ噬菌體進行限制和修飾?②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB

對這些λ(K)進行了修飾。E.coli

菌株λ噬菌體感染率λKλBλCE.coli

K1

-410

-410E.coli

B

-4101

-410E.coli

C111表2-1λ噬菌體不同感染株對E.coli

不同菌株的感染率細菌的限制--修飾系統(tǒng)①1962年W.Arber(瑞士)發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是在λPhage的DNA上。②1965年，Arber發(fā)現(xiàn)修飾與λ的降解有關(guān)，提 出：細胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細胞中有限制-修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A成為N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成為5’-甲基胞嘧啶。R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。2.限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)???1968年，Meselson從E.coli

K株中分離出了第一個限制酶EcoK，同年Linn和Aeber從E.coli

B株中分離到限制酶EcoB。1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶HindⅡ，這是第一個分離到的Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶。HindⅡ限制性內(nèi)切酶識別位點和切割位點如下：

5'…GTPy↓PuAC…3' 3'…CAPu↑PyTG…5'由宿主控制的限制與修飾作用

由修飾甲基轉(zhuǎn)移酶和限制性核酸內(nèi)切酶兩種酶活性配合進行的

5’---------------GAATTC--------------3’

3’---------------CTTAAG---------------5’

EcoR

I限制作用

MEcoR

I修飾作用---G3’---CTTAA5’5’AATTC---3’

3’G----5’5’---GAATTC---3’3’---CTTAAG---5’

+EcoRIEcoRI與MEcoRI的限制與修飾作用機理限制性內(nèi)切酶的命名o限制性酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的1個首字母，再加上序號，將限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點列于表。3-4個字母組成,方式是:屬名+種名+株名+序號取屬名的第1個字母,且大寫取種名的第1個字母,小寫①取種名的第2個字母,小寫;②若種名有詞頭,且已命名過內(nèi)切酶,則取詞頭后的第一字母代替若有株名,株名則作為第4字母,是否大小寫,根據(jù)原來的情況而定若在同一菌株中分離了幾個限制性內(nèi)切核酸酶,則按先后順序冠以I、II、III,.....等基本原則首字母第2字母第3字母第4字母順序號限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點

要點

表條目Escherichia

ColiEcoRⅠRy13屬名種類株系編號3.限制與修飾系統(tǒng)的種類o根據(jù)酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為四類。o在已純化分類的3000多種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。ⅡⅠⅢ酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起三亞基雙功能酶(R，M，S亞基)二亞基雙功能酶識別位點4-6bp,大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)非對稱5-7bp非對稱切割位點在識別位點中或靠近識別位點無特異性，至少在識別位點外1000bp在識別位點下游24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)分開的反應(yīng)互斥同時競爭限制作用是否需用ATPNoYesYes表2-2各種限制與修飾系統(tǒng)的比較Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)o限制酶：一般是同源二聚體（homodimer

），由兩個彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在DNA鏈的兩個互補位點上。o修飾酶：單體，修飾作用一般由兩個甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。o它們識別回文對稱序列（palindromesequence），在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3'-羥基和5'-磷酸基團的DNA產(chǎn)物，需Mg2+，相應(yīng)的修飾酶只需SAM。識別序列主要為4-6bp，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異。oⅡs型（typeⅡs）限制與修飾系統(tǒng)，占5%，與Ⅱ型具有相似的輔因子要求，但識別位點是非對稱，也是非間斷的，長度為4-7bp，切割位點可能在識別位點一側(cè)的20bp范圍內(nèi)。o其限制酶和甲基化酶（即R亞基和M亞基）各作為一個亞基存在于酶分子中，另外還有負責識別DNA序列的S亞基，分別由hsdR、hsdM

和hsdS

基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。如EcoK

編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M2S,EcoB編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M4S2。oEcoB酶的識別位點如下，其中兩條鏈中的A*為甲基化位點，N表示任意堿基。TGA*（N）8TGCToEcoK酶的識別位點如下，其中兩條鏈中的A°為可能的甲基化位點。AA°C（N）6GTGCo但是EcoB酶和EcoK酶的切割位點在識別位點1000bp以外，且無特異性。Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)hsd:hostspecificityforDNArestrictionI類酶的作用方式(引自Lewin,1997)o在一定序列上識別DNA分子,并能同DNA分子作用,因其識別DNA后,要朝一個方向或兩個方向移動一段距離(通常為1000個堿基左右)，并且要形成一個環(huán)才能切割DNA,所以識別位點和切割位點不一致，產(chǎn)生的片段較大。Ⅲ型（typeⅢ）限制與修飾系統(tǒng)o種類更少，所占比例不到1%，如EcoP1和EcoP15。它們的識別位點分別是AGACC和CAGCAG，切割位點則在下游24-26bp處。oEcoP1是由兩個亞基組成，一個亞基(M亞基)負責位點識別和修飾。另一個亞基(R亞基)具有核酸酶的活性。切割DNA時需要ATP，Mg2+，也能被SAM激活，但并非必需。oⅢ類限制性內(nèi)切核酸酶(引自Lewin,1997)2.1.2限制酶識別的序列1．限制酶識別序列的長度o限制酶識別序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6個堿基。o當識別序列為4個和6個堿基時，它們可識別的序列在完

全隨機的情況下，平均每256個和4096個堿基中會出現(xiàn) 一個識別位點（44

=256，46

=4096）。o注意：識別位點存在的概率不同！2．限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)o限制酶識別的序列大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)，切割位點在

DNA兩條鏈相對稱的位置。o特例：（見下頁舉例）識別序列不是對稱的識別多種序列識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意堿基。EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A識別序列不是對稱的AccBSⅠCCG↓CTCBssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C識別多種序列AccⅠGT↓MKAC，M=A或C,K=G或T識別的序列呈間斷對稱AlwNⅠCAGNNNC↓TGDdeⅠC↓TNAGGT↑CNNNGACGANT↑C3．限制酶切割的位置o限制酶對DNA的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別。

2.1.3限制酶產(chǎn)生的末端1．限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matchedend）o識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生 的末端為匹配黏端，亦即黏性末端（cohesiveend）。o若在對稱軸5′側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯斷開產(chǎn)生5′

突出黏性末端；o若在3′側(cè)切割，則產(chǎn)生3′突出黏性末端。NNG↓AATTCNNNNCTTAA↑GNNEcoRⅠ＋NNGNNCTTAAAATTCNN GNNPstI5’----NCTGCA↓GN----3’3’----NG↑ACGTCN----5’5’----NCTGCA3’----NG

GN----3’ACGTCN----5’＋2．限制酶產(chǎn)生平末端（Bluntend）o在回文對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生 平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV

（GAT↓ATC）。5’----NCCC↓GGGN----3’SmaI5’----NCCC+3’----NGGG↑CCCN----5’ CCCN----5’ GGGN----3’

3’----NGGG平末端o產(chǎn)生平末端的DNA可任意連接，但連接效率較黏 性末端低。3．限制酶產(chǎn)生非對稱突出末端o當識別序列為非對稱序列時，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的識別切割位點如下：CC↓TCAGCGGAGT↑CGo有些限制酶識別簡并序列，其識別的序列中有幾種是非對稱的。如AccⅠ，它的識別切割位點如下:GT↓AT/CGACCATA/GC↑TGo有些限制酶識別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如DraⅢ，識別切割位點是CAC↑NNN↓GTG。

4．同裂酶（isoschizomer）o識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可 能不同。①同序同切酶識別序列和切割位置都相同，如HpaⅡ與

MapⅠ識別切割位點為C↓CGG。②同序異切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ識別的序列是相同的，但切

割位點不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC。③“同功多位”許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限 制酶的功能。如EcoRⅠ為G↓AATTC，ApoⅠ為R↓AATTY， 后者可識別前者的序列。④其他有些限制酶識別的序列有交叉，如在pUC系列質(zhì)粒的多克隆位點（multiplecloningsite,MCS）中有一個SalⅠ位點（G↓TCGAC），該位點也可被AccⅠ（GT↓MKAC）和Hinc

Ⅱ（GTY↓RAC）切割。R=A,GY=C,T5．同尾酶o許多不同的限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且 是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的黏性突出末端。這些 酶統(tǒng)稱為同尾酶（isocaudarner）。這些酶切割DNA

得到的產(chǎn)物可進行互補連接。oEcoRⅠG↓AATTCMfeⅠC↓AATTCoSpeⅠA↓CTAGTNheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGAoBamHⅠG↓GATCCBglⅡA↓GATCTSau3AⅠ/MboⅠ↓GATC

MunI：5`-CAATTG-3` 3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3` 3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新連接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`同尾酶（isocaudamer

）用途6．歸位內(nèi)切酶(了解）o有些線粒體、葉綠體、核DNA、T偶數(shù)噬菌體含 有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些內(nèi)含肽 （intein，蛋白質(zhì)剪切的產(chǎn)物）也有內(nèi)切酶的 活性。o這兩類內(nèi)切核酸酶稱為I-prefix和PI-prefix系 列內(nèi)切酶，它們識別的序列很長。I-prefix系 列酶是由在RNA水平上剪切的產(chǎn)物編碼的，PI- prefix系列酶是在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物。o這類內(nèi)切酶也稱為歸位內(nèi)切酶（homing

endonuclease）。2.1.4DNA末端長度對限制酶切割的影響o限制酶切割

DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。o不同的酶對識別序列兩端的長度有不同的要求,見表2-4。o在設(shè)計PCR引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。限制酶待測的寡核苷酸序列酶切活性2h20hAccⅠCCGGTCGACCGG00Hin

dⅢCAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG1075EcoRⅠGGAATTCC＞90＞90PstⅠGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG（N）14＞90＞90CTGCAG（N）2000表2-4靠近DNA片段末端的切割效率（%）限制性內(nèi)切酶的活性單位o可用酶單位（unit）來描述其量的多少。o1個單位酶是指在建議使用的緩沖液及溫度下，在20μl

反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1μgDNA完全消化所需的酶量。應(yīng)該記的縮寫：Tris:三羥甲基氨基甲烷BSA:牛血清白蛋白DTT:二硫蘇糖醇DMSO:二甲基亞砜o在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。o在設(shè)計PCR引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。2.1.5位點偏愛某些限制酶對同一底物中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，即對 不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率，這種 現(xiàn)象稱作位點偏愛（sitepreference）。oEcoRⅠ酶切割λ噬菌體DNA中的5個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍；2.1.6酶切反應(yīng)條件1．緩沖液o常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定pH值的緩沖劑、Mg2+、DTT（二硫蘇糖醇）以及BSA（牛血清白蛋白）。opH7.0-7.9（在25℃時）；oMg2+作為酶的活性中心，由MgCl

2或乙酸鎂提供；濃度常為10mmol/L；DTT濃度常為1mmol/L。o有時緩沖液中還要加入100μg/mlBSA。o不同的酶對離子強度的要求差異很大，據(jù)此可將將限制酶緩沖液按離子強度的差異分為高、中、低3種類型，離子強度以NaCl來滿足，濃度分別為100mmol/L、50mmol/L和0mmol/L。酶標準緩沖液中的NaCl濃度 ／（mmol／L）限制酶的活性0.5×1×2×EcoRⅠ10050-7575-100100HindⅢ5025-50100100HincⅡ100100100100KpnⅠ010010025-50PstⅠ10075100100SAlⅠ100﹤25﹤25100ApaⅠ010010025-50表2-5標準緩沖液中的NaCl濃度和限制酶的活性2．反應(yīng)溫度o反應(yīng)溫度大多數(shù)為37℃，一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃。o高溫作用酶在37℃下的活性會下降，多數(shù)僅為最適條件下的10-50%。如TaqⅠ限制酶（正常反應(yīng)溫度為65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；ApoⅠ（正常反應(yīng)溫度為50℃），37℃只有在50℃時活性的50%。o銷售商在產(chǎn)品說明中都會標明最佳反應(yīng)溫度。3．反應(yīng)時間o反應(yīng)時間通常為1h或更多，許多酶延長反應(yīng)時間可減少酶的用量。oEcoRⅠ若反應(yīng)16h，所需酶量為正常酶切時間的1/8，即若反應(yīng)時間為16h，則所用酶量為只切1h的1/8。o其他一些酶也有類似情況，如HindⅢ為1/8；KpnⅠ為1/4；BamHⅠ為1/2。4．終止酶切的方法oEDTA可螯合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?0mmol/L；o加熱是常用的方法，對于最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20min可使酶活性大部分喪失。o對于在80℃作用20min也有不失活的酶，如最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶BglⅡ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶Tth111Ⅰ和TspRⅠ，以及50℃酶Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。Ⅱ型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：

(1)使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解；(2)低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切；(3)一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切。2.2甲基化酶（Methylase）2.2.1甲基化酶的種類o在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶（methylase）。o原核生物甲基化酶作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。1．Dam甲基化酶oDam可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。o有些限制酶對Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相應(yīng)的序列，如BclⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ等。o對甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ、BalⅡ和PvuⅠ等。MboⅠ和Sau3AⅠ識別和切割位點相同，但其差異就在于前者對甲基化敏感。2．Dcm甲基化酶oDcm識別CCAGG或CCTGG序列，在第二個胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。o受Dcm甲基化作用影響的酶有Acc65Ⅰ、AlwNⅠ、ApaⅠ、EcoRⅡ和EaeⅠ等。o不受此甲基化影響酶有BanⅡ、Bg1Ⅰ、BstNⅠ、KpnⅠ和NarⅠ等。3．EcoKⅠ甲基化酶oEcoKⅠ甲基化酶的識別位點少，識別AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。4．SssⅠ甲基化酶oSssⅠ甲基化酶來自原核生物（Spiroplasmasp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。o甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化鏈（新合成鏈）的DNA鏈。o許多酶對此甲基化敏感，如AatⅡ、ClaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ等，也有不敏感的，如BamHⅠ、EcoRⅠ、SphⅠ和KpnⅠ。2.2.2依賴于甲基化的限制系統(tǒng)oE.coli有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)McrA、McrBC和Mrr，只識別經(jīng)過甲基化的序列，都限制由CG甲基化酶（M.SssⅠ）作用的DNA（限制即消化降解）。oMrr限制m6A；McrA限制HpaⅡ甲基化修飾的位點；McrBC切割（G/A）m5C；o大多數(shù)常用的E.coli都含這三個限制系統(tǒng)中的1個或幾個。2.2.3甲基化對限制酶切的影響1．修飾酶切位點oHincⅡ可識別四個位點（GTCGAC、GTCAAC、GTTGAC和GTTAAC），甲基化酶M.TaqⅠ可甲基化TCGA中的A，所以M.TaqⅠ處理DNA后，GTCGAC將不受HincⅡ切割。oM.MspⅠ修飾的產(chǎn)物為m5CCGG，在BamHⅠ識別位點（GGATCC）前面如果為CC或后面為GG，那么經(jīng)M.MspⅠ處理的DNA（GGATm5CCGG）對BamHⅠ不敏感（即抵抗切割）。2．產(chǎn)生新的酶切位點o通過甲基化修飾可產(chǎn)生新的酶切位點。DpnⅠ是依賴甲基化的限制酶，TCGATCGA受M.TaqⅠ處理后形成甲基化（A）產(chǎn)物TCG*ATCG*A，其中G*ATC即為DpnⅠ位點。3．對基因組作圖的影響o利用限制酶對甲基化的敏感性差異研究哺乳動物m5CG、植物m5CG和m5CNG、腸道細胞Gm6ATC的甲基化水平和分布。TCGA甲基化TCGAm6

TCGA+TCGA

或DNA中的TCGATCGA序列連接酶

TCGATCGA

M.TaqITCGAm6TCGAm6DpnI切點③構(gòu)建新的酶切位點① ②DpnI是唯一識別GAm6TC的限制酶，而不降解GATC。

M.TaqI可使M.RECH3RERERERERERECH3與載體相連RE

甲基 化酶

RERE

人工 接頭CH3RE

RE用于基因組文庫的建立用于cDNA

的連接

RERE

RE CH3CH3RECH32.3DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）o主要活性是催化DNA的合成（在有模板，引物，dNTP等的情況下）及其相輔的活性。o原核細胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關(guān)。聚合酶Ⅰ是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長；聚合酶Ⅱ則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；聚合酶Ⅲ在細胞中存在的數(shù)目不多，是促進DNA鏈延長的主要酶。基因工程研究中常用的聚合酶聚合酶類：大腸桿菌DNA聚合酶I

大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow酶

T4DNA聚合酶

T7DNA聚合酶修飾的T7DNA聚合酶TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶作用：在DNA模板鏈上將dNMP連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化合成以模板互補的DNA序列共同特點：具有催化核苷酸聚合能力，但在外切酶活性，聚合速率等方面各有差別。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)合成能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高常用DNA聚合酶的特性比較2.3.1大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolymeraseⅠ）1．E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的活性oE.coli

DNA聚合酶Ⅰ為單鏈多肽（109kDa），有3種活性。①5‘--3’DNA聚合酶活性反應(yīng)底物為單鏈DNA及引物（帶3‘-OH基）或5’突出的雙鏈DNA。Mg++,dNTPDNA聚合酶Ⅰ②5‘--3'外切核酸酶活性o反應(yīng)底物是雙鏈DNA或DNA:RNA雜交體，它可從5‘端降解雙鏈DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）。Mg++,dNTPDNA聚合酶Ⅰ

③3'--5'外切酶活性o反應(yīng)底物是帶3‘-OH的雙鏈DNA或單鏈DNA，其活性從

3’-OH端降解DNA，可被5‘--3’聚合活性封閉，也可被 帶5‘磷酸的dNMP所抑制。

Mg++DNA聚合酶ⅠMg++,dNTP DNA聚合酶Ⅰo3’-5’外切酶活性與DNA聚合酶的校正功能有關(guān)。④交換（置換）反應(yīng)o如果只有一種dNTP存在，3‘--5’外切活性將從3‘-OH端

降解DNA，然后在該位置發(fā)生一系列連續(xù)的合成和外切反 應(yīng)，直到露出與該dNTP互補的堿基。o總之，在沒有dNTP

的情況下，外切活性占主導地位，而 當存在足夠的dNTP

時，外切活性和合成活性將處在動態(tài) 平衡中，結(jié)果使得雙鏈DNA成為平末端。2．E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的用途①切口平移法（nicktranslation）標記DNA②用于cDNA

克隆中的第二鏈，即單純的DNA聚合活性。但由于具有5‘--3’外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用Klenow

酶和反轉(zhuǎn)錄酶（詳見后文）。③對3'突出端的DNA作末端標記（交換或置換反 應(yīng)），但是此反應(yīng)用T4或T7DNA聚合酶效果會更好 （詳見后文）。交換或置換反應(yīng)2.3.2KlenowDNA聚合酶oKlenowDNA聚合酶是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenow

frgment），或E.coli

DNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coli

DNApolymeraseⅠlargefragment）。o它也可以通過基因工程得到，分子量為76kDa。o由于沒有5′―3′外切活性，使用范圍進一步擴大。用途①補平3′凹端DNA使用單純的DNA合成活性。注意要 加足夠的dNTP；如果使用帶標記的dNTP，則可對DNA

進行末端標記。②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性作用下，可切除突出的3′凸端。③通過置換反應(yīng)對DNA進行末端標記該作用已經(jīng)被T4

或T7DNA聚合酶代替；它還可以在補平3′凹端的過 程中進行標記。④在cDNA克隆中合成第二鏈⑤隨機引物標記⑥應(yīng)用于Sanger雙脫氧鏈末端終止法的DNA測序（被T7DNA聚合酶取代）⑦應(yīng)用于PCR反應(yīng)，被Taq

DNA聚合酶等取代⑧在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA2.3.3T4噬菌體DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）oT4噬菌體DNA聚合酶來源于T4噬菌體感染的E.coli，分子量為114kDa。o與Klenow酶活性相比有如下幾個特點：①外切酶活性對單鏈比對雙鏈更強，比Klenow強100-1000倍。酶活性.可用替代/置換合成法標記探針。③補平或標記3’末端凹陷的DNA分子DNA片段的同位素末端標記5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’

5’G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’T4-DNApolMg2+5’ppp

dN

5’pppdA（a-32P-dATP）T4-DNApol5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’2.3.4T7噬菌體DNA聚合酶（T7phageDNApolymerae）蛋白質(zhì)復合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個是宿主蛋白的硫氧還蛋白。o是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強的一個，產(chǎn)物平均長度大，在測定核苷酸序列時有優(yōu)勢。o活性與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類

似，但3′―5′外切活性為Klenow的1000倍。o可替代T4的功能并可用于長模板的引物延伸。商品化的測序酶oSequenase（測序酶）：美國UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3′―5′外切活性。oSequenaseVersion2：切除了所有的3′―5′外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進行測序的理想用酶。2.3.5耐熱DNA聚合酶o耐熱DNA聚合酶在高溫下有DNA聚合活性，來自噬高溫的細菌，主要用于PCR反應(yīng)，如Taq

DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、Pfu

DNA聚合酶、Pwo

DNA聚合酶和Tth

DNA聚合酶等。oAMV逆轉(zhuǎn)錄酶分子量為1.6×105dal,由α、β兩種亞基組成，具有5’→3’聚合作用的反轉(zhuǎn)錄酶活性和

RNaseH活性，這種酶又稱依賴于RNA的DNA聚合酶。oM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶是單鏈多肽，84kDa，其RNAseH活性弱，有利于合成較長cDNA。其基因工程產(chǎn)品純度高。2.3.6反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）有兩種反轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)商品化：一種來自禽成髓細胞瘤病毒(AMV)；另一種是鼠白血病病毒(Mo-MLV)基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+

dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’o用途:1.可以mRNA為模板合成單鏈cDNA；2.也可以單鏈cDNA為模板合成雙鏈DNA；3.還可利用單鏈DNA或RNA作模板合成分子探針。這是分離真核生物基因制備cDNA文庫常用的方法。探針可用于檢測DNA或RNA。2.3.7末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）o是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。①合成方向5’→3’②合成時不要模板，但底物至少要3個核苷酸，③對dNTP非特異性，任一種都可以作底物，④可催化3’－OH末端單鏈或3’－OH突出的雙鏈，需要Mg++或Mn++，⑤用Co++代替Mg++作輔助因子，可在平末端DNA分子上進行末端轉(zhuǎn)移。pmol3′-OH:μM

dNTPdAdCdGdT1:0.11～101～51～51～101:1.510～3010～3010～2010～351:3.0100～

200100～

20015～35200～

2501:15400～

500400～

50015～35300～

400表2-6末端轉(zhuǎn)移酶形成的同聚尾的長度①給載體或cDNA加上互補同聚物尾，

②標記DNA片段的3’－OH端，可用α－32P－dNTP也可催化非放射性標記物參入DNA3’－末端，③合成多聚脫氧核苷酸同聚物。用途2.4其他分子克隆工具酶2.4.1依賴于DNA的RNA聚合酶（DNA dependentRNApolymerase）o依賴于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌體RNA聚合酶和T4

或T7噬菌體RNA聚合酶。1．活性o轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識別DNA中各自特異的啟動子序 列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它與DNA聚合酶 不同，無需引物，但需識別特異性位點。2．用途①體外合成RNA分子。②用于表達外源基因。2.4.2連接酶（ligase

）DNA連接酶的基本反應(yīng)特性o催化雙鏈DNA切口處的5'-磷酸和3'-羥基生成磷酸二酯鍵o連接反應(yīng)需要供給能量。大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。DNA連接酶的作用機理1．T4DNA連接酶（T4DNAligase）oT4DNA連接酶的分子量為68kDa，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。反應(yīng)底物為粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA。低濃度的聚乙二醇PEG（一般為10%）和單價陽離子（150-200mM

NaCl）可以提高平端連接速率。o連接反應(yīng)條件需要ATP，若在16℃反應(yīng)，大約需4小時；若在4℃反應(yīng)，則需反應(yīng)過夜。2．E.coliDNA連接酶（E.coli

DNAligase）o與T4DNAligase活性相似，但需NAD+參與，且其平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA。作cDNA克隆時，不會將RNA連接到DNA，不連接RNA。3．Taq

DNA連接酶oTaq

DNA連接酶可在兩個寡核苷酸之間進行連接反應(yīng)，同時必須與另一DNA鏈形成雜交體，相當于連接dsDNA中的缺口，作用在45℃-65℃，需NAD+。TDNAligase

4E.coliDNA

ligase來源T噬菌體

4大腸桿菌分子量68,00075,000輔助因子ATP

+NAD底物1.雙鏈DNA分子的粘,平端2.RNA-DNA雜和體,RNA鏈缺口3.雙鏈DNA中的單鏈缺口同源互補粘端 雙鏈分子中的單鏈 缺口應(yīng)用范圍廣泛，效率高窄影響連接反應(yīng)的因素1．反應(yīng)時間與溫度：連接酶最適的反應(yīng)溫度應(yīng)是37℃，但 在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，因此連接反 應(yīng)常采用的最佳溫度一般在4-16℃間，通常多選用12- 16℃30分鐘到16小時。2．連接酶的用量：粘性末端DNA連接的酶用量在0.1單位時 就可以達到最佳的連接效果，而平端DNA連接所需酶的 至少需要提高10-20倍。3．DNA底物的濃度：一般情況下對于連接200-500bp的外源DNA連接體積在0.1-0.3ug/10ul。插入片段:載體分子的摩爾比為3:1為較好。4．其他干擾因素：EDTA，雜蛋白質(zhì)，存留有活性的酶等影響酶切的因素也影響連接。4．T4RNA連接酶oT4RNA連接酶可以催化單鏈DNA或RNA的5′-磷酸與另一單鏈DNA或RNA的3′羥基之間形成共價連接。o可用于標記RNA的3′末端、單鏈DNA或RNA的連接、增強T4DNA連接酶的連接活性以及合成寡核苷酸。2.4.3T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）o該酶催化γ－磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或RNA分子的5’－OH末端。o可分為正向反應(yīng)和交換反應(yīng)標記法。o用途:該酶主要用于對缺乏5′-磷酸的DNA或合成接頭進行磷酸化,同時可對末端進行標記。正向反應(yīng)：+r-32P-ATP+ADP5’OHDNA---- or5’OHRNA----

Mg++T4kinase5’[32P]DNA or 5’[32P]RNA交換反應(yīng)：反應(yīng)物中r-32P-ATP和ADP超量時，該酶就會催化DNA分子末端發(fā) 生交換+r-32P-ATP+ADP5’PDNA or5’PRNA

Mg++T4Kinase5’[32P]DNA or5’[32P]RNA+ATP+ADP2.4.4堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）o來源:牛小腸堿性磷酸酶（Calfintestnalalkalinephosphatase），簡稱CIP或CIAP， 細菌的堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase,BAP）蝦的堿性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase,SAP）。o均能催化除去DNA或RNA5′磷酸的反應(yīng)。o通過去除5′磷酸基團，可用于防止DNA片段自身連接，或標記（5′端）前除DNA或RNA5′磷酸。堿性磷酸酶活性2.4.5核酸酶（nuclease）1．BAL31核酸酶（BAL31nuclease）o來源:交替單胞菌（alteromonas

espejiana）BAL31o主要活性:3′外切核酸酶活性，可從線性DNA

兩條鏈的3′端迅速去除單核苷酸，隨后可從單 鏈DNA內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短 了的平端雙鏈DNA分子（約占10-20%）以及帶 有約5個核苷酸突出單鏈的截短分子（約占80- 90%）。對于所形成的單鏈突出，可用DNA聚 合酶補平。2．Sl核酸酶（S1nuclease）o來源:米曲霉（

aspergillus

oryzae）o作用方式:降解單鏈DNA和RNA，包括雙鏈分 子中的單鏈區(qū)，產(chǎn)生5’－磷酸化單核苷酸或寡核苷酸。

對于雙鏈DNA或RNA以及DNA：RNA雜合鏈 的作用相對較低但大大提高酶量也可降解雙鏈

DNA，特別對是有切口或缺口的雙鏈DNA。o用途:用于分析DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，給

RNA分子定位，證明基因內(nèi)部內(nèi)含子的存在;

去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端;打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。3．綠豆核酸酶（mungbeannuclease）o來源于綠豆芽，與Sl酶相似，但比Sl酶更溫和。在大切口上才切割，更容易使雙鏈DNA突出端變成平端。4．核糖核酸酶A（ribonucleaseA或RNaseA）o來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3′端?？沙NA:RNA中未雜交的RNA區(qū)，可用來確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。廣泛用來去除DNA樣品中的RNA。5．脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）o來源:牛胰，是內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA。在Mg2+存在下，獨立作用于每條DNA鏈，且切割位點隨機。在Mn2+存在下，它可在兩條鏈的大致同一位置切割dsDNA，產(chǎn)生平端或1-2個核苷酸突出的DNA片段。o用途:切口平移標記時在dsDNA上隨機產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口，以將分子截短（在亞硫酸氧鹽介導的誘變前）；建立隨機缺失的嵌套缺失體，用于功能分析或測序；在DNA酶足跡法（DNAfootprinting）中分析蛋白:DNA復合物；除去RNA樣品中的DNA。6．外切核酸酶Ⅲ（exonuleaseⅢ）o大腸桿菌外切核酸酶Ⅲ催化從dsDNA3′-OH逐一去除單

核苷酸的反應(yīng)，底物為dsDNA或線狀和帶切口或缺口的 環(huán)狀DNA，反應(yīng)結(jié)果是在dsDNA上產(chǎn)生長長的單鏈區(qū)。o該酶還有對無嘌呤DNA特異性內(nèi)切核酸酶活性、RNaseH活性和3′-磷酸酶活性（去磷酸）。o但不降解核酸內(nèi)的磷酸二酯鍵，也不降解單鏈DNA及帶3′突出的dsDNA。o該酶持續(xù)作用能力不強，產(chǎn)物為切割程度不相上下的群體，有利于分離長短不等的DNA。7．核糖核酸酶H（ribonucleaseH或RNaseH）o性質(zhì):內(nèi)切核酸酶，特異性水解與DNA雜交的RN