轉(zhuǎn)錄組學(xué)及研究策略

轉(zhuǎn)錄組學(xué)及研究策略概述轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）：特定物種、組織或細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的所有RNA（轉(zhuǎn)錄物）的集合。包括：mRNA（messengerRNA）和非編碼RNA（non-codingRNA）通過比較轉(zhuǎn)錄組或基因表達(dá)譜以揭示生物學(xué)現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機(jī)制，是高通量組學(xué)研究的常用策略。本章內(nèi)容1、RNA基因2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法DNA微陣列（DNAmicroarray）RNA測序（RNA-Seq）3、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究應(yīng)用1、RNA基因RNA基因：產(chǎn)生非編碼RNA的基因。RNA種類大?。╪t）亞類/亞家族不同類型數(shù)目功能rRNA~120-500012S、16S各一個(gè)線粒體核糖體組分5S、5.8S、18S、28S各一個(gè)胞質(zhì)核糖體組分tRNA~70-80線粒體家族22編碼線粒體mRNA胞質(zhì)家族49編碼核基因產(chǎn)生的mRNAsnRNA~60-360剪接體家族9U1、U2、U4、U5和U6加工標(biāo)準(zhǔn)GU-AG內(nèi)含子；U4atac、U6atac、U11和U12加工罕見AU-AC內(nèi)含子非剪接體許多U7加工組蛋白3′mRNA；7SK通用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；Y家族參與染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖調(diào)控snoRNA~60-300C/D246rRNA成熟，2′-O-核糖甲基化H/ACA94rRNA成熟，假尿苷化scaRNA25核內(nèi)Cajal小體內(nèi)特定snRNA成熟RNA核糖核酸酶~260-3202RNaseP切割pre-tRNA；RNaseMRP切割核內(nèi)rRNA，參與啟動(dòng)mtRNADPH復(fù)制RNA種類大?。╪t）亞類/亞家族不同類型數(shù)目功能混雜小胞質(zhì)RNA~80-500BC2001神經(jīng)RNA調(diào)節(jié)樹突蛋白生物合成，源于Alu重復(fù)7SLRNA3信號識(shí)別顆粒（SRP）組分介導(dǎo)分泌蛋白插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔TERC（端粒酶RNA組分）1端粒酶組分，核糖核蛋白以TERC為模板合成端粒cDNAVaultRNA3胞質(zhì)VaultRNP組分，被認(rèn)為在抗藥中發(fā)揮作用YRNA460kD核糖核蛋白組分，激素自身免疫反應(yīng)重要靶點(diǎn)miRNA~22>70個(gè)家族~1000在基因調(diào)控中多種重要作用，特別是發(fā)育和癌癥piRNA~24-3189個(gè)獨(dú)立簇>15,000常源于重復(fù)，僅在生殖細(xì)胞中表達(dá)限制過量轉(zhuǎn)座子活性內(nèi)源性siRNA~21-22許多可能超過10,000常源于假基因、反向重復(fù)等，參與體細(xì)胞基因調(diào)控也可能調(diào)控一些轉(zhuǎn)座子lncRNA通常>1kb許多>3000調(diào)控基因表達(dá)，一些涉及單等位基因表達(dá)和反義調(diào)節(jié)因子rRNA核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）小亞基：18S大亞基：28S、5.8S和5S5SrRNA基因?250個(gè)基因28S、5.8S和18SrRNA?核仁組織區(qū)（NOR）近端著絲粒染色體（13、14、15、21和22）13kb多基因轉(zhuǎn)錄單位，串聯(lián)重復(fù)30-40次核糖體DNA（rDNA）tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA，tRNA）>500個(gè)細(xì)胞質(zhì)tRNA基因，49個(gè)家族snRNA小核RNA（smallnuclearRNA，snRNA）富含尿嘧啶（U），結(jié)合多種蛋白?snRNP剪接體（spliceosome）snRNA主要（GU-AG）剪接體?U1、U2、U4、U5和U6次要（AU-AC）剪接體?U11、U12、U4atac、U5和U6atac非剪接體snRNA：U1、U2、U7、7SKRNA和YRNAsnoRNA和scaRNA小核仁RNA（smallnucleolarRNA，snoRNA）位于核仁rRNA修飾小Cajal體RNA（smallCajalbodyRNA，scaRNA）又稱螺旋小體snRNA成熟piRNAPiwi蛋白相互作用RNA（Piwi-protein-interactingRNA，piRNA）24-31nt表達(dá)于哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞與piwi蛋白結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)座子（transposon）染色質(zhì)構(gòu)象（chromatinconfirmation）DNA甲基化（methylation）組蛋白修飾

?組蛋白密碼（histonecode）ATP-依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合體DNA甲基化?沉默表達(dá)甲基化檢測

?用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。1、亞硫酸氫鹽測序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化；2、甲基化特異性PCR（Methylation-specificPCR，MSP）設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR，通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化；3、高分辨率熔解曲線（High

ResolutionMelting，HRM）在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島，若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。組蛋白修飾染色質(zhì)構(gòu)象技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）染色質(zhì)構(gòu)象技術(shù)染色體構(gòu)象捕獲（chromosomeconformationcapture，3C，4C）endo-siRNA內(nèi)源性短干擾RNA（shortinterferingRNA，endo-siRNA）產(chǎn)生于假基因（pseudogene）轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)特異性基因沉默RNA干擾（RNAinterference，RNAi）保護(hù)細(xì)胞抵御病毒和轉(zhuǎn)座元件經(jīng)Dicer切割成短干擾RNA（siRNA），21bp結(jié)合Ago，其中一條鏈（隨從鏈）降解，另一條鏈（引導(dǎo)鏈）激活argonaut復(fù)合體，并與其互補(bǔ)的RNA結(jié)合RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合體（RITS）miRNA微RNA（microRNA，miRNA）是一類大小約為22個(gè)堿基的小RNA分子。通過與靶基因的mRNA序列3′-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。通過抑制蛋白質(zhì)的翻譯或降低mRNA的穩(wěn)定性，從而抑制靶基因的表達(dá)。microRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的microRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。microRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。目前研究microRNA的方法主要是RealtimePCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測序技術(shù)。miRNA合成RNA聚合酶II?初級miRNA（pri-miRNA）形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)核內(nèi)RNaseIII（Rnasen或Drosha）?miRNA前體（pre-miRNA）Exportin-5?運(yùn)出細(xì)胞核胞質(zhì)RNaseIII（DICER）?miRNA雙鏈RISC打開雙鏈，其中一條RNA被降解成熟單鏈RNA（引導(dǎo)鏈）結(jié)合于argonautlncRNA長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類長度超過200個(gè)堿基的長鏈非編碼RNA分子。本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式調(diào)控基因的表達(dá)。參與X染色體失活，基因組印記以及染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄干擾，核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。RNA大小基因定位基因組成功能XIST19.3kbXq136個(gè)外顯子，32kbX失活調(diào)控因子TSIX37.0kbXq131個(gè)外顯子XIST的反義調(diào)控因子H192.3kb11p155個(gè)外顯子，2.67kb11p15印記簇印記，Beckwith-Wiedemann綜合征LIT159.5kb11p151個(gè)外顯子11p15印記簇反義調(diào)控因子PEG31.8kb19q13不超過9個(gè)外顯子，25kb母源印記，通過激活p53抑制腫瘤HOTAIR2.2kb12q136個(gè)外顯子，6.3kb抑制2q31HOX-D簇轉(zhuǎn)錄eRNA增強(qiáng)子RNA（enhancerRNA，eRNA）XIST

?X染色體失活HOX轉(zhuǎn)錄物反義RNA（HOXtranscriptantisenseRNA，HOTAIR）lincRNA長鏈基因間非編碼RNA（longintergenicnon-codingRNA，lincRNA）ceRNA競爭性內(nèi)源性RNA（competitiveendogenousRNA，ceRNA）分子海綿miRNA結(jié)合位點(diǎn)／miRNA反應(yīng)元件（miRNAresponseelements，MRE）circRNA環(huán)形RNA（circularRNA，circRNA）分子海綿具有保守性以及組織特異性，不易被核酸酶裂解exRNA細(xì)胞外RNA（extracellularRNA，exRNA）／外泌體RNA（ExosomalRNA，exRNA）：mRNA、tRNA、miRNA、siRNA和lncRNA等疾病的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)庫描述URLNONCODE除rRNA和tRNA外所有ncRNA的整合數(shù)據(jù)庫非編碼RNA數(shù)據(jù)庫非編碼轉(zhuǎn)錄物序列和功能http://biobase.ibch.poznan.pl/ncRNARNAdb全部哺乳動(dòng)物非編碼RNA數(shù)據(jù)庫.au/rnadb/Rfam非編碼RNA家族和序列比對http://rfam.sanger.ac.uk/antiCODE天然反義轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)庫sno/scaRNAbase小核仁RNA和小Cajal小體特異性RNA/snoRNAbase.nsfsnoRNA-LBME-db全部人snoRNAhttp://www-snorna.biotoul.fr/基因組tRNA數(shù)據(jù)庫全部tRNA序列/GtRNAdb/tRNA序列和tRNA基因序列匯編同名http://www.tRNA.uni-bayreuth.edmiRBasemiRNA序列和靶基因http://microrna.sanger.ac.uk/piRNAbank各種生物體已知piRNA序列和其他相關(guān)信息http://pirnabank.ibab.ac.in/2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）：檢測某特定條件下基于全基因組的基因轉(zhuǎn)錄水平。又稱基因表達(dá)分析（geneexpressionprofiling）。以往轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法：Sanger方法進(jìn)行表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）文庫測序基因表達(dá)系列分析（SAGE）大規(guī)模平行信號測序（MPSS）目前，基于全基因組檢測RNA轉(zhuǎn)錄物：DNA微陣列（DNAmicroarray）高通量RNA測序（RNAsequencing）SAGE基因表達(dá)系列分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）cDNA→序列標(biāo)簽→多連體（concatemer）→測序同時(shí)對數(shù)以千計(jì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析能夠快速、全范圍提取生物體基因表達(dá)信息適于比較不同發(fā)育狀態(tài)或疾病狀態(tài)的基因表達(dá)MPSS大規(guī)模平行信號測序（MassivelyParallelSignatureSequencing，MPSS）一種基于磁珠（bead）和接頭（adaptor）連接和解碼的復(fù)雜技術(shù)，測定結(jié)果短，多用于轉(zhuǎn)錄組測序，測定基因表達(dá)量。DNA微陣列單鏈DNA探針與待檢核酸（目標(biāo)）雜交DNA芯片（DNAchip）／基因芯片（genechip）探針可代表：全基因組單個(gè)染色體選定的基因組區(qū)域選定的編碼區(qū)探針探針（probe）：一段與目的基因或DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列。一般通過DNA克隆或化學(xué)方法合成，并標(biāo)記。探針種類：DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。探針設(shè)計(jì)：具有目標(biāo)序列特異性（specific）相似的溶解（復(fù)性）溫度一個(gè)完整的全基因組寡核苷酸微陣列可包含超過500,000個(gè)探針，代表30,000個(gè)基因標(biāo)記標(biāo)記方法：切口平移法隨機(jī)引物延伸法DNA末端標(biāo)記法切口平移法隨機(jī)引物延伸法DNA末端標(biāo)記法RNA標(biāo)記芯片制備原位合成：原位光刻合成?Affymetrix（GeneChip）原位噴墨合成?Agilent（SurePrint）點(diǎn)樣：磁珠法

?Illumina（BeadChip）cDNA文庫cDNA文庫是以特定的組織或細(xì)胞mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA（cDNA）與適當(dāng)載體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化宿主菌形成的重組DNA克隆群，即包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫。具有組織或細(xì)胞特異性。大多數(shù)應(yīng)用微陣列的基因表達(dá)分析中，mRNA自細(xì)胞或組織中提取，然后作為模板應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。通常在基因表達(dá)分子中，兩種或兩種以上來源的mRNA被比較，如疾病和正常組織，或生長于不同條件下的細(xì)胞。每種來源的cDNA通過在cDNA合成中摻入熒光標(biāo)記的核苷酸，而被標(biāo)記成不同的熒光：綠色熒光染料（Cy3）?正常（參考）樣本紅色熒光染料（Cy5）?待測樣本標(biāo)記后，cDNA樣本混合，并與同一微陣列雜交相同條件下獨(dú)立制備重復(fù)樣本，并與不同微陣列雜交激光掃描儀檢測微陣列上各個(gè)探針池中Cy5和Cy3的強(qiáng)度；紅色（Cy5）和綠色（Cy3）熒光強(qiáng)度的比值提示兩種樣本中代表基因的相對表達(dá)水平。參考和待測樣本常反向標(biāo)記，并與另一個(gè)微陣列雜交，以避免由于固有的和系列特異性差異引起的變異另有一些微陣列平臺(tái)中，來自參考和待測樣本的目標(biāo)序列用相同的熒光染料標(biāo)記，與不同微陣列雜交。實(shí)驗(yàn)中矯正微陣列數(shù)據(jù)的方法：用不同條件下表達(dá)無差異基因（即管家基因）的熒光強(qiáng)度作為參考點(diǎn)包含與目標(biāo)序列明顯不同的摻入對照序列，因而只能與相應(yīng)的對照探針池結(jié)合依樣本中相對少數(shù)基因發(fā)生變化的假設(shè)，調(diào)整每個(gè)微陣列上所有基因的總熒光強(qiáng)度至相似值通過在兩種不同情況下比較每個(gè)基因的熒光強(qiáng)度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)取平均值，明確基因?qū)τ谀撤N特定生物學(xué)條件發(fā)生表達(dá)的變化。每個(gè)基因的原始熒光數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)化為比值，常表示為倍數(shù)變化：正值?待測樣本較參考樣本表達(dá)多負(fù)值?待測樣本相對參考樣本表達(dá)水平低數(shù)據(jù)常整理為基因簇，其在不同情況下或一段時(shí)間表達(dá)模式相似?預(yù)測產(chǎn)物在同一通路共同作用的基因。GeneChip（Affymetrix）采用寡核苷酸原位光刻合成專利技術(shù)，原位合成短探針（通常25mer長度）多位點(diǎn)設(shè)計(jì)（對一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本，設(shè)計(jì)多個(gè)探針，綜合起來評價(jià)檢測信號）?PM-MM探針方案HumanTranscriptomeArray2.0Affymetrix最高分辨率的基因芯片針對超過40,000個(gè)非編碼轉(zhuǎn)錄本的探針PM-MM探針方案芯片上的每一個(gè)基因或EST都是由一個(gè)或幾個(gè)探針組組成，每組探針組又由11-20對25mer的探針對組成，每探針對包括兩個(gè)探針池，其中一個(gè)是完全匹配（Perfect-Match，PM）的，另外一個(gè)是序列中間有一個(gè)堿基錯(cuò)配的（Mis-match,MM）。BeadChip（Illumina）BeadArray技術(shù)是基于3微米大的硅珠，它們在光纖束或平面硅片的微孔中自我組裝，每個(gè)微珠上都覆蓋了特定寡核苷酸的幾十萬條拷貝，這些拷貝將作為捕獲序列。HumanHT-12v4ExpressionBeadChipIllumina最新的全基因組基因表達(dá)芯片覆蓋人類轉(zhuǎn)錄組中47,000多個(gè)轉(zhuǎn)錄本和已知剪接體SurePrint（Agilent）搭載SureScan技術(shù)。原位噴墨合成技術(shù)，芯片平臺(tái)穩(wěn)定性高，可大規(guī)模靈活地合成探針。60mer長探針，具有更高信噪比、靈敏度和特異性SurePrintG3人類基因表達(dá)芯片26,083EntrezGenes(unique)30,606lncRNA(unique)微陣列檢測的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)?費(fèi)用低、周轉(zhuǎn)時(shí)間快、對特殊設(shè)備需求低缺點(diǎn)?信號飽和所致動(dòng)態(tài)范圍有限?需要事先明確待檢基因，不利于發(fā)現(xiàn)新注釋基因以及核酸水平的變異RNA-SeqRNA測序（RNAsequencing，RNA-Seq）用于分析持續(xù)變化的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。有利于發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化，或不同組別或處理?xiàng)l件下基因表達(dá)的差異。除mRNA轉(zhuǎn)錄物外，還能檢測不同的RNA群，包括總RNA，小RNA，如miRNA、tRNA和核糖體分析。利用高通量測序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組，在全面快速得到基因表達(dá)譜變化的同時(shí)，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異，另外還可檢測低豐度轉(zhuǎn)錄本并發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄物。也可以用于確定外顯子/內(nèi)含子邊界，以及明確已注釋的基因5’和3'邊界。一個(gè)基因?多個(gè)蛋白多個(gè)啟動(dòng)子至少一半基因有兩個(gè)或更多個(gè)選擇性啟動(dòng)子可變剪接（alternativesplicing）幾乎見于所有基因RNA編輯（editing）選擇性啟動(dòng)子不同調(diào)控元件?組織特異性、發(fā)育階段特異性不同功能的蛋白亞型選擇性剪接可引入終止密碼子、移碼或重要的翻譯后修飾位點(diǎn)，編碼決定細(xì)胞內(nèi)定位（可溶性或膜結(jié)合）的信號剪接增強(qiáng)子?結(jié)合SR（絲氨酸－精氨酸）蛋白剪接抑制子?結(jié)合hnRNP（異質(zhì)性核糖核蛋白）剪接可能具有組織特異性神經(jīng)元中選擇性剪接特別明顯許多廣泛表達(dá)的基因具有神經(jīng)元特異性剪接異構(gòu)體軸突蛋白3可編碼上千種蛋白R(shí)NA編輯轉(zhuǎn)錄后改變mRNA序列涉及原始轉(zhuǎn)錄物特定核苷酸的插入、缺失或修飾C?U編輯：人載脂蛋白APOBA?I編輯：Q／R編輯U?C編輯：Wilms瘤第6外顯子高通量測序擴(kuò)增DNA的大規(guī)模平行測序（massivelyparallelsequencingofamplifiedDNA）?二代測序（next-generationsequencing，NGS）Roche?454Illumina?Solexa?HiSeq平臺(tái)AB?SOLiD454測序儀（Roche）經(jīng)微乳液PCR法擴(kuò)增后，攜帶有大量模板分子的微珠被放置到芯片上的微孔中。隨后使用焦磷酸法測序，每一輪測序反應(yīng)都會(huì)摻入一個(gè)核苷酸，隨后加入反應(yīng)試劑熒光素和5’腺苷酰硫酸，這樣在每一個(gè)小孔中每當(dāng)有聚合酶將核苷酸摻入時(shí)都會(huì)發(fā)光。最后用腺苷三磷酸雙磷酸酶洗滌去掉多余的核苷酸。SOLiD測序儀使用微乳液PCR法擴(kuò)增模板片段，然后吸附有大量擴(kuò)增片段的直徑1μm的磁珠被制成高密度測序芯片。接著使用連接酶而不是聚合酶測序法完成測序。每一次反應(yīng)都會(huì)在引物末端加上一個(gè)熒光標(biāo)記的8bp的探針，在探針中央的兩個(gè)堿基上（即雙堿基編碼技術(shù)）標(biāo)記有熒光基團(tuán)，探針被連接上之后發(fā)出熒光，隨后熒光基團(tuán)部分（zzz）被切除，重新進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過幾輪這樣的測序反應(yīng)之后可得到一段不連續(xù)的堿基序列。然后變性去掉已被延伸的引物，重新結(jié)合上新的引物進(jìn)行新一輪測序反應(yīng)。Solexa測序儀（Illumina）采用可逆性末端邊合成邊測序反應(yīng)。首先，在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭構(gòu)建文庫，文庫加載到測序芯片F(xiàn)lowcell上，文庫兩端的已知序列與Flowcell基底上的Oligo序列互補(bǔ)，每條文庫片段都經(jīng)過橋式PCR擴(kuò)增形成一個(gè)簇。測序時(shí)采用邊合成邊測序反應(yīng)，即在堿基延伸過程中，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)只能延伸一個(gè)正確互補(bǔ)的堿基，根據(jù)四種不同的熒光信號確認(rèn)堿基種類，保證最終的核酸序列質(zhì)量，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后，完整讀取核酸序列。RNA測序流程：制備用于測序的互補(bǔ)DNA（cDNA）文庫：1、RNA分離：加入DNase，檢測RNA降解程度2、RNA選取/去除：用Poly(dT)寡核苷酸選取mRNA，去除rRNA（占細(xì)胞總RNA>80%）3、cDNA合成：反轉(zhuǎn)錄4、切割（fragment）至合適大小策略RNA類型rRNA含量未加工RNA含量基因組DNA含量分離方法總RNA全部高高高無選取PolyA編碼低低低用poly(dT)寡核苷酸雜交去除rRNA編碼、非編碼低高高去除與rRNA互補(bǔ)寡核苷酸RNA捕獲靶向低中等低用與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的探針雜交切割長RNA／cDNA分子?約200bp片段物理：噴霧法（nebulization）化學(xué)：金屬離子水解酶：受控的RNase消化cDNA片段的一端或兩端連接接頭，作為測序引物的結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用高通量測序方法對cDNA進(jìn)行測序基因表達(dá)水平通過計(jì)數(shù)與一個(gè)基因內(nèi)每個(gè)核苷酸位置對應(yīng)的讀數(shù)來確定，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄物長度取平均值轉(zhuǎn)錄組組裝

?將原始序列解讀為基因組特征：從頭（Denovo）測序無需參考基因組以重構(gòu)轉(zhuǎn)錄組通常在基因組未知、不完整或較參考明顯改變時(shí)應(yīng)用基因組引導(dǎo)法比對覆蓋參考基因組中非連續(xù)部分的讀數(shù)非連續(xù)讀數(shù)由剪接轉(zhuǎn)錄物測序所致ncRNA測序基于理想大小范圍選取細(xì)胞RNA。RNA大小篩選：凝膠法、磁珠法或商品化試劑盒。分離后，在3’和5’末端加接頭，然后純化；最后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。轉(zhuǎn)錄組研究中，第二代測序技術(shù)的局限性：讀長過短；測序文庫需要進(jìn)行擴(kuò)增導(dǎo)致PCRartifacts，應(yīng)用于RNA-seq則會(huì)造成組裝錯(cuò)誤（如嵌合體）；轉(zhuǎn)錄物大多數(shù)為fragments；定量分析存在偏差。直接RNA測序單分子直接RNA測序（DirectRNASequencing，DRSTM）無需轉(zhuǎn)化為cNDA，連接或擴(kuò)增，而直接進(jìn)行RNA分子的大規(guī)模平行測序。單分子測序（single-moleculesequencing）?三代測序（third-generationsequencing，TGS）Helios?單分子測序（HeliScope）PacBio?單分子實(shí)時(shí)（singlemolecularrealtime，SMART）測序OxfordNanopore?納米孔測序（MinION）Thermo?離子激流（IonTorrent）HeliScope測序儀（HeliosBioScience）單核酸分子不經(jīng)擴(kuò)增直接測序。將待測序列隨機(jī)切成小分子片段并在3'

末端加上poly(A)，并在poly(A)的末端進(jìn)行熒光標(biāo)記和阻斷。把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像，獲取已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點(diǎn)。加入聚合酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點(diǎn)上是否有熒光信號。然后化學(xué)裂解核苷酸切除上面的染料，加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。SMRT技術(shù)（Pacific

Bioscience）利用零級波導(dǎo)（Zero-ModeWaveguide，ZMW）。被熒光標(biāo)記磷酸集團(tuán)的核苷酸在聚合酶活性位點(diǎn)上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標(biāo)記），被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團(tuán)被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個(gè)位置，下一個(gè)脫氧核苷酸連接到位點(diǎn)上開始釋放熒光脈沖，進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。MinION測序儀（OxfordNanopore）納米孔測序技術(shù)的基本原理：當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一個(gè)孔洞經(jīng)過時(shí)，檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測序技術(shù)以α-溶血素構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個(gè)系統(tǒng)被鑲嵌在一個(gè)脂雙分子層內(nèi)，脂雙分子層兩側(cè)為不同的鹽濃度，在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流，每個(gè)堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。很長的讀長，只有普通U盤大小，但錯(cuò)誤率高。IonTorrent（ThermoFisher）在半導(dǎo)體芯片的微孔中的微球上固定DNA鏈，隨后依次摻入堿基，釋放出氫離子，在它們穿過每個(gè)孔底部時(shí)能被檢測到，繼而實(shí)時(shí)判讀堿基。硬件設(shè)備無需光學(xué)檢測和掃描系統(tǒng)，并且使用天然核苷酸和聚合酶、無需焦磷酸酶化學(xué)級聯(lián)，無需標(biāo)記熒光染料和化學(xué)發(fā)光的配套試劑，因此測序成本低，其應(yīng)用范圍涵蓋Sanger方法和已有高通量測序技術(shù)的應(yīng)用。與二代測序儀比，三代測序儀的優(yōu)點(diǎn)：單分子測序，大大提高了樣本的通量和檢測的速度；不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增；RNA直接測序，大大降低了體外反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差；長片段測序。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)優(yōu)勢1、直接得到核酸序列信息，除了得到基因表達(dá)量的差異，更可以檢測RNA的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變異；

2、開放性的轉(zhuǎn)錄組分析：無需參考基因組信息，無需設(shè)計(jì)探針，不但能檢測已知基因還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄物；3、在測序覆蓋率足夠大時(shí)，能夠檢測到細(xì)胞中的低豐度轉(zhuǎn)錄物；

4、隨著測序深度的增加可以獲得更廣的動(dòng)態(tài)檢測范圍，能夠同時(shí)鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本。RNA-Seq存在的問題1、特異性問題：RNA-Seq檢測不同細(xì)胞類型的總和單細(xì)胞測序

?研究單個(gè)細(xì)胞2、時(shí)間依賴：RNA-Seq僅檢測某個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)程實(shí)驗(yàn)?觀察轉(zhuǎn)錄組的變化3、覆蓋率（深度）：RNA具有DNA上的相同突變明確各等位基因表達(dá)?印記、順式調(diào)控效應(yīng)4、數(shù)據(jù)產(chǎn)生人為現(xiàn)象（技術(shù)方差）：試劑、人員、測序儀（Illumina、PacificBiosciences）設(shè)立對照組5、數(shù)據(jù)處理：一個(gè)人類RNA-Seq通常為1Gb數(shù)據(jù)壓縮、微陣列（假設(shè)驅(qū)動(dòng)或重復(fù)研究）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究應(yīng)用新的／選擇性表達(dá)定量分析轉(zhuǎn)錄組中核酸水平序列差異：isomiRs、SNVsSNVs用于分析腫瘤轉(zhuǎn)錄組健康個(gè)體SNVs與基因表達(dá)的對應(yīng)MicroRNA用作生物標(biāo)記：腫瘤中、循環(huán)血液中新的／選擇性表達(dá)定量分析選擇性表達(dá)（alternativelyexpressed，AE）指利用同樣的外顯子組合，剪接序列不同，或各個(gè)外顯子邊界不同，自一個(gè)基因座位產(chǎn)生不同的mRNA及不同蛋白質(zhì)。AE可通過使用選擇性剪接供體或受體位點(diǎn)，改變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）或終止/多聚腺苷酸位點(diǎn)，或跳躍（去除）或引入潛在外顯子，而影響外顯子長度。正常細(xì)胞中，AE機(jī)制可從相同基因產(chǎn)生具有不同功能的蛋白質(zhì)。90-95%的多外顯子基因受AE影響。AE對于人類疾病非常重要，因?yàn)樵谝恍┘膊±缒[瘤中，疾病細(xì)胞產(chǎn)生不同于健康細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。isomiR檢測利用轉(zhuǎn)錄組檢測核酸變異最早應(yīng)用于miRNA-seq?“miRome”非常復(fù)雜microRNA變異（isomiR）?成熟的miRNA與已注釋miRNA相比具有單核苷酸序列變異新型RNA編輯？或miRNA基因多態(tài)性？SNVs檢測RNA-seq可檢測外顯子單核苷酸變異（singlenucleotidevariants，SNVs）正常組織中的多態(tài)性腫瘤中改變蛋白的突變SNVs用于分析腫瘤轉(zhuǎn)錄組RNA-seq能夠揭示代表腫瘤中體細(xì)胞突變的某特定等位基因是否在這些細(xì)胞中表達(dá)。對于攜帶雜合SNVs且能充分表達(dá)的基因，由于其兩個(gè)等位基因的相對表達(dá)水平都能被檢測，因此可以推斷調(diào)控區(qū)潛在的遺傳和表觀遺傳修飾效應(yīng)。一項(xiàng)研究應(yīng)用RNA-seq檢測鱗狀細(xì)胞癌和匹配正常組織中等位基因失衡（allelicimbalance，AI），結(jié)果顯示在腫瘤和配對的正常樣本之間數(shù)百個(gè)