轉(zhuǎn)錄組學及研究策略

轉(zhuǎn)錄組學及研究策略概述轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）：特定物種、組織或細胞轉(zhuǎn)錄的所有RNA（轉(zhuǎn)錄物）的集合。包括：mRNA（messengerRNA）和非編碼RNA（non-codingRNA）通過比較轉(zhuǎn)錄組或基因表達譜以揭示生物學現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機制，是高通量組學研究的常用策略。本章內(nèi)容1、RNA基因2、轉(zhuǎn)錄組學研究方法DNA微陣列（DNAmicroarray）RNA測序（RNA-Seq）3、轉(zhuǎn)錄組學研究應用1、RNA基因RNA基因：產(chǎn)生非編碼RNA的基因。RNA種類大?。╪t）亞類/亞家族不同類型數(shù)目功能rRNA~120-500012S、16S各一個線粒體核糖體組分5S、5.8S、18S、28S各一個胞質(zhì)核糖體組分tRNA~70-80線粒體家族22編碼線粒體mRNA胞質(zhì)家族49編碼核基因產(chǎn)生的mRNAsnRNA~60-360剪接體家族9U1、U2、U4、U5和U6加工標準GU-AG內(nèi)含子；U4atac、U6atac、U11和U12加工罕見AU-AC內(nèi)含子非剪接體許多U7加工組蛋白3′mRNA；7SK通用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；Y家族參與染色體DNA復制和細胞增殖調(diào)控snoRNA~60-300C/D246rRNA成熟，2′-O-核糖甲基化H/ACA94rRNA成熟，假尿苷化scaRNA25核內(nèi)Cajal小體內(nèi)特定snRNA成熟RNA核糖核酸酶~260-3202RNaseP切割pre-tRNA；RNaseMRP切割核內(nèi)rRNA，參與啟動mtRNADPH復制RNA種類大?。╪t）亞類/亞家族不同類型數(shù)目功能混雜小胞質(zhì)RNA~80-500BC2001神經(jīng)RNA調(diào)節(jié)樹突蛋白生物合成，源于Alu重復7SLRNA3信號識別顆粒（SRP）組分介導分泌蛋白插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔TERC（端粒酶RNA組分）1端粒酶組分，核糖核蛋白以TERC為模板合成端粒cDNAVaultRNA3胞質(zhì)VaultRNP組分，被認為在抗藥中發(fā)揮作用YRNA460kD核糖核蛋白組分，激素自身免疫反應重要靶點miRNA~22>70個家族~1000在基因調(diào)控中多種重要作用，特別是發(fā)育和癌癥piRNA~24-3189個獨立簇>15,000常源于重復，僅在生殖細胞中表達限制過量轉(zhuǎn)座子活性內(nèi)源性siRNA~21-22許多可能超過10,000常源于假基因、反向重復等，參與體細胞基因調(diào)控也可能調(diào)控一些轉(zhuǎn)座子lncRNA通常>1kb許多>3000調(diào)控基因表達，一些涉及單等位基因表達和反義調(diào)節(jié)因子rRNA核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）小亞基：18S大亞基：28S、5.8S和5S5SrRNA基因?250個基因28S、5.8S和18SrRNA?核仁組織區(qū)（NOR）近端著絲粒染色體（13、14、15、21和22）13kb多基因轉(zhuǎn)錄單位，串聯(lián)重復30-40次核糖體DNA（rDNA）tRNA轉(zhuǎn)運RNA（transferRNA，tRNA）>500個細胞質(zhì)tRNA基因，49個家族snRNA小核RNA（smallnuclearRNA，snRNA）富含尿嘧啶（U），結(jié)合多種蛋白?snRNP剪接體（spliceosome）snRNA主要（GU-AG）剪接體?U1、U2、U4、U5和U6次要（AU-AC）剪接體?U11、U12、U4atac、U5和U6atac非剪接體snRNA：U1、U2、U7、7SKRNA和YRNAsnoRNA和scaRNA小核仁RNA（smallnucleolarRNA，snoRNA）位于核仁rRNA修飾小Cajal體RNA（smallCajalbodyRNA，scaRNA）又稱螺旋小體snRNA成熟piRNAPiwi蛋白相互作用RNA（Piwi-protein-interactingRNA，piRNA）24-31nt表達于哺乳動物生殖細胞與piwi蛋白結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)座子（transposon）染色質(zhì)構(gòu)象（chromatinconfirmation）DNA甲基化（methylation）組蛋白修飾

?組蛋白密碼（histonecode）ATP-依賴的染色質(zhì)重塑復合體DNA甲基化?沉默表達甲基化檢測

?用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。1、亞硫酸氫鹽測序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化；2、甲基化特異性PCR（Methylation-specificPCR，MSP）設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR，通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化；3、高分辨率熔解曲線（High

ResolutionMelting，HRM）在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島，若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導致熔解溫度的變化。組蛋白修飾染色質(zhì)構(gòu)象技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）染色質(zhì)構(gòu)象技術(shù)染色體構(gòu)象捕獲（chromosomeconformationcapture，3C，4C）endo-siRNA內(nèi)源性短干擾RNA（shortinterferingRNA，endo-siRNA）產(chǎn)生于假基因（pseudogene）轉(zhuǎn)錄介導特異性基因沉默RNA干擾（RNAinterference，RNAi）保護細胞抵御病毒和轉(zhuǎn)座元件經(jīng)Dicer切割成短干擾RNA（siRNA），21bp結(jié)合Ago，其中一條鏈（隨從鏈）降解，另一條鏈（引導鏈）激活argonaut復合體，并與其互補的RNA結(jié)合RNA誘導的沉默復合體（RISC）RNA誘導的轉(zhuǎn)錄沉默復合體（RITS）miRNA微RNA（microRNA，miRNA）是一類大小約為22個堿基的小RNA分子。通過與靶基因的mRNA序列3′-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。通過抑制蛋白質(zhì)的翻譯或降低mRNA的穩(wěn)定性，從而抑制靶基因的表達。microRNA在物種進化中相當保守，在動物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的microRNA表達均有嚴格的組織特異性和時序性。microRNA在細胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。目前研究microRNA的方法主要是RealtimePCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測序技術(shù)。miRNA合成RNA聚合酶II?初級miRNA（pri-miRNA）形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)核內(nèi)RNaseIII（Rnasen或Drosha）?miRNA前體（pre-miRNA）Exportin-5?運出細胞核胞質(zhì)RNaseIII（DICER）?miRNA雙鏈RISC打開雙鏈，其中一條RNA被降解成熟單鏈RNA（引導鏈）結(jié)合于argonautlncRNA長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類長度超過200個堿基的長鏈非編碼RNA分子。本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式調(diào)控基因的表達。參與X染色體失活，基因組印記以及染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄干擾，核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。RNA大小基因定位基因組成功能XIST19.3kbXq136個外顯子，32kbX失活調(diào)控因子TSIX37.0kbXq131個外顯子XIST的反義調(diào)控因子H192.3kb11p155個外顯子，2.67kb11p15印記簇印記，Beckwith-Wiedemann綜合征LIT159.5kb11p151個外顯子11p15印記簇反義調(diào)控因子PEG31.8kb19q13不超過9個外顯子，25kb母源印記，通過激活p53抑制腫瘤HOTAIR2.2kb12q136個外顯子，6.3kb抑制2q31HOX-D簇轉(zhuǎn)錄eRNA增強子RNA（enhancerRNA，eRNA）XIST

?X染色體失活HOX轉(zhuǎn)錄物反義RNA（HOXtranscriptantisenseRNA，HOTAIR）lincRNA長鏈基因間非編碼RNA（longintergenicnon-codingRNA，lincRNA）ceRNA競爭性內(nèi)源性RNA（competitiveendogenousRNA，ceRNA）分子海綿miRNA結(jié)合位點／miRNA反應元件（miRNAresponseelements，MRE）circRNA環(huán)形RNA（circularRNA，circRNA）分子海綿具有保守性以及組織特異性，不易被核酸酶裂解exRNA細胞外RNA（extracellularRNA，exRNA）／外泌體RNA（ExosomalRNA，exRNA）：mRNA、tRNA、miRNA、siRNA和lncRNA等疾病的生物標記數(shù)據(jù)庫描述URLNONCODE除rRNA和tRNA外所有ncRNA的整合數(shù)據(jù)庫非編碼RNA數(shù)據(jù)庫非編碼轉(zhuǎn)錄物序列和功能http://biobase.ibch.poznan.pl/ncRNARNAdb全部哺乳動物非編碼RNA數(shù)據(jù)庫.au/rnadb/Rfam非編碼RNA家族和序列比對http://rfam.sanger.ac.uk/antiCODE天然反義轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)庫sno/scaRNAbase小核仁RNA和小Cajal小體特異性RNA/snoRNAbase.nsfsnoRNA-LBME-db全部人snoRNAhttp://www-snorna.biotoul.fr/基因組tRNA數(shù)據(jù)庫全部tRNA序列/GtRNAdb/tRNA序列和tRNA基因序列匯編同名http://www.tRNA.uni-bayreuth.edmiRBasemiRNA序列和靶基因http://microrna.sanger.ac.uk/piRNAbank各種生物體已知piRNA序列和其他相關(guān)信息http://pirnabank.ibab.ac.in/2、轉(zhuǎn)錄組學研究方法轉(zhuǎn)錄組學（transcriptomics）：檢測某特定條件下基于全基因組的基因轉(zhuǎn)錄水平。又稱基因表達分析（geneexpressionprofiling）。以往轉(zhuǎn)錄組學研究方法：Sanger方法進行表達序列標簽（EST）文庫測序基因表達系列分析（SAGE）大規(guī)模平行信號測序（MPSS）目前，基于全基因組檢測RNA轉(zhuǎn)錄物：DNA微陣列（DNAmicroarray）高通量RNA測序（RNAsequencing）SAGE基因表達系列分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）cDNA→序列標簽→多連體（concatemer）→測序同時對數(shù)以千計的mRNA轉(zhuǎn)錄物進行分析能夠快速、全范圍提取生物體基因表達信息適于比較不同發(fā)育狀態(tài)或疾病狀態(tài)的基因表達MPSS大規(guī)模平行信號測序（MassivelyParallelSignatureSequencing，MPSS）一種基于磁珠（bead）和接頭（adaptor）連接和解碼的復雜技術(shù)，測定結(jié)果短，多用于轉(zhuǎn)錄組測序，測定基因表達量。DNA微陣列單鏈DNA探針與待檢核酸（目標）雜交DNA芯片（DNAchip）／基因芯片（genechip）探針可代表：全基因組單個染色體選定的基因組區(qū)域選定的編碼區(qū)探針探針（probe）：一段與目的基因或DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列。一般通過DNA克隆或化學方法合成，并標記。探針種類：DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。探針設計：具有目標序列特異性（specific）相似的溶解（復性）溫度一個完整的全基因組寡核苷酸微陣列可包含超過500,000個探針，代表30,000個基因標記標記方法：切口平移法隨機引物延伸法DNA末端標記法切口平移法隨機引物延伸法DNA末端標記法RNA標記芯片制備原位合成：原位光刻合成?Affymetrix（GeneChip）原位噴墨合成?Agilent（SurePrint）點樣：磁珠法

?Illumina（BeadChip）cDNA文庫cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄形成的互補DNA（cDNA）與適當載體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化宿主菌形成的重組DNA克隆群，即包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細胞的cDNA文庫。具有組織或細胞特異性。大多數(shù)應用微陣列的基因表達分析中，mRNA自細胞或組織中提取，然后作為模板應用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。通常在基因表達分子中，兩種或兩種以上來源的mRNA被比較，如疾病和正常組織，或生長于不同條件下的細胞。每種來源的cDNA通過在cDNA合成中摻入熒光標記的核苷酸，而被標記成不同的熒光：綠色熒光染料（Cy3）?正常（參考）樣本紅色熒光染料（Cy5）?待測樣本標記后，cDNA樣本混合，并與同一微陣列雜交相同條件下獨立制備重復樣本，并與不同微陣列雜交激光掃描儀檢測微陣列上各個探針池中Cy5和Cy3的強度；紅色（Cy5）和綠色（Cy3）熒光強度的比值提示兩種樣本中代表基因的相對表達水平。參考和待測樣本常反向標記，并與另一個微陣列雜交，以避免由于固有的和系列特異性差異引起的變異另有一些微陣列平臺中，來自參考和待測樣本的目標序列用相同的熒光染料標記，與不同微陣列雜交。實驗中矯正微陣列數(shù)據(jù)的方法：用不同條件下表達無差異基因（即管家基因）的熒光強度作為參考點包含與目標序列明顯不同的摻入對照序列，因而只能與相應的對照探針池結(jié)合依樣本中相對少數(shù)基因發(fā)生變化的假設，調(diào)整每個微陣列上所有基因的總熒光強度至相似值通過在兩種不同情況下比較每個基因的熒光強度，重復實驗取平均值，明確基因?qū)τ谀撤N特定生物學條件發(fā)生表達的變化。每個基因的原始熒光數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)化為比值，常表示為倍數(shù)變化：正值?待測樣本較參考樣本表達多負值?待測樣本相對參考樣本表達水平低數(shù)據(jù)常整理為基因簇，其在不同情況下或一段時間表達模式相似?預測產(chǎn)物在同一通路共同作用的基因。GeneChip（Affymetrix）采用寡核苷酸原位光刻合成專利技術(shù)，原位合成短探針（通常25mer長度）多位點設計（對一個基因轉(zhuǎn)錄本，設計多個探針，綜合起來評價檢測信號）?PM-MM探針方案HumanTranscriptomeArray2.0Affymetrix最高分辨率的基因芯片針對超過40,000個非編碼轉(zhuǎn)錄本的探針PM-MM探針方案芯片上的每一個基因或EST都是由一個或幾個探針組組成，每組探針組又由11-20對25mer的探針對組成，每探針對包括兩個探針池，其中一個是完全匹配（Perfect-Match，PM）的，另外一個是序列中間有一個堿基錯配的（Mis-match,MM）。BeadChip（Illumina）BeadArray技術(shù)是基于3微米大的硅珠，它們在光纖束或平面硅片的微孔中自我組裝，每個微珠上都覆蓋了特定寡核苷酸的幾十萬條拷貝，這些拷貝將作為捕獲序列。HumanHT-12v4ExpressionBeadChipIllumina最新的全基因組基因表達芯片覆蓋人類轉(zhuǎn)錄組中47,000多個轉(zhuǎn)錄本和已知剪接體SurePrint（Agilent）搭載SureScan技術(shù)。原位噴墨合成技術(shù)，芯片平臺穩(wěn)定性高，可大規(guī)模靈活地合成探針。60mer長探針，具有更高信噪比、靈敏度和特異性SurePrintG3人類基因表達芯片26,083EntrezGenes(unique)30,606lncRNA(unique)微陣列檢測的優(yōu)缺點：優(yōu)點?費用低、周轉(zhuǎn)時間快、對特殊設備需求低缺點?信號飽和所致動態(tài)范圍有限?需要事先明確待檢基因，不利于發(fā)現(xiàn)新注釋基因以及核酸水平的變異RNA-SeqRNA測序（RNAsequencing，RNA-Seq）用于分析持續(xù)變化的細胞轉(zhuǎn)錄組。有利于發(fā)現(xiàn)基因表達隨時間的變化，或不同組別或處理條件下基因表達的差異。除mRNA轉(zhuǎn)錄物外，還能檢測不同的RNA群，包括總RNA，小RNA，如miRNA、tRNA和核糖體分析。利用高通量測序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組，在全面快速得到基因表達譜變化的同時，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異，另外還可檢測低豐度轉(zhuǎn)錄本并發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄物。也可以用于確定外顯子/內(nèi)含子邊界，以及明確已注釋的基因5’和3'邊界。一個基因?多個蛋白多個啟動子至少一半基因有兩個或更多個選擇性啟動子可變剪接（alternativesplicing）幾乎見于所有基因RNA編輯（editing）選擇性啟動子不同調(diào)控元件?組織特異性、發(fā)育階段特異性不同功能的蛋白亞型選擇性剪接可引入終止密碼子、移碼或重要的翻譯后修飾位點，編碼決定細胞內(nèi)定位（可溶性或膜結(jié)合）的信號剪接增強子?結(jié)合SR（絲氨酸－精氨酸）蛋白剪接抑制子?結(jié)合hnRNP（異質(zhì)性核糖核蛋白）剪接可能具有組織特異性神經(jīng)元中選擇性剪接特別明顯許多廣泛表達的基因具有神經(jīng)元特異性剪接異構(gòu)體軸突蛋白3可編碼上千種蛋白RNA編輯轉(zhuǎn)錄后改變mRNA序列涉及原始轉(zhuǎn)錄物特定核苷酸的插入、缺失或修飾C?U編輯：人載脂蛋白APOBA?I編輯：Q／R編輯U?C編輯：Wilms瘤第6外顯子高通量測序擴增DNA的大規(guī)模平行測序（massivelyparallelsequencingofamplifiedDNA）?二代測序（next-generationsequencing，NGS）Roche?454Illumina?Solexa?HiSeq平臺AB?SOLiD454測序儀（Roche）經(jīng)微乳液PCR法擴增后，攜帶有大量模板分子的微珠被放置到芯片上的微孔中。隨后使用焦磷酸法測序，每一輪測序反應都會摻入一個核苷酸，隨后加入反應試劑熒光素和5’腺苷酰硫酸，這樣在每一個小孔中每當有聚合酶將核苷酸摻入時都會發(fā)光。最后用腺苷三磷酸雙磷酸酶洗滌去掉多余的核苷酸。SOLiD測序儀使用微乳液PCR法擴增模板片段，然后吸附有大量擴增片段的直徑1μm的磁珠被制成高密度測序芯片。接著使用連接酶而不是聚合酶測序法完成測序。每一次反應都會在引物末端加上一個熒光標記的8bp的探針，在探針中央的兩個堿基上（即雙堿基編碼技術(shù)）標記有熒光基團，探針被連接上之后發(fā)出熒光，隨后熒光基團部分（zzz）被切除，重新進行下一輪反應。經(jīng)過幾輪這樣的測序反應之后可得到一段不連續(xù)的堿基序列。然后變性去掉已被延伸的引物，重新結(jié)合上新的引物進行新一輪測序反應。Solexa測序儀（Illumina）采用可逆性末端邊合成邊測序反應。首先，在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭構(gòu)建文庫，文庫加載到測序芯片F(xiàn)lowcell上，文庫兩端的已知序列與Flowcell基底上的Oligo序列互補，每條文庫片段都經(jīng)過橋式PCR擴增形成一個簇。測序時采用邊合成邊測序反應，即在堿基延伸過程中，每個循環(huán)反應只能延伸一個正確互補的堿基，根據(jù)四種不同的熒光信號確認堿基種類，保證最終的核酸序列質(zhì)量，經(jīng)過多個循環(huán)后，完整讀取核酸序列。RNA測序流程：制備用于測序的互補DNA（cDNA）文庫：1、RNA分離：加入DNase，檢測RNA降解程度2、RNA選取/去除：用Poly(dT)寡核苷酸選取mRNA，去除rRNA（占細胞總RNA>80%）3、cDNA合成：反轉(zhuǎn)錄4、切割（fragment）至合適大小策略RNA類型rRNA含量未加工RNA含量基因組DNA含量分離方法總RNA全部高高高無選取PolyA編碼低低低用poly(dT)寡核苷酸雜交去除rRNA編碼、非編碼低高高去除與rRNA互補寡核苷酸RNA捕獲靶向低中等低用與目標轉(zhuǎn)錄物互補的探針雜交切割長RNA／cDNA分子?約200bp片段物理：噴霧法（nebulization）化學：金屬離子水解酶：受控的RNase消化cDNA片段的一端或兩端連接接頭，作為測序引物的結(jié)合位點，應用高通量測序方法對cDNA進行測序基因表達水平通過計數(shù)與一個基因內(nèi)每個核苷酸位置對應的讀數(shù)來確定，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄物長度取平均值轉(zhuǎn)錄組組裝

?將原始序列解讀為基因組特征：從頭（Denovo）測序無需參考基因組以重構(gòu)轉(zhuǎn)錄組通常在基因組未知、不完整或較參考明顯改變時應用基因組引導法比對覆蓋參考基因組中非連續(xù)部分的讀數(shù)非連續(xù)讀數(shù)由剪接轉(zhuǎn)錄物測序所致ncRNA測序基于理想大小范圍選取細胞RNA。RNA大小篩選：凝膠法、磁珠法或商品化試劑盒。分離后，在3’和5’末端加接頭，然后純化；最后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。轉(zhuǎn)錄組研究中，第二代測序技術(shù)的局限性：讀長過短；測序文庫需要進行擴增導致PCRartifacts，應用于RNA-seq則會造成組裝錯誤（如嵌合體）；轉(zhuǎn)錄物大多數(shù)為fragments；定量分析存在偏差。直接RNA測序單分子直接RNA測序（DirectRNASequencing，DRSTM）無需轉(zhuǎn)化為cNDA，連接或擴增，而直接進行RNA分子的大規(guī)模平行測序。單分子測序（single-moleculesequencing）?三代測序（third-generationsequencing，TGS）Helios?單分子測序（HeliScope）PacBio?單分子實時（singlemolecularrealtime，SMART）測序OxfordNanopore?納米孔測序（MinION）Thermo?離子激流（IonTorrent）HeliScope測序儀（HeliosBioScience）單核酸分子不經(jīng)擴增直接測序。將待測序列隨機切成小分子片段并在3'

末端加上poly(A)，并在poly(A)的末端進行熒光標記和阻斷。把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像，獲取已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點。加入聚合酶和被Cy3熒光標記脫氧核苷酸進行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點上是否有熒光信號。然后化學裂解核苷酸切除上面的染料，加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反應。SMRT技術(shù)（Pacific

Bioscience）利用零級波導（Zero-ModeWaveguide，ZMW）。被熒光標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標記），被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標記的磷酸集團被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖，進行下一個循環(huán)。MinION測序儀（OxfordNanopore）納米孔測序技術(shù)的基本原理：當DNA分子或者它的組成堿基從一個孔洞經(jīng)過時，檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測序技術(shù)以α-溶血素構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個系統(tǒng)被鑲嵌在一個脂雙分子層內(nèi)，脂雙分子層兩側(cè)為不同的鹽濃度，在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流，每個堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。很長的讀長，只有普通U盤大小，但錯誤率高。IonTorrent（ThermoFisher）在半導體芯片的微孔中的微球上固定DNA鏈，隨后依次摻入堿基，釋放出氫離子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到，繼而實時判讀堿基。硬件設備無需光學檢測和掃描系統(tǒng)，并且使用天然核苷酸和聚合酶、無需焦磷酸酶化學級聯(lián)，無需標記熒光染料和化學發(fā)光的配套試劑，因此測序成本低，其應用范圍涵蓋Sanger方法和已有高通量測序技術(shù)的應用。與二代測序儀比，三代測序儀的優(yōu)點：單分子測序，大大提高了樣本的通量和檢測的速度；不需要進行PCR擴增；RNA直接測序，大大降低了體外反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差；長片段測序。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)優(yōu)勢1、直接得到核酸序列信息，除了得到基因表達量的差異，更可以檢測RNA的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變異；

2、開放性的轉(zhuǎn)錄組分析：無需參考基因組信息，無需設計探針，不但能檢測已知基因還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄物；3、在測序覆蓋率足夠大時，能夠檢測到細胞中的低豐度轉(zhuǎn)錄物；

4、隨著測序深度的增加可以獲得更廣的動態(tài)檢測范圍，能夠同時鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本。RNA-Seq存在的問題1、特異性問題：RNA-Seq檢測不同細胞類型的總和單細胞測序

?研究單個細胞2、時間依賴：RNA-Seq僅檢測某個時間點時程實驗?觀察轉(zhuǎn)錄組的變化3、覆蓋率（深度）：RNA具有DNA上的相同突變明確各等位基因表達?印記、順式調(diào)控效應4、數(shù)據(jù)產(chǎn)生人為現(xiàn)象（技術(shù)方差）：試劑、人員、測序儀（Illumina、PacificBiosciences）設立對照組5、數(shù)據(jù)處理：一個人類RNA-Seq通常為1Gb數(shù)據(jù)壓縮、微陣列（假設驅(qū)動或重復研究）單細胞轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組學研究應用新的／選擇性表達定量分析轉(zhuǎn)錄組中核酸水平序列差異：isomiRs、SNVsSNVs用于分析腫瘤轉(zhuǎn)錄組健康個體SNVs與基因表達的對應MicroRNA用作生物標記：腫瘤中、循環(huán)血液中新的／選擇性表達定量分析選擇性表達（alternativelyexpressed，AE）指利用同樣的外顯子組合，剪接序列不同，或各個外顯子邊界不同，自一個基因座位產(chǎn)生不同的mRNA及不同蛋白質(zhì)。AE可通過使用選擇性剪接供體或受體位點，改變轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）或終止/多聚腺苷酸位點，或跳躍（去除）或引入潛在外顯子，而影響外顯子長度。正常細胞中，AE機制可從相同基因產(chǎn)生具有不同功能的蛋白質(zhì)。90-95%的多外顯子基因受AE影響。AE對于人類疾病非常重要，因為在一些疾病例如腫瘤中，疾病細胞產(chǎn)生不同于健康細胞的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。isomiR檢測利用轉(zhuǎn)錄組檢測核酸變異最早應用于miRNA-seq?“miRome”非常復雜microRNA變異（isomiR）?成熟的miRNA與已注釋miRNA相比具有單核苷酸序列變異新型RNA編輯？或miRNA基因多態(tài)性？SNVs檢測RNA-seq可檢測外顯子單核苷酸變異（singlenucleotidevariants，SNVs）正常組織中的多態(tài)性腫瘤中改變蛋白的突變SNVs用于分析腫瘤轉(zhuǎn)錄組RNA-seq能夠揭示代表腫瘤中體細胞突變的某特定等位基因是否在這些細胞中表達。對于攜帶雜合SNVs且能充分表達的基因，由于其兩個等位基因的相對表達水平都能被檢測，因此可以推斷調(diào)控區(qū)潛在的遺傳和表觀遺傳修飾效應。一項研究應用RNA-seq檢測鱗狀細胞癌和匹配正常組織中等位基因失衡（allelicimbalance，AI），結(jié)果顯示在腫瘤和配對的正常樣本之間數(shù)百個